Summary
Nous rapportons ici, la localisation de l’immunofluorescence de dynamine pour illustrer les protocoles pour la détection des protéines dans les sections dans l’épididyme de paraffine souris et ceux d’une lignée de cellules épididymaires immortalisé (mECap18). Nous décrivons également les protocoles pour l’isolement des protéines sécrétoires du fluide épididymaire et milieux cellulaires conditionné.
Abstract
L’épididyme mammifères génère l’un des fluides intraluminal plus complexes de toute glande endocrine afin de favoriser la maturation post-testiculaire et le stockage des spermatozoïdes. Une telle complexité se pose en raison de l’activité combinée de sécrétion et d’absorption des paroi des cellules épithéliales. Nous décrivons ici les techniques pour l’analyse de la synthèse des protéines dans l’épididyme et de la sécrétion en mettant l’accent sur la famille de protéine modèle de dynamine (DNM) mechanoenzymes ; grand GTPases qui ont le potentiel pour réglementer les événements trafic bidirectionnel membrane. Pour l’étude de l’expression des protéines dans les tissus dans l’épididyme, nous décrivons une méthodologie robuste pour l’immunofluorescence étiquetage des protéines cibles dans les sections de paraffine et la détection ultérieure de la distribution spatiale de ces protéines via la microscopie en immunofluorescence. Nous décrivons également méthodologie optimisée pour l’isolement et la caractérisation de l’exosome comme des vésicules, appelée epididymosomes, qui sont sécrétés dans la lumière dans l’épididyme de participer à la communication intercellulaire avec la maturation des spermatozoïdes. Comme une approche complémentaire, nous décrivons également la détection par immunofluorescence des protéines cibles dans une lignée de cellules épithéliales dans l’épididyme (mECap18) souris SV40-immortalisé caput. En outre, nous discutons de l’utilité de la lignée cellulaire de mECap18 comme un modèle approprié in vitro permettant d’étudier la régulation de l’activité sécrétrice épididymaire. À cette fin, nous décrivons les exigences de culture pour le maintien de la lignée cellulaire de mECap18 et de l’utilisation des schémas d’inhibition pharmacologique sélective qui sont capables d’influer sur leur profil de protéine sécrétoire. Ces derniers sont facilement évalués par le biais de la cueillette de milieu de culture conditionné, la concentration des protéines sécrétées par l’intermédiaire de précipitation de l’acide trichloroacétique et d’acétone et leur analyse ultérieure par SDS-PAGE et immunoblotting. Nous croyons que ces méthodes combinées sont adaptés pour l’analyse des protéines épididymaires autres cibles comme un prélude à déterminer leur rôle fonctionnel dans la maturation des spermatozoïdes et/ou de stockage.
Introduction
Les spermatozoïdes de toutes les espèces mammifères acquièrent la possibilité d’afficher la motilité progressive vers l’avant et de féconder un ovule durant leur descente prolongée par le biais de l’épididyme, une région hautement spécialisée du système conduit extra testiculaire mâle, qui peut prendre de 7 à 14 jours pour naviguer (selon les espèces)1. En raison de l’extrême condensation de la chromatine paternelle et l’effusion de la majorité du cytoplasme qui accompagne la cytodifférenciation des spermatozoïdes dans les testicules, leur maturation fonctionnelle ultérieure est conduite exclusivement par leur interaction avec le microenvironnement dans l’épididyme. Ce milieu est, à son tour, créé par l’activité de sécrétion et d’absorption du soma épididymaire doublure et affiche un niveau exceptionnel de segment segment variante1. Ainsi, les segments plus actifs sur le plan de la synthèse des protéines et la sécrétion sont celles qui sont situées dans la partie proximale de l' épididyme (à savoir, le caput et corpus)2. Cette activité reflète le profil fonctionnel des spermatozoïdes, avec le début de premières cellules pour afficher les caractéristiques de compétence fonctionnelle (i.e., motilité progressive et la capacité de lier aux glycoprotéines acides solubilisée zona) suivant leur passage dans l' épididyme de caput3. Ces attributs fonctionnels continuent de développer avant d’atteindre un niveau optimal, comme les spermatozoïdes atteignent le segment distal dans l’épididyme (cauda), dans lequel ils sont stockés dans un état de repos dans la perspective de l’éjaculation. La formation et le maintien de ce réservoir de stockage de sperme est aussi intimement liée à l’épithélium de la muqueuse, qui dans la cauda est dominé par la forte activité absorbante4,5. Bien que les différences anatomiques ont été déclarés6,7,8, ce régionalisé division du travail semble être une caractéristique de l’épididyme qui est partagé par la majorité des espèces de mammifères étudiés à ce jour, y compris notre propre9,10. En effet, d’un point de vue clinique, il est connu que la dysfonction épididymaire apporte une contribution importante à l’étiologie du facteur masculin infertilité11, mettant ainsi en évidence l’importance de comprendre la régulation de ce tissu spécialisé.
Il est donc regrettable que notre compréhension de la physiologie dans l’épididyme et les mécanismes qui régulent les phases séquentielles de la maturation des spermatozoïdes et de stockage au sein de ce tissu, restent à être entièrement résolus. Parmi les facteurs contributifs, limitantes avancées de la recherche dans l’épididyme sont la complexité globale de ce tissu et la connaissance des mécanismes qui exercent un contrôle réglementaire sur son microenvironnement luminale. Anatomiquement, nous savons qu’au-delà de la distinction des segments caput, corpus et cauda, l’épididyme peut être subdivisé en plusieurs zones (Figure 1 a), chacune séparées par des septa12 et caractérisée par des profils distincts de gènes/protéines expression13,14,15,16,17,18. En effet, sur la base de profilage détaillées transcriptionnelle segmentaire d’expression de gène dans l’épididyme, comme 6 et 9 zones épididymaires distinctes ont été signalés dans les modèles de souris et le rat, respectivement19,20. Une telle complexité sans doute reflète la composition de l’épididyme soma, un épithélium pseudostratifié comprenant de nombreux types de cellules différents ; chaque diffèrent en ce qui concerne leurs activités d’abondance, la distribution et sécrétoire/absorption le long des voies. Ainsi, les cellules principales sont de loin le plus abondant des cellules épididymaires type constituant plus de 80 % de toutes les cellules épithéliales. En conséquence, cellules principales sont responsables de la majeure partie des protéines épididymaires la biosynthèse et la sécrétion5. En revanche, la population de cellules claires, qui comptent comme le type de cellule deuxième plus abondant dans le soma épididymaire, est principalement liée à l’absorption sélective des composants luminales et l’acidification de ce micro-environnement5. Ajoutant une autre couche de complexité, androgènes et autres facteurs de lumicrine d’origine testiculaire exercent un contrôle différencié sur chacun de ces types de cellules épididymaires selon leur positionnement le long du tractus.
Malgré les limitations imposées par une telle complexité, des percées significatives continuent d’être déployés en résoudre la base mécaniste de la fonction épididymaire. Des clés de ces études a été l’application de stratégies avancées spectrométrie de masse à établir des inventaires à grande échelle du protéome dans l’épididyme, en tandem avec des analyses détaillées des protéines individuelles choisis parmi ces enquêtes initiales. Une illustration de cette approche est notre caractérisation récente de la famille DNM de mechanoenzymes dans la souris modèle21. Notre intérêt initial en DNM a été alimentée par sa double action dans l’accouplement d’exo - et processus de l’endocytose. S’appuyant sur ces observations, nous avons pu démontrer que les trois isoformes canoniques de DNM (DNM1 - DNM3) sont fortement exprimés dans l’épididyme de souris et convenablement positionnés pour s’acquitter des rôles régulateurs dans la sécrétion de protéines et l’absorption21 . En outre, nous avons pu clairement différencier chaque isoforme DNM sur la base de leur localisation cellulaire et subcellulaire, suggérant ainsi qu’ils possèdent complémentaires, par opposition aux activités redondantes, au sein de l' épithélium épididymaire21.
Nous décrivons ici la méthodologie expérimentale employée pour l’étude de l’expression DNM dans l’épididyme de souris avec l’espoir que cette information va trouver une application plus large dans la caractérisation de protéines épididymaires alternatifs et ainsi contribuer à notre compréhension de la fonction de cet élément important du système reproducteur masculin. Plus précisément, nous décrivons l’élaboration d’une méthodologie robuste pour l’immunofluorescence étiquetage des protéines cibles dans les sections épididymaires paraffine et la détection ultérieure de la distribution spatiale de ces protéines par immunofluorescence microscopie. On trouvera plus loin nos protocoles récemment optimisé22 pour l’isolement et la caractérisation des epididymosomes ; petites vésicules exosome-like qui constituent des éléments essentiels du profil épididymaire sécrétoire et semblent tenir un rôle important dans la promotion de maturation des spermatozoïdes23. Comme une approche complémentaire, nous décrivons également la détection par immunofluorescence des protéines cibles dans une lignée de cellules immortalisées souris caput épithélium épididymaire (mECap18) et l’utilisation de cette ressource comme un modèle pour explorer la régulation de l’épididyme in vitrode l’activité sécrétoire.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales portant sur la collection de tissus d’origine animale ont été approuvés par de l’Université de Newcastle et protection des animaux et Comité d’éthique.
1. immunofluorescence souillant des Sections paraffine dans l’épididyme (Figures 1 et 2)
- Immédiatement après l’euthanasie de souris adultes par inhalation de CO2 (souris Swiss, âgé de plus de 8 semaines), soigneusement disséquer l’épididyme (à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux) recouvrant de tissu conjonctif et graisse et s’immerger dans le fixateur de Bouin solution (> poids volume/tissu dix fois) pour la fixation au jour le jour.
- Laver le tissu avec l’éthanol à 70 % avec 2 × changements par jour pendant 2 jours et puis déshydrater par graduée éthanol (70 %, 95 % et 100 %) en vue de l’infiltration et l’incorporation dans un bloc de paraffine.
- Les blocs de paraffine sur une épaisseur de 4-6 µm et monter sur les diapositives en préparation pour immunofluorescence souillant l’article.
- Sous une hotte, déparaffinage les sections de paraffine épididymaire en ajoutant une quantité suffisante de xylène dans le récipient de diapositive pour immerger complètement la section tissulaire (3 × 5 min chaque fois).
- Réhydrater les sections de tissu par l’immersion dans des solutions graduées éthanol dilué dans purifiée H2O (100 % éthanol 5 min, 100 % éthanol 5 min, 90 % éthanol 1 min, 1 min, éthanol à 70 % éthanol à 80 % 1 min et 50 % d’éthanol 1 min).
- Laver les sections dans un bocal de glisser une fois pendant 5 min avec du sérum physiologique tamponné au phosphate suffisante (PBS) à immerger complètement la section tissus ensemble (suivez ces instructions pour tous les lavages ultérieurs).
- Décanter la solution de l’antigène approprié (i.e., 10 mmol/L sodium citrate, 50 mmol/L de Tris pH 10,5 ou solutions de récupération antigène alternative, selon l’antigène à détecter) dans une grille coulissante et micro-ondes jusqu'à ébullition. Plonger les lames dans cette solution et sous réserve des coupes de tissus conditions de récupération de chaleur induite par l’antigène optimisées pour chaque anticorps (voir tableau 1).
ATTENTION : Veiller à ce que les lames sont complètement immergés dans la solution de l’antigène au cours du processus de récupération de l’antigène. - Retirez le récipient de diapositive du micro-ondes et refroidir à température ambiante.
- Rincer les lames avec du PBS et utiliser un marqueur liquide hydrofuge diapositive à tracer autour de la section de tissu.
- Déposer les lames dans un conteneur humidifié (créé par un tissu humidifié à la base du récipient) et d’appliquer la solution de saturation (3 % BSA/PBS, préalablement filtré à travers un filtre de 0,45 µm) pendant 1 h à 37 ° C.
- Rincer les lames une fois avec du PBS.
- Incuber les sections avec l’anticorps primaire approprié diluée à une concentration expérimentalement optimisée dans filtrée 1 % BSA/PBS à 4 ° C durant la nuit (1/60 pour anti-DNM1, DNM2 et DNM3 des anticorps ; 1/100 pour les anticorps anti-ATP6V1B1, voir Table des matières pour les détails d’anticorps).
Remarque : Pour distinguer spécifiques de liaison de l’anticorps non spécifiques, il est nécessaire d’inclure les résultats négatifs sévères (i.e., anticorps secondaire primaire, seul anticorps preabsorbed contre la vaccination peptidique) et les témoins positifs24. - Réchauffer les diapositives en plaçant à température ambiante pendant 30 min.
- Laver le × diapositives 3 avec du PBS sur une plate-forme vibrante (60 t/mn) pour 10 min chacun.
- Incuber les sections avec des anticorps secondaire approprié, dilué à 1 % BSA/PBS (filtré par un filtre de 0,45 µm) à 37 ° C pendant 1 h (dilution 1 : 400 pour tous les anticorps secondaires, voir la Table des matières anticorps).
ATTENTION : Garder le conteneur de la diapositive dans le noir de cette étape à partir. Pour l’étiquetage double, choisir une combinaison compatible d’anticorps secondaires (i.e., Anticorps secondaires doivent ont été soulevées dans différentes espèces). - Laver le × diapositives 3 avec du PBS sur une plate-forme vibrante (60 t/mn) pour 10 min chacun.
- Contre-coloration les sections avec l’iodure de propidium (PI, 7.48 μmol/L) ou 4΄, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 4,37 μmol/L) pendant 2 min à température ambiante pour étiqueter le noyau de la cellule.
- Laver les lames deux fois avec du PBS sur une plateforme vibrante (60 t/mn) de 5 min chacun.
- Monter les sections 10 % Mowiol 4-88 préparé dans une solution de glycérol à 30 % à 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) et 2,5 % 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-indice d’octane.
- Sceller la lamelle avec du vernis à ongles et stocker les lames à 4 ° C pour l’observation future.
ATTENTION : Il est recommandé d’effectuer l’imagerie des diapositives aussitôt que possible après la préparation pour éviter la perte excessive de la fluorescence.
2 isolation des Epididymosomes partir de l’épididyme Caput de souris (Figure 3)
- Immédiatement après l’euthanasie de souris adultes par inhalation de CO2 (souris Swiss âgé de plus de 8 semaines), perfuse leur vascularisation avec du PBS (préchauffée à 37 ° C) pour minimiser la contamination du sang des tissus dans l’épididyme.
ATTENTION : le plasma sanguin contient diverses populations d’exosomes, qui sont de taille semblable à epididymosomes25. L’efficacité d’habilitation de sang provenant de tissus dans l’épididyme sont accessibles par l’intermédiaire de l’inspection du segment initial, un segment fortement vascularisé épididymaire situé proximal au segment caput (i.e., zone 1 dans la Figure 1 a) - Disséquer attentivement l’épididyme libre de graisse sus-jacente et du tissu conjonctif et rinçage avec le milieu modifié Biggers, Whitten et Whittingham (BWW ; pH 7,4, osmolalité de 300 mmol/kg eau26,27) afin de réduire tout risque de surface contamination du sang.
- Épongez le tissu dans l’épididyme pour retirer les excès médiatique, disséquer l’épididyme caput (i.e., zones 2-5 dans la Figure 1 a) et le transfert à une boîte de Pétri fraîches (35 x 10 mm) contenant le support BWW. S’assurer que la quantité de médium est suffisante pour le rétablissement final.
Remarque : Pour 6 caput épididymes, il est recommandé d’utiliser 1,1 mL du milieu afin de permettre une reprise de ~ 900 µL, qui est ensuite uniformément répartis et appliqué au sommet des 2 gradients préparés à l’avance (voir étape 2,9). - Faire un certain nombre de petites incisions dans le tissu de caput avec une lame de rasoir. Ne pas découper le tissu et ainsi éviter la contamination de l’échantillon avec contenu cytosolique excessive. Incuber la plaque contenant le tissu avec une légère agitation à 37 ° C pendant 30 min libérer le contenu luminal.
- Filtrer la suspension obtenue par le biais de 70 µm membranes pour éliminer les débris cellulaires.
- Recueillir le filtrat et ceci sous réserve des étapes successives de centrifugation à 4 ° C, avec une augmentation de la vitesse afin d’éliminer les débris cellulaires (i.e., × 500 g, 2 000 × g, 4 000 × g, 8 000 × g, 5 min chacun ; 17 000 x g pendant 20 min et enfin 17 000 × g pour une supplémentaire de 10 min ou jusqu'à ce qu’aucune granule n’est formé après centrifugation).
ATTENTION : Il est important d’évaluer la couleur de la pastille après la première étape de centrifugation 500 × g pour contamination minime de sang soit présente. Jeter tous les échantillons dans lesquels ce pellet affiche une coloration rose. - Préparer des gradients d’iodixanol discontinu (formée de 40 %, 20 %, 10 %, 5 % couches) en diluant un milieu de gradient de densité (composée de 60 % (p/v) iodixanol aqueuse) avec une solution de saccharose 0.25 de mol/L et 10 mmol/L Tris (pH 7.5).
- Préparer le gradient dans un tube ultracentrifugeuse (11 × 35 mm), avec chacune des fractions de 450 µL (Figure 3). Inspecter visuellement le dégradé après l’application de chacune des fractions à veiller à ce que les interfaces sont correctement formés entre chaque couche avant le chargement de l’échantillon de fluide épididymaire. Préparer chaque frais dégradé le jour d’utilisation, cependant, l’échantillon de fluide épididymaire luminal peut être conservé à 4 ° C pendant 2 h avant l’embarquement.
- Ajouter avec précaution 450 µL d’épididymaire luminale suspension fluide (correspondant à la matière recueillie de la caput de 3 épididymes) au sommet d’un dégradé simple.
- Ultracentrifugeuse les gradients à 160 000 × g à 4 ° C pendant 18 heures.
ATTENTION : Puisque cette centrifugation est réalisée à très haute vitesse, tous les tubes ultracentrifugeuse doivent être jumelés et équilibrés avec précision. Vérifier les tubes pour s’assurer qu’ils sont exempts de signes visibles de dommages susceptibles de compromettre leur intégrité. - Retirer délicatement les 12 fractions égales (chacun composé de 185 µL) à partir de la couche superficielle et progressant vers le bas de la pente. Mettre en commun les fractions équivalentes extraite chaque dégradé, le cas échéant (jusqu'à deux gradients).
Remarque : La souris epididymosomes sont plus fortement enrichi en fractions 9-11,22, voir Figure 4 et Discussion. - Après la récupération et la mise en commun des fractions 9 – 11, diluer dans 2 mL de PBS et ultracentrifugeuse les échantillons à 100 000 × g à 4 ° C pendant 3 h (tube à 56 mm à × 13) pour granuler l’epididymosomes.
ATTENTION : Puisque le culot d’epididymosome peut être difficile à voir, faire en sorte que l’orientation des tubes est remarquée qu’ils sont placés dans le rotor et marquent le tube pour indiquer la position future de la pastille d’epididymosome. S’assurer que chaque tube contienne un volume suffisant (i.e., dépassant 50 % de sa capacité totale) pour exclure le risque d’effondrement du tube. - Aspirer avec précaution et éliminer le liquide surnageant sans déranger le culot d’epididymosome.
- Évaluer la pureté de l’epididymosome (Figure 4).
- Resuspendre le culot d’epididymosome dans un milieu désiré selon l’ou les applications en aval. Par exemple, BWW milieu est généralement utilisé pour les expériences impliquant la collaboration d’incubation avec spermatozoïdes ou, alternativement, un tampon de lyse appropriées en vue de la résolution du protéome épididymaire par SDS-PAGE.
3. immunofluorescence souillant des cellules mECap18
- Préparation de lamelles stérile (doit être effectuée sous une hotte de culture cellulaire)
- Faire tremper les lamelles couvre-objet (12 × 12 mm) dans l’éthanol à 70 % pendant 10 min et désinfecter par séchage à haute température au-dessus d’une lampe à l’éthanol.
- Cool la lamelle pour 10 s avant de les transférer sur une plaque bien 12.
- Appliquer une solution stérile de la poly-L-lysine pour couvrir la lamelle couvre-objet et se contenter de 10 min à température ambiante.
- Jeter la solution de la poly-L-lysine et rincer la lamelle avec stérile H2O ou échéant moyen.
- Cellules de mECap18 de préparation
- Passage les aliquotes de 2 × 105 mECap18 cellules dans chaque puits de la plaque bien 12 contenant les lamelles couvre-objet.
- Les cellules avec mECap18 cellule moyenne (DMEM additionné de 1 % L-glutamine, pyruvate de sodium 1 %, 1 % pénicilline/streptomycine et 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 μmol/L) contenant 10 % sérum de veau fœtal (SVF) dans un incubateur à 37 ° C sous une atmosphère de 5 % de la culture CO2 pendant la nuit.
- Une fois que les cellules adhèrent à la lamelle, jetez le milieu et rincer les cellules deux fois avec du PBS.
- Ajouter une quantité suffisante de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) diluée dans du PBS à immerger la lamelle entière et fixer les cellules à température ambiante pendant 15 min.
- Jetez la solution PFA et rincez les lamelles deux fois dans du PBS.
- Immunofluorescence souillant
- Permeabilize des cellules mECap18 par immersion dans 0,1 % Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min.
- Rincer les lamelles couvre-objet avec du PBS.
- Bloquer des cellules mECap18 avec 3 % de BSA et procéder à l’immunomarquage des cellules utilisant des protocoles équivalentes à celles décrites pour les coupes de tissus dans l’épididyme.
4. isolement des protéines du milieu de Culture cellulaire conditionné
- Collection de milieu de culture cellulaire conditionné
- Passage des parties aliquotes de 4 × 105 mECap18 cellules dans chaque puits de 6 plaque bien avec un milieu cellulaire mECap18 additionné de 10 % FBS pendant 24 h.
- Laver mECap18 cellules trois fois avec un milieu cellulaire mECap18 (préparé sans FBS) pour supprimer la FBS résiduel et ses associés contaminants de protéine.
- Ajouter 1,5 mL de milieu de cellules mECap18 (préparé sans FBS) dans chaque puits et incuber les cellules mECap18 pendant 12 h dans un incubateur à 37° C moins de 5 % de CO2.
Remarque : les cellules mECap18 à cette étape peuvent être évaluées pour les antigènes cibles différentes selon la conception expérimentale. - Après 12 heures d’incubation, recueillir le milieu cellulaire et centrifuger à 2 000 × g pendant 10 min enlever tous les débris cellulaires.
Remarque : La durée d’incubation peut être modifiée conformément à l’évaluation de la conception expérimentale/point de terminaison et en tenant compte de la tolérance de la cellule aux traitements appliqués. Il est recommandé d’adapter le calendrier d’incubation basée sur des schémas expérimentaux spécifiques pour s’assurer que les résultats optimaux sont obtenus. - Évaluer la viabilité des cellules mECap18 via l’application d’une norme bleu de trypan exclusion test28. Jeter tous les matériaux dont la viabilité cellulaire a diminué inférieur à 90 % pour éliminer les biais introduits par les protéines libérées des cellules morts ou moribonds.
- Isoler des protéines du milieu cellulaire comme suit ou préserver un milieu à-80 ° C.
- Isolement des protéines (qui se déroulera en une hotte aspirante)
- Ajouter 20 % du volume de l’acide trichloroacétique réfrigérés 100 % à 80 % du volume d’un milieu cellulaire conditionné à précipiter les protéines libérées des cellules cultivées mECap18. Incuber à 4 ° C durant la nuit avec un mélange constant.
- Après l’incubation, pellets protéine précipitée par centrifugation (17, 000 × g, 4 ° C pendant 10 min).
Remarque : Étant donné le nombre limité de protéines censées être sécrétée dans le milieu, il est possible que le culot ne va pas être visualisé facilement après centrifugation. Il est donc impératif de bien orienter le tube avant la centrifugation et prendre soin de ne pas pour déranger l’emplacement pellet femmes enceintes au moment du retrait du liquide surnageant. - Jeter le surnageant et laver le culot deux fois avec de l’acétone refroidi avant la ré-centrifugation (17, 000 × g, 4 ° C pendant 10 min).
- Soigneusement, enlever et jeter le surnageant avant séchage à l’air toute acétone résiduel dans une hotte aspirante.
- Resuspendre le culot de protéine dans une mémoire tampon d’extraction approprié en préparation pour l’analyse du point de terminaison détecter les profils de protéine sécrétoire complète et/ou protéines cibles individuelles (p. ex.., SDS-PAGE, immunoblotting).
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Representative Results
Figure 1 et Figure 2 montrent des résultats représentatifs de la localisation d’immunofluorescence de DNM dans l’épididyme de caput de souris. Chacun des trois isoformes DNM étudié les profils d’affichage localisation distincte. Ainsi, DNM1 est caractérisée par un marquage diffus relativement modeste des cellules épididymaires tout au long de l’épididyme de segment et caput initiale (Figure 2 a). En revanche, l’isoforme DNM2 a été tout d’abord détecté à proximité de la frontière adverse de basale et apicale des cellules dans le segment initial, avant d’être repositionné au domaine supranucléaire dans les cellules au sein du segment adjacent habitant en aval (i.e., zones 2-5) (Figure 1B, C). Notamment, cependant, l’intensité de DNM2 progressivement l’étiquetage diminue entre les zones 2 à 5 de l’épididyme de caput, un résultat qui reflète essentiellement l’activité sécrétoire de ces segments épididymaire21 (Figure 1B, C). En conséquence, l’étiquetage supranucléaire de DNM2 a été montré par la suite pour correspondre à la distribution de l’appareil de Golgi dans les cellules principales de caput21. Isolé de la même région épididymaire de spermatozoïdes a montré l’étiquetage acrosomique intense à DNM2 (Figure 1). Comme une mise en garde, toutefois, équivalent DNM2 étiquetage a été pas systématiquement détectée sur luminales spermatozoïdes au sein de nos sections de tissu. Ce phénomène est celui que nous avons rencontrés à plusieurs reprises lors de l’application d’une gamme d’anticorps ciblant des antigènes différents/spermatozoïdes dans l’épididyme et se pose sans doute en raison de problèmes liés à la présentation des antigènes ou masquage dans le sections de tissu de paraffine. Dans tous les cas, ces différences mettent l’accent sur l’importance d’effectuer l’étiquetage par immunofluorescence parallèle des spermatozoïdes isolés aux côtés de celui de l’épididyme tissu lui-même. La différence à la fois DNM1 et DNM2, l’isoforme DNM3 détecta principalement dans le domaine apical d’un petit nombre de cellules épithéliales caput (Figure 2B, les flèches vertes), qui se sont avérés correspondent à la sous-population de cellules claires par co marquage avec le marqueur reconnu à cellules claires, ATP6V1B1 (Figure 2 b, flèches rouges). De manière similaire, marqueurs représentatifs qui se sont avérées appropriés permettant de différencier les types de cellules épithéliales épididymaires différents sont résumées dans le tableau 229,30,31 , 32 , 33 , 34.
Outre la description des techniques pour la localisation sous-cellulaire des protéines résidant au sein de l’épithélium épididymaire, ici, nous présentons aussi nos protocoles récemment optimisés pour l’étude des protéines sécrétoires encapsulés au sein epididymosomes, petites vésicules extracellulaires qui représentent une composante importante du milieu luminale responsable du soutien sperm maturation et stockage de22. Combiné, étape 2 et Figure 3 fournissent détaillé étape par étape de la méthodologie utilisée pour l’isolement des populations fortement enrichies d’epididymosomes de tissu dans l’épididyme de souris caput. Notamment, cependant, ces méthodes sont facilement applicables pour l’isolement des populations remplaçante d’epididymosomes provenant de segments épididymaires plus distaux. En raison du risque de contamination de ces échantillons, nous avons également décrit les protocoles de caractérisation rigoureuse que nous employons systématiquement pour chaque préparation d’epididymosome. Il s’agit de l’évaluation de la taille et l’hétérogénéité des populations epididymosome utilisant la microscopie à haute résolution et des techniques de diffusion dynamique de la lumière. Parallèlement, nous utilisons également immunoblotting stratégies visant à évaluer l’enrichissement des marqueurs de vésicules extracellulaires reconnus et l’absence de correspondant des protéines qui sont caractéristiques des contaminants potentiels (i.e., anti-hémoglobine (HBB) comme un marqueur de contamination sanguine et anti-arachidonate 15-lipoxygénase (ALOX15) et les anticorps anti-IZUMO1 comme des marqueurs de gouttelettes cytoplasmiques et contamination de sperme, respectivement)22. Bien que nous avons trouvé que les contaminants sont rares, lorsqu’elles se produisent, nous jeter immédiatement la préparation d’epididymosome.
La localisation de non-cumul des isoformes de DNM dans l’épididyme caput a incité un complément d’enquête sur leur rôle potentiel dans la régulation du microenvironnement dans l’épididyme. À cette fin, une lignée de cellules immortalisées mECap18 fut utilisée comme un modèle in vitro pour étudier l’activité sécrétrice des cellules épididymaires. La caractérisation précédente de cette lignée cellulaire a montré qu’il abrite une population de cellules mixtes, qui tache positive pour les deux marqueurs de cellules principales ou clair. En outre, les cellules mECap18 se sont également révélés adaptés aux rapports physiologiques profils d’expression de gènes et des protéines épididymaire sous différentes en vitro traitement schémas35. Avant utilisation, localisation DNM a été évaluée dans des cellules cultivées mECap18 en réglant ces sur la poly-L-lysine traitée lamelles couvre-objet (Figure 5 a) et en les soumettant à une détection par immunofluorescence. En accord avec les patrons de distribution enregistrés dans des sections de tissu épididymaire caput, DNM1 a été détecté dans tout le cytoplasme des cellules mECap18, tandis que DNM2 était concentrée au sein du domaine supranucléaire de ces cellules et DNM3 se caractérisait par discret foyers de membrane coloration dans un certain nombre de petite sous-population (i.e., 11 %) des cellules mECap18 qui ont été ATP6V1B1 positif (Figure 5 b). Ces données confirment l’utilité de la lignée cellulaire de mECap18 comme une ressource précieuse pour enquêter sur le rôle du DNM dans la régulation de l’activité sécrétoire/absorption des cellules épididymaires.
En conséquence, étape 4 décrit la méthodologie pour l’analyse de l’activité sécrétrice des cellules mECap18 ; les techniques qui sont largement susceptibles d’évaluer l’impact d’une gamme de différentes conditions expérimentales. Dans notre étude, nous avons appliqué des interventions pharmacologiques sélectives pour réprimer l’activité de DNM1 et DNM2 avant la visualisation et la quantification du profil des protéines libérées des cellules mECap18 en moyenne conditionnée21. Un aspect important de cette analyse, cependant, était à faire en sorte que les cellules mECap18 ont été soigneusement lavés et cultivés en l’absence de supplémentation de FBS. Alors qu’une telle mesure est indispensable pour empêcher la contamination du milieu conditionné avec des protéines dérivées de FBS, il porte néanmoins le risque de répercussions négatives sur la croissance des cellules mECap18 ou viabilité. En tenant compte de cette possibilité, nous avons constaté que la lignée de cellules mECap18 toléré culture libre FBS et l’introduction des inhibiteurs de la DNM pendant la durée de notre fenêtre d’incubation (i.e., 12 h). En effet, pendant ce temps, la viabilité cellulaire est resté supérieur à 90 % dans toutes les répliques expérimentales. Cette approche pourrait donc servir une stratégie de validation utile pour identifier la fonction des protéines épididymaires spécifiques avant de s’engager à l’investissement dans les stratégies de manipulation génétique.
| Solution de démasquage induite par la chaleur | citrate de sodium 10 mmol/L | 50 mmol/L Tris (pH 10,5) |
| Temps | 3 min | 3 min |
| 6 min | 6 min | |
| 9 min | 9 min | |
| 12 min | 12 min |
Tableau 1 : Conditions générales pour l’optimisation de la recherche d’antigène induite par la chaleur pour l’utilisation avec des sections dans l’épididyme paraffine. Le processus de fixation peut être problématique épitopes différents nécessitent souvent l’emploi de techniques différentes de fixation, nécessitant ainsi que la méthodologie est optimisée pour chaque antigène.
| Type de cellules épithéliales | Distribution | Marqueur | Références (PMID) |
| Cellule principale | Toute épididyme | AQP9 | 11027599, 17360690 |
| Cellules claires | Caput, corpus et cauda | V-ATPases, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
| Carcinome baso-cellulaire | Toute épididyme | CLDN1 | 11159859, 21441423 |
| Cellule étroite | Segment initial | V-ATPases, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
Tableau 2 : Marqueurs représentant appropriés pour la détection de types cellulaires épithéliales primaires épididymaire.
Figure 1 : l’expression spatiale de DNM 2 dans l’épididyme de souris proximale. (A) modèle schématique de l’épididyme dépeignant le partitionnement sur l’épididyme de souris en 10 zones physiquement séparés septa, tel que rapporté par Turner et collègues20. Dans ce modèle, zone 1 correspond à la phase initiale, 2-5 les zones correspondent à l’épididyme de caput, zones 6 et 7 correspondent à l’épididyme de corpus et zones 8-10 représentent l’épididyme cauda. (B-C) Localisation d’immunofluorescence de DNM2 a révélé les patrons de distribution de zone spécifique (indiqués par la flèche et pointe de flèche blanche). La frontière entre les zones 1 et 2 est délimitée par une ligne pointillée ou indiquée par les flèches jaunes. (D) DNM2 s’exprime également dans le domaine de peri-acrosomique des spermatozoïdes prélevés de l’épididyme caput. Cependant, aucune coloration a été détectée systématiquement en spermatozoïdes luminales au sein des sections correspondantes dans l’épididyme. EP, cellules épithéliales ; l, lumen ; GNA, contrôle seul anticorps secondaire. Des expériences ont été répliqués sur le matériel des trois animaux et immunofluorescence représentant les images sont présentées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : détection par Immunofluorescence de DNM 1et 3 DNM dans l’épididyme de caput souris. (A) la localisation des DNM136 a été examinée dans l’épididyme de caput de souris. (B) co-localisation des DNM336 et le marqueur de cellules claires, ATP6V1B137 dans l’épididyme de caput de souris. Cette analyse a confirmé que les deux DNM3 (vert flèches) et ATP6V1B1 (flèches rouges) résident dans la sous-population de cellules claires mais affiche un chevauchement minimal subcellulaire. EP, cellules épithéliales ; int, interstitium ; l, lumen ; SP, sperme ; GNA, contrôle seul anticorps secondaire. Noyaux cellulaires ont été Eosine au DAPI (bleu). Des expériences ont été répliqués sur le matériel des trois animaux et immunofluorescence représentant les images sont présentées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : schéma des protocoles d’isolement utilisées pour l’enrichissement de souris caput epididymosomes. Après la dissection, caput tissu épididymaire est plongé dans une goutte de médium BWW et incisé pour libérer le contenu luminal. Le fluide luminal est ensuite filtré à travers une membrane µm 70 et la suspension obtenue est centrifugée à augmenter la vitesse pour les débris de cellules résiduelles de granule. La suspension dégagée est ensuite chargée au sommet d’un gradient de densité discontinu (solution iodixanol) et soumise à ultracentrifugation durant la nuit. Epididymosomes partition en fractions 9-11, où sont regroupés, lavés par dilution dans PBS et retourné à l’ultracentrifugeuse pour granuler l’epididymosomes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : évaluation de la pureté epididymosome. Douze fractions égales ont été récupérées après l’ultracentrifugation du dégradé et une partie aliquote de chaque protéine (A) à l’intention et quantification de RNA, (B) taille large évaluation de l’hétérogénéité en utilisant la diffusion dynamique de la lumière et (C). immunobuvardage de distribution marqueur epididymosome. Une caractérisation plus poussée étapes incluses (D) double marquage d’epididymosomes concentrée sur des billes de latex aldéhyde/sulfate, évaluation de microscopie électronique à transmission (E) et (F) immunoblot évaluation des spermatozoïdes (Sperme) et la contamination des globules rouges (RBC) en utilisant des anti-arachidonate 15-lipoxygénase (ALOX15, la présence de gouttelettes cytoplasmiques/sperme) ou anti-hémoglobine (HBB, contamination RBC). Immuno-blot ont été également sondés avec cargaison epididymosome connus (sous-unité régulatrice de la non-ATPase protéasome 26 s 7, PSMD7 ; membre bêta heat shock protéines 90kDa 1, HSP90B1 ; et beta tubuline, TUBB). Ces données ont été initialement publiées dans des rapports scientifiques (PMID : 27549865) et ont été reproduites avec la permission de l’éditeur Springer Nature. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : détection par Immunofluorescence des isoformes de la DNM mECap18 cellules révèlent distribution patterns cet accord avec celles détectées dans les tissus épididymaire caput. (A) schéma de préparation de la lamelle couvre-objet pour culture cellulaire mECap18 stérile. (B) les images d’immunofluorescence représentatif de DNM coloration des patrons de distribution cellulaire révélée (flèches et inset (double marquage de DNM3 et de marqueur de cellules claires ATP6V1B1)) qui en sens inverse de celles détectées au sein des sections de tissu dans l’épididyme. Noyaux cellulaires ont été Eosine avec l’iodure de propidium (PI ; rouge) ou DAPI (bleu). Des expériences ont été répliqués sur le matériel des trois animaux et immunofluorescence représentant les images sont présentées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ces études incorporé l’utilisation de tissu épididymaire fixe de Bouin, qui avait été soumis à l’enrobage de paraffine et de protocoles standard de l’amputation. Solution de fixation de Bouin comprend un mélange de formaldéhyde, l’acide picrique et l’acide acétique, chaque composant ayant une fonction spécifique et complémentaire. Ainsi, formaldéhyde réagit avec les amines primaires pour former des liaisons transversales des protéines, acide picrique pénètre lentement le tissu formant des sels et donc la coagulation des protéines basiques et à l’inverse, l’acide acétique rapidement pénètre les tissus et provoque la coagulation de acides nucléiques. Ces propriétés combinées ont engendré de Bouin comme fixateur de choix pour la préservation des détails morphologiques et son utilisation est largement rapportée dans la littérature dans l’épididyme. Cependant, solution de Bouin n’est pas sans ses limites, qui comprennent la propension pour la fluorescence induite fixateur et de formaldéhyde induite par réticulation qui peut masquer des antigènes cibles.
Le potentiel de la fluorescence de fond nécessite l’utilisation rigoureuses témoins négatifs, qui dans nos études comprennent l’omission de l’anticorps primaire, l’omission de l’anticorps secondaire et, où les réactifs sont disponibles, l’utilisation d’anticorps primaires preabsorbed contre le peptide immunisant d'où ils ont été générés. Détails de l’application de ces contrôles sont illustrés dans notre précédente étude d’expression DNM dynamine dans l' épididyme de souris21. Idéalement, ces résultats doivent également être validées grâce à l’utilisation de tissus provenant d’animaux knock-out, cependant, ce matériel n’est pas toujours facilement accessible. En cherchant à faire face au problème secondaire des antigènes cibles réticulé ou modifiés chimiquement, il est souvent nécessaire d’effectuer une forme de recherche d’antigène pour démasquer les épitopes altérés par la fixation et ainsi restaurer leur potentiel pour les anticorps liaison. La méthodologie utilisée pour la récupération dépend de nombreuses variables, y compris l’antigène cible, anticorps, type de tissu et la méthode de fixation. Cependant, les techniques les plus largement adoptés disposent de l’application d’une recherche d’antigène induit protéolytique ou induite par la chaleur. Les anciennes caractéristiques que notre approche favorisée en raison d’un taux de succès plus élevé pour la restauration de l’immunoréactivité, avec les détails des schémas de chaleur et des solutions de récupération que nous utilisons couramment documenté dans le tableau 1. Précisons toutefois qu’il s’agit en aucun cas une liste exhaustive et finalement l’optimisation de la recherche d’antigène pour chaque combinaison de protéine cible/anticorps requiert des études préliminaires à l’aide d’une matrice des combinaisons temps, température et pH. Considérations supplémentaires comprennent le potentiel de récupération de chaleur provoquer des dommages aux tissus et/ou provoquer étiquetage artéfactuelles. Ainsi, outre l’application des contrôles négatifs décrits ci-dessus, nous intégrons aussi régulièrement les témoins positifs avec des anticorps, comme anti-Golgin-97, qui reconnaissent les organites cellulaires distincts.
En cherchant à établir si protéines tels que ceux appartenant à la famille DNM remplissent redondants, par opposition aux fonctions complémentaires, dans le tissu dans l’épididyme, nous l’avons trouvée particulièrement instructive pour effectuer des expériences de marquage doubles telles que celles illustré à la Figure 2 b. Cette stratégie consiste à étiquetage séquentiel des coupes de tissus avec des paires d’anticorps primaires (déclenchés chez différentes espèces) suivis des anticorps secondaires appropriés fluorophores conjugués aux différents. Cependant, une caractéristique confondant qui surgit parfois en cherchant à effectuer ces études doubles étiquetage est l’incompatibilité entre les protocoles de récupération d’antigène nécessaire pour un marquage optimal avec chaque anticorps primaire. Cette limitation a été rencontrée dans le cas de co marquage de DNM 2 et Golgin-97 dans l’épididyme de souris caput, qui nous conduit à utiliser des coupes sériées consécutives (par opposition à la même section)21. Néanmoins, ou l’autre de ces approches sont extrêmement utiles dans le cadre de l’attribution d’expression de la protéine à un type de cellule en particulier parmi ceux qui sont représentés dans l’épithélium pseudostratifié épididymaire. Avec cet objectif à l’esprit, nous avons inclus une liste de marqueurs du type cellulaire représentatives et leurs patrons de distribution signalés le long du tubule épididymaire (tableau 2). Lorsque l'on souhaite aller au-delà de type cellulaire et commencer à explorer la distribution subcellulaire des protéines cibles, l’utilisation de double marquage avec des marqueurs de l’organite reconnus, tels que Golgin-97, offre des avantages distincts. Sinon, l’application de la microscopie à haute résolution en tandem avec l’immunomarquage demeure la méthode de choix pour la localisation ultrastructurale détaillée et la validation de la coloration des motifs obtenus à l’aide d’immunofluorescence21 .
Parmi les limites posées par l’étude des epididymosomes sont leur petite taille et la difficulté d’obtenir des quantités suffisantes pour les analyses détaillées de point final, en particulier en couramment utilisé des espèces de laboratoire tels que la souris. Cependant, en capitalisant sur le pionnier dans l’étude de Sullivan et collègues38,39,40, nous avons été en mesure d’optimiser la méthodologie robuste pour l’isolement de l’epididymosome de la souris modèle (voir étape 2). Nous souligner, cependant, la nécessité d’imposer des contrôles très stricts à évaluer et les caractéristiques physiques des populations enrichi epididymosome41 en raison de la contamination potentielle des spermatozoïdes, gouttelettes cytoplasmiques et/ou les exosomes véhiculés par le sang ( Voir Figure 4). Pour ce faire, nous utilisons systématiquement une combinaison de : microscopie électronique (i) haute résolution pour visualiser la taille et l’hétérogénéité de la préparation d’epididymosome, (ii) le calcul de la moyenne des particules taille et hétérogénéité (iii) la concentration de la epididymosomes sur 4 billes de latex aldéhyde/sulfate µm et marquage fluorescent de reconnu exosome marqueurs de surface, y compris la CD9 et FLOT1, et (iv) immunoblotting d’epididymosomes isolé avec une suite d’anticorps recommandés pour expérimental validation des exosomes (e.g., anti-CD9, anti-FLOT1), aussi bien que négatifs contrôles correspondant aux antigènes qui devraient se limiter aux spermatozoïdes (anti-IZUMO1), gouttelettes cytoplasmique de spermatozoïdes (anti-ALOX15) ou du sang (anti-HBB)22. Si ces normes sont respectées, alors les préparatifs d’epididymosome isolés se prêtent facilement destiné aux applications en aval, y compris les co d’incubation avec spermatozoïdes et/ou fret profilage analyse22,42, qui sont des approches puissants pour améliorer notre compréhension du rôle d’epididymosomes dans la régulation de la maturation des spermatozoïdes dans l’épididyme1.
Dans cette étude, nous décrivons l’application d’une lignée de cellules épithéliales épididymaires (mECap18) des caput du SV40-immortalisé souris, dont nous avons utilisé pour étudier l’implication du DNM dans la régulation de l’activité sécrétrice épididymaire21 ainsi que l’impact de environnementaux produits toxiques sur la physiologie épididymaire43. Une caractéristique importante de la lignée cellulaire de mECap18 est qu’il affiche une stabilité phénotypique entre les passages et une population représentative de ces deux cellules principales et claire21,35,44. Par rapport aux cultures de cellules épididymaires primaire, la lignée cellulaire de mECap18 affiche également la tolérance à la culture en sérum de veau foetal moyen gratuit, ce qui prolonge la durée et la nature des interventions expérimentales de ces cellules peut être exposé, c’est aussi permissive de récupérer une plus grande abondance de protéines sécrétées de milieu conditionné. Une limitation de la lignée de cellules mECap18, cependant, est qu’il a été immortalisé et peut donc réagir différemment au stress et / ou stimulations immunitaires contre que de cellules primaires cultures ou ces cellules présentent in vivo. Cette limitation à l’esprit, il est recommandé de comparer les résultats obtenus avec des cellules mECap18 en vivo réponses chaque fois que possible. En résumé, les protocoles, que les auteurs décrivent mettent en évidence l’utilité de cette lignée cellulaire comme un outil permettant de commencer à étudier la fonctionnalité des protéines cibles dans l’épididyme de caput. En effet, en combinaison avec l’utilisation d’inhibiteurs de la protéine commercial et/ou d’outils d’édition du génome (par exemple CRISPR-Cas9), la lignée de cellules mECap18 recèle un potentiel considérable pour aider à résoudre la base mécaniste de la fonction épididymaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimerait la National Health and Medical Research Conseil de projet Australie Grant APP1103176 pour la prise en charge de ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
References
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