Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Analyse af epididymis proteinsyntese og sekretion

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/58308
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 2,4, 1,2
1Priority Research Centre for Reproductive Science, School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Hunter Medical Research Institute, 3Department of Physiology, Turku Center for Disease Modeling, Institute of Biomedicine, University of Turku, 4School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle

Summary

Her rapporterer vi immunofluorescens lokalisering af dynamin til at illustrere protokollerne til påvisning af proteiner i paraffin-embedded mus epididymis sektioner og dem af en udødeliggjort epididymis cellelinje (mECap18). Vi beskriver også protokollerne til isolering af sekretoriske proteiner fra både epididymis væske og konditioneret celle medier.

Abstract

Pattedyr epididymis genererer en af de mest komplekse intraluminal væsker af en endokrin kirtel støtte post testikel modning og opbevaring af sædceller. Sådan kompleksitet opstår på grund af den kombinerede sekretoriske og lydabsorberende aktivitet af epitelceller foring. Her, beskriver vi teknikker til analyse af epididymis proteinsyntese og sekretion af fokus på familien model protein af dynamin (DNM) mechanoenzymes; store GTPases, der har potentiale til at regulere bi-directional membran menneskehandel begivenheder. Til undersøgelse af protein udtryk i epididymis væv beskriver vi robust metode til immunofluorescens mærkning af target proteiner i paraffin-embedded sektioner og den efterfølgende opdagelse af den geografiske fordeling af disse proteiner via immunfluorescens mikroskopi. Vi beskriver også optimeret metoder til isolering og karakterisering af exosome som blærer, kendt som epididymosomes, som udskilles i epididymis lumen til at deltage i intercellulær kommunikation med modning sædceller. Som en supplerende tilgang beskrive vi også immunofluorescens påvisning af target proteiner i cellelinie en SV40-udødeliggjort mus caput epididymis epitel (mECap18). Desuden diskuterer vi nytte af mECap18 cellelinje som egnede in vitro- model til at undersøge regulering af epididymis sekretoriske aktivitet. Til dette formål beskriver vi dyrkningsbaserede kravene til vedligeholdelse af mECap18-cellelinie og anvendelse af selektive farmakologisk hæmning regimer, der er i stand til at påvirke deres sekretoriske proteiner profil. Sidstnævnte er let vurderet via høst af konditioneret næringssubstrat, koncentration af udskilles proteiner via trichloreddikesyre/acetone nedbør og deres efterfølgende analyse via SDS-PAGE og immunoblotting. Vi hævder, at disse kombinerede metoder er velegnet til analyse af alternative epididymis protein mål som en optakt til bestemmelse af deres funktionelle rolle i sæd modning og/eller opbevaring.

Introduction

Sædcellerne af alle pattedyrarter erhverve potentiale til at vise frem progressive motilitet og befrugter en ægcelle under deres langvarig nedstigning gennem epididymis, et højt specialiseret område af den mandlige ekstra testikel kanalsystemet, som kan tage 7-14 dage til at navigere (afhængigt af arter)1. På grund af den ekstreme kondensering af den faderlige kromatin og afgivelse af størstedelen af cytoplasma, der ledsager cytodifferentiation af sædceller i testiklerne, er deres efterfølgende funktionelle modning drevet udelukkende af deres interaktion med den epididymis mikromiljø. Dette miljø er til gengæld lavet af sekretoriske og lydabsorberende aktiviteten af foring epididymis soma og viser en ekstraordinær grad af segment-segment variation1. Således, de mest aktive segmenter i form af proteinsyntese og sekretion er dem, der ligger i den proksimale del af bitestiklen (nemlig caput og corpus)2. Denne aktivitet afspejler den funktionelle profil af sædceller, med celler først begynder at vise kendetegnende for funktionel kompetence (dvs., progressive motilitet og evnen til at binde til syre-solubilized zona glykoproteiner) følgende deres passage gennem caput epididymis3. Disse funktionelle attributter fortsætte med at udvikle før at nå optimale niveauer, som sæden nå den distale epididymis segment (cauda), hvori de er gemt i en inaktiv tilstand i beredskab til sædafgang. Dannelsen og vedligeholdelse af denne sæd opbevaring reservoir er også nært knyttet til foring epitel, som i cauda er domineret af stærkt absorberende aktivitet4,5. Selv om anatomiske forskelle har været rapporteret6,7,8, synes sådan regionaliseret arbejdsdeling at være karakteristisk for epididymis, der er delt blandt fleste pattedyr arter studerede til dato, herunder vores egen9,10. Faktisk, fra et klinisk perspektiv, er det kendt, at epididymis dysfunktion er et vigtigt bidrag til ætiologien af mandlige faktor barnløshed11, hvilket understreger vigtigheden af at forstå reguleringen af denne specialiserede væv.

Det er derfor beklageligt, at vores forståelse af epididymis fysiologi, og de mekanismer, der regulerer de fortløbende faser af sperm modning og opbevaring i dette væv, mangler for at blive helt løst. Blandt de medvirkende faktorer er begrænsende fremskridt i epididymis forskning den samlede kompleksitet af dette væv og viden om de mekanismer, der udøver regulerende kontrol over sin luminale mikromiljø. Anatomisk, ved vi, at ud over skelnen af caput, corpus og cauda segmenter, epididymis kan yderligere opdeles i flere zoner (figur 1A), hver adskilt af septa12 og karakteriseret ved diskrete profiler af gen/protein udtrykket13,14,15,16,17,18. Ja, på grundlag af detaljerede transcriptional profilering af segmental genekspression i epididymis, så mange som 6 og 9 forskellige epididymis zoner er blevet rapporteret i mus og rotter-modeller, henholdsvis19,20. Sådan kompleksitet formentlig afspejler sammensætningen af de epididymis soma, en pseudostratified epitel, der består af mange forskellige celletyper; hver forskellige med hensyn til deres overflod, distribution og sekretoriske/lydabsorberende aktiviteter langs længden af tarmkanalen. Principal celler er således langt den mest rigelige epididymis celle type udgør op mod 80% af alle epitelceller. I overensstemmelse hermed, principal celler er ansvarlige for størstedelen af epididymis protein biosyntese og sekretion5. Derimod er klart celle befolkning, der rangerer som den anden mest rigelige celletype i epididymis soma, primært involveret i selektive absorption af luminale komponenter og forsuring af denne mikromiljø5. Tilføje endnu et lag af kompleksitet, udøve androgener og andre lumicrine faktorer testikel hjemlandene differentieret kontrol over hver af disse epididymis celletyper alt efter deres placering langs tarmkanalen.

Trods de begrænsninger af sådanne kompleksitet fortsat betydelige indhug gøres til løse mekanistiske grundlaget for epididymis funktion. En nøgle til disse undersøgelser har været anvendelsen af avancerede massespektrometri strategier at etablere brede skala opgørelser af epididymis proteomet, sammen med detaljerede analyser af individuelle proteiner udvalgt blandt disse indledende undersøgelser. En illustration af denne tilgang er vores seneste karakterisering af DNM familie af mechanoenzymes i mus model21. Vores indledende interesse i DNM blev næret af dets dual action i koblingen af exo- og endocytotic processer. Med udgangspunkt i disse observationer, var vi i stand til at demonstrere at de tre kanoniske isoformer af DNM (DNM1 - DNM3) er stærkt udtrykt i mus epididymis og korrekt placeret for at opfylde lovgivningsmæssige roller i protein sekretion og absorption21 . Desuden, vi har kunnet skelne klart mellem hver DNM isoform på grundlag af deres cellulære og subcellulære lokalisering, hvilket tyder på at de besidder supplerer hinanden, i stedet for redundant, aktivitet inden for epididymis epitel21.

Her beskriver vi de eksperimentelle metodologi til undersøgelse af DNM udtryk i mus epididymis med håbet om, at disse oplysninger vil finde større anvendelse i karakterisering af alternative epididymis proteiner og dermed bidrage til vores forståelsen af funktionen af denne vigtige del af den mandlige forplantningskanal. Specifikt, beskriver vi udviklingen af robust metode til immunofluorescens mærkning af target proteiner i paraffin-embedded epididymis sektioner og den efterfølgende opdagelse af den geografiske fordeling af disse proteiner via immunfluorescens mikroskopi. Vi yderligere dokumentere vores seneste optimerede protokoller22 til isolering og karakterisering af epididymosomes; lille exosome-lignende blærer, der udgør centrale elementer i epididymis sekretoriske profilen og synes at holde en fremtrædende rolle i at fremme sædceller modning23. Som en supplerende tilgang beskrive vi også immunofluorescens påvisning af target proteiner i cellelinie en udødeliggjort mus caput epididymis epitel (mECap18) og anvendelsen af denne ressource som en model til at undersøge regulering af epididymis sekretoriske aktivitet in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer, der involverer dyrs væv samling blev godkendt af University of Newcastle Animal Care og etiske komité.

1. immunofluorescens farvning af Paraffin-embedded epididymis sektioner (figur 1 og 2)

  1. Umiddelbart efter eutanasi af voksen mus via CO2 inhalation (schweiziske mus, over 8 uger gammel), omhyggeligt dissekere epididymis (ved hjælp af kirurgiske saks og pincet) fri af overliggende bindevæv og fedt og fordybe i Bouins fiksativ løsning (> 10 gange volumen/væv vægt) for natten fiksering.
  2. Vaske væv med 70% ethanol med 2 × ændringer dagligt i 2 dage og derefter dehydrere gennem sorterede ethanol (70%, 95% og 100%) som forberedelse til infiltration og indkapslet i en paraffin blok.
  3. Afsnit paraffinblokke på en tykkelse på 4-6 µm og mount på dias i forberedelse til immunofluorescens farvning.
  4. I et stinkskab, afvoksning epididymis paraffin sektioner ved at tilføje en tilstrækkelig mængde xylen til dias krukke til helt fordybe afsnittet væv (3 × 5 min hver gang).
  5. Rehydrere afsnittene væv ved nedsænkning i sorterede ethanol løsninger fortyndet i renset H2O (100% ethanol 5 min, 100% ethanol 5 min., 90% ethanol 1 min, 80% ethanol 1 min, 70% ethanol 1 min og 50% ethanol 1 min).
  6. Vaske sektioner i en slide jar én gang for 5 min med tilstrækkelig fosfatbufferet saltopløsning (PBS) at helt fordybe afsnittet hele væv (Følg disse retninger for alle efterfølgende vasker).
  7. Dekanteres passende antigen hentning løsning (dvs., 10 mmol/L natriumcitrat, 50 mmol/L Tris pH 10.5 eller alternative antigen hentning løsninger, afhængigt af antigen skal påvises) til et dias rack og mikroovn indtil kogende. Fordyb diassene i denne løsning og væv sektioner på varme-induceret antigen hentning vilkår optimeret til individuelle antistoffer (Se tabel 1).
    Forsigtig: Sikre, at diasene fuldt nedsænket i antigen hentning løsning under processen til hentning over antigen.
  8. Fjerne objektbeholderen dias fra mikrobølgeovn og afkøles til stuetemperatur.
  9. Skyl dias med PBS og bruge en væskeafvisende dias tusch at spore omkring afsnittet væv.
  10. Objektglassene i befugtet beholder (lavet af en fugtet væv i bunden af beholderen), og anvende blokerende løsning (3% BSA/PBS, tidligere filtreres gennem et 0,45 µm filter) i 1 time ved 37 ° C.
  11. Skyl dias engang med PBS.
  12. Inkuber afsnittene med passende primære antistof fortyndet til et eksperimentelt optimeret koncentration i filtreret 1% BSA/PBS ved 4 ° C natten over (1:60 for anti-DNM1, DNM2 og DNM3 antistoffer; 1: 100 for anti-ATP6V1B1 antistof, se tabel af materialer for antistof detaljer).
    Bemærk: for at skelne specifikke fra ikke-specifikke antistof bindende, det er nødvendigt at medtage strenge negative (dvs., sekundær antistof eneste, primære antistof preabsorbed mod immuniserende peptid) og positive kontroller24.
  13. Rewarm dias ved at placere ved stuetemperatur i 30 min.
  14. Vask dias 3 × med PBS på en rystende platform (60 rpm) i 10 min.
  15. Inkuber afsnittene med passende sekundær antistof fortyndet i 1% BSA/PBS (filtreret gennem et 0,45 µm filter) ved 37 ° C i 1 time (1: 400 fortynding for alle sekundære antistoffer, se Tabel af materialer til antistof detaljer).
    Forsigtig: Holde objektbeholderen dias i mørke fra dette trin og fremefter. Dobbelt mærkning, vælge en kompatibel kombination af sekundære antistoffer (dvs., sekundære antistoffer skal er blevet rejst i forskellige arter).
  16. Vask dias 3 × med PBS på en rystende platform (60 rpm) i 10 min.
  17. Counterstain sektioner med propidium Iodid (PI, 7,48 μmol/L) eller 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4,37 μmol/L) i 2 min. ved stuetemperatur til at mærke cellekernen.
  18. Vask dias to gange med PBS på en rystende platform (60 rpm) i 5 min.
  19. Montere sektioner med 10% Mowiol 4-88 tilberedt i en opløsning af 30% glycerol i 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) og 2,5% 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-oktan.
  20. Forsegl coverslip med neglelak og gemme dias ved 4 ° C for fremtidige observation.
    Forsigtig: Det anbefales at udføre imaging dias så hurtigt som praktisk muligt efter forberedelse til at undgå uforholdsmæssigt store tab af fluorescens.

2 isolation af Epididymosomes fra mus Caput Epididymis (figur 3)

  1. Umiddelbart efter eutanasi af voksen mus via CO2 inhalation (schweiziske mus over 8 uger gammel), perfuse deres Vaskulaturen med PBS (pre-hjertelig til 37 ° C) for at minimere blod forurening af epididymis væv.
    Forsigtig: blodplasma indeholder forskellige populationer af exosomes, som er af samme størrelse til epididymosomes25. Effekten af blod clearance fra epididymis væv kan tilgås via inspektion af den første segment, et stærkt vaskulariserede epididymis segment placeret proksimalt for caput segment (dvs., zone 1 i figur 1A)
  2. Omhyggeligt dissekere epididymis fri af overliggende fedt og bindevæv og skyl med modificerede Biggers, Whitten og Whittingham medium (BWW, pH 7,4, osmolalitet 300 mmol/kg vand26,27) for at mindske enhver potentiel for overflade blod forurening.
  3. DUP den epididymis væv til at fjerne overskydende medier, dissekere caput epididymis (dvs., zone 2-5 i figur 1A) og overførsel til en frisk petriskål (35 × 10 mm) indeholdende BWW medium. Sikre, at mængden af medium er tilstrækkelig til den endelige nyttiggørelse.
    Bemærk: For 6 caput bitestikler, det anbefales at bruge 1,1 mL medium at give mulighed for en genopretning af ~ 900 µL, som er så jævnt split og anvendes på toppen af 2 forberedte gradienter (Se trin 2.9).
  4. Foretage en række små snit i caput væv med et barberblad. Ikke hakkekød væv og dermed undgå at forurene proeven med overdreven cytosole indholdet. Inkuber pladen som indeholder væv med mild uro ved 37 ° C i 30 min at udgive luminale indhold.
  5. Filtrere den resulterende suspension gennem 70 µm membraner til at fjerne den celleaffald.
  6. Saml filtratet og underkaste det efterfølgende centrifugering trin ved 4 ° C med stigende hastighed for at eliminere celleaffald (dvs., 500 × g, 2.000 × g, 4000 × g, 8.000 × g, 5 min hver; 17.000 × g i 20 min., og endelig 17.000 × g for en yderligere 10 min. eller indtil ingen pellet er dannet efter centrifugering).
    OBS: Det er vigtigt at vurdere farven på pellet efter de første 500 × g centrifugering skridt til at sikre minimal blod forurening er til stede. Kassér eventuelle prøver, hvori denne pellet viser pink farve.
  7. Forberede diskontinuert iodixanol forløb (bestående af 40%, 20%, 10%, 5% lag) ved at fortynde en tæthed gradient medium (bestående af 60% (w/v) vandig iodixanol) med en opløsning af 0,25 mol/L saccharose og 10 mmol/L Tris (pH 7,5).
  8. Forberede forløbet i et ultracentrifuge rør (11 × 35 mm), med hver fraktion af 450 µL (figur 3). Inspicér visuelt gradient efter anvendelse af hver fraktion til at sikre, at grænsefladerne med held er dannet mellem hvert lag forud for lastning epididymis væske prøven. Forberede hver gradient frisk dag i brugen, dog, epididymis luminale væske prøven kan opbevares ved 4 ° C i op til 2 timer før pålæsningen.
  9. Forsigtigt tilføje 450 µL af epididymis luminale væske suspension (svarende til det indsamlede materiale fra caput af 3 bitestikler) på toppen af et enkelt forløb.
  10. Ultracentrifuge forløb på 160.000 × g ved 4 ° C for 18 h.
    Advarsel: Da denne centrifugering er udført i meget høj fart, alle ultracentrifuge rør skal være parret og afbalanceret præcist. Check af rør for at sikre, at de er fri for synlige skader der kunne kompromittere deres integritet.
  11. Forsigtigt fjerne 12 lig fraktioner, (hver består af 185 µL) med udgangspunkt i det øverste lag og fremad mod bunden af gradient. Samle de tilsvarende fraktioner inddrives fra hvert forløb, hvis det er relevant (op til to forløb).
    Bemærk: Mus epididymosomes er mest højt beriget med brøker 9-1122, se figur 4 og diskussion.
  12. Efter genopretning og pooling af fraktioner 9-11, fortyndet til 2 mL PBS, og ultracentrifuge prøver på 100.000 × g ved 4 ° C til 3 h (13 × 56 mm rør) at sammenpresse epididymosomes.
    Advarsel: Da epididymosome pellet kan være svært at se, sikre, at orientering af rørene er noteret som de placeres i rotoren og markere røret for at angive positionen vordende epididymosome pellet. Sikre, at hver tube indeholder en tilstrækkelig mængde (dvs., overstiger 50% af sin samlede kapacitet) til at udelukke risikoen for tube sammenbrud.
  13. Omhyggeligt Aspirér og supernatanten uden at forstyrre epididymosome pellet.
  14. Vurdere epididymosome renhed (figur 4).
  15. Epididymosome resuspenderes i ønskede medium ifølge downstream installationsprogrammerne. For eksempel, er BWW medium normalt anvendes til de eksperimenter, der involverer Co inkubering med sædceller eller alternativt en passende lysisbuffer som forberedelse til beslutningen fra epididymis proteomet via SDS-PAGE.

3. immunofluorescens farvning af mECap18 celler

  1. Forberedelse af sterile coverslips (skal gennemføres i en celle kultur hætte)
    1. Blød coverslips (12 × 12 mm) i 70% ethanol i 10 min og desinficere ved tørring under høj temperatur over en ethanol lampe.
    2. Cool coverslip for 10 s før du overfører til en 12 godt plade.
    3. Anvendes sterile poly-L-lysin løsning for at dække coverslip og nøjes med 10 min ved stuetemperatur.
    4. Kassér den poly-L-lysin løsning og skyl coverslip med sterile H2O eller passende medium.
  2. Forberedelse mECap18 celler
    1. Passage delprøver af 2 × 105 mECap18 celler i hver brønd af 12 godt plade der indeholder coverslips.
    2. Kultur celler med mECap18 celle medium (DMEM suppleret med 1% L-glutamin, 1% natrium pyruvat, 1% penicillin/streptomycin og 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN) indeholdende 10% føtalt kalveserum (FBS) i et 37 ° C inkubator under en atmosfære 5% CO2 natten over.
    3. Når cellerne overholder coverslip, kassere medium og skyl celler to gange med PBS.
    4. Tilføje en tilstrækkelig mængde af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) fortyndes i PBS at fordybe den hele coverslip og lave cellerne ved stuetemperatur i 15 min.
    5. Kassér PFA løsning og skyl coverslips to gange i PBS.
  3. Immunfluorescens farvning
    1. Permeabilize mECap18 celler ved nedsænkning i 0,1% Triton X-100 i PBS i 10 min.
    2. Skyl coverslips med PBS.
    3. Blokere mECap18 celler med 3% BSA og fortsætte med immunolabeling af celler udnytte tilsvarende protokoller til de beskrevne for epididymis væv sektioner.

4. isolering af proteiner fra konditioneret cellekulturmedium

  1. Samling af konditioneret cellekulturmedium
    1. Passage delprøver af 4 × 105 mECap18 celler i hver brønd 6 godt plade med mECap18 celle medium suppleret med 10% FBS i 24 timer.
    2. Vask mECap18 celler tre gange med mECap18 celle mediet (parat uden FBS) for at fjerne resterende FBS og nogen forbundet protein forurenende stoffer.
    3. Der tilsættes 1,5 mL mECap18 celle mediet (parat uden FBS) til hver brønd og Inkuber med mECap18 celler i 12 timer i et 37° C inkubator under 5% CO2.
      Bemærk: mECap18 celler på dette trin kan vurderes for forskellige mål antigener ifølge eksperimentelle design.
    4. Efter 12 h inkubation, indsamle celle medium og centrifugeres ved 2.000 × g i 10 min. til at fjerne alle celleaffald.
      Bemærk: Varigheden af inkubationen er købedygtig blive ændret i overensstemmelse med eksperimentelle design/slutpunkt vurdering og under hensyntagen til cellens tolerance til anvendte behandling(er). Det anbefales at skræddersy timingen af inkubation baseret på specifikke eksperimentelle regimer at sikre optimale resultater.
    5. Vurdere mECap18 cellernes levedygtighed via anvendelsen af en standard trypan blå udstødelse assay28. Kassér alle materiale som cellernes levedygtighed er faldet under 90% at fjerne bias indført af proteiner frigives fra døde eller døende celler.
    6. Isolere proteiner fra celle medium som følger eller bevare medium ved-80 ° C.
  2. Protein isolation (skal gennemføres i et stinkskab)
    1. Tilføje 20% volumen kølet 100% trichloreddikesyre til 80% volumen af konditioneret celle medium at udfælde proteiner frigives fra kulturperler mECap18 celler. Der inkuberes ved 4 ° C natten over med konstant blanding.
    2. Efter inkubation, pellet bundfaldne proteiner ved centrifugering (17, 000 × g, 4 ° C i 10 min).
      Bemærk: På grund af den begrænsede mængde protein forventes at være udskilles i medium, det er muligt, at bundfaldet ikke vil være let visualiseres efter centrifugering. Det er derfor bydende nødvendigt at orientere tube inden centrifugeringen og passe på ikke for at forstyrre den vordende pellet placering under fjernelse af supernatanten korrekt.
    3. Supernatanten og vaske pellet to gange med kølet acetone inden den re centrifugering (17, 000 × g, 4 ° C i 10 min).
    4. Forsigtigt fjerne og supernatanten før lufttørring enhver resterende acetone i et stinkskab.
    5. Resuspenderes protein i en passende ekstraktionsbuffer forberedelse til slutpunkt analyse at opdage komplet sekretoriske proteiner profiler og/eller individuelle mål proteiner (fx., SDS-PAGE, immunoblotting).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 og Figur 2 viser repræsentative resultater af immunofluorescens lokalisering af DNM i mus caput bitestiklen. Hver af de tre DNM isoformer undersøgt display særskilte lokalisering profiler. Således er DNM1 kendetegnet ved forholdsvis beskedne diffuse mærkning af epididymis celler i hele den første segment og caput epididymis (figur 2A). Derimod DNM2 isoform blev først opdaget i nærheden af den modsatte basal og apikale grænse af celler i den første segment, før at blive genplaceret til domænet supranuclear i celler i tilstødende downstream caput målgruppen (dvs., zone 2-5) (figur 1B, C). Navnlig, men intensiteten af DNM2 mærkning gradvist faldt mellem zone 2 til 5 af caput epididymis, et resultat, der hovedsagelig afspejler den sekretoriske aktivitet af disse epididymis segmenter21 (figur 1B, C). Derfor blev supranuclear mærkning af DNM2 efterfølgende vist svarer til fordelingen af Golgi apparatet i caput principal celler21. Sædcellerne isoleret fra den samme region, epididymis viste intens acrosomal mærkning for DNM2 (figur 1 d). Som en advarsel, men blev tilsvarende DNM2 mærkning ikke rutinemæssigt fundet på luminale sædcellerne inden for vores væv sektioner. Dette fænomen er den, vi er stødt på flere gange når du anvender en vifte af antistoffer rettet mod forskellige epididymis/sæd antigener og formentlig opstår på grund af problemer forbundet med antigen præsentation og/eller maskering i den paraffin-embedded væv sektioner. Under alle omstændigheder understrege sådanne forskelle betydningen af at gennemføre parallelle immunfluorescent mærkning af isolerede sædcellerne ved siden af den epididymis væv, selv. Afviger fra både DNM1 og DNM2, blev DNM3 isoform især fundet i den apikale domæne i et lille antal af caput epitelceller (figur 2B, grønne pile), som viste sig at svare til den klare celle delpopulation af co mærkning med anerkendte klare celle markør, ATP6V1B1 (figur 2B, røde pile). I en lignende måde, er repræsentative markører, der har vist sig egnet til at skelne de forskellige epididymis epitelcelle typer sammenfattet i tabel 229,30,31 , 32 , 33 , 34.

Ud over beskrivelsen af teknikkerne til subcellulært lokalisering af proteiner i epididymis epitel, her, rapporterer også vi vores seneste optimerede protokoller for studier af sekretoriske proteiner indkapslet i epididymosomes, lille ekstracellulære blærer, der repræsenterer en vigtig del af den luminale milieu ansvarlig for at støtte sperm modning og opbevaring22. Kombineret, giver trin 2 og figur 3 en detaljeret trinvis redegørelse for den metode, der anvendes til isolering af højt beriget populationer af epididymosomes fra mus caput epididymis væv. Navnlig, men er disse metoder umiddelbart gældende for isolation af alternative populationer af epididymosomes med oprindelse fra mere distale epididymis segmenter. På grund af risikoen for forurening af disse prøver beskrevet vi også de strenge karakterisering protokoller, der rutinemæssigt beskæftiger vi for hver epididymosome forberedelse. Disse omfatter vurdering af størrelse og heterogenitet befolkningers epididymosome ved hjælp af både høj opløsning elektronmikroskopi og dynamisk lysspredning teknikker. I tandem, vi også udnytte immunoblotting strategier for at vurdere berigelsen af anerkendte ekstracellulære vesikel markører og tilsvarende mangel af proteiner, der er karakteristiske for potentielle forurenende stoffer (dvs., anti-hæmoglobin (Ulla) som en markør af blod forurening og anti-arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15) og anti-IZUMO1 antistoffer som markører af cytoplasmatisk droplet og sperm forurening, henholdsvis)22. Selvom vi har konstateret, at forurenende stoffer er sjældne, hvis de er stødt på, kassere vi straks epididymosome forberedelse.

Den ikke-overlappende lokalisering af DNM isoformer i caput epididymis bedt om en yderligere undersøgelse af deres potentielle roller i reguleringen af epididymis mikromiljø. Til dette formål, blev en udødeliggjort mECap18 cellelinje udnyttet som en in vitro- model til at studere epididymis celle sekretoriske aktivitet. Tidligere karakterisering af denne celle line har vist, at det havne en blandet celle population, som pletter positivt til enten principal eller klare celle markører. Desuden har mECap18 celler også bevist egnet til rapportering fysiologiske profiler i epididymis gen og protein udtryk under forskellige in vitro- behandling regimer35. Før brug, blev DNM lokalisering vurderet i kulturperler mECap18 celler af bilæggelse af disse på poly-L-lysin behandlede coverslips (figur 5A) og underkaste dem immunofluorescens påvisning. Overensstemmelse med spredningsmønstre indspillet i caput epididymis væv sektioner, DNM1 blev fundet i hele cytoplasma af mECap18 celler, mens DNM2 var koncentreret inden for domænet supranuclear af disse celler og DNM3 var præget af diskrete Foci af membran farvning inden for et lille delpopulation tal (dvs., 11%) af de mECap18 celler, der var ATP6V1B1 positive (figur 5B). Disse data bekræfter nytte af mECap18 cellelinje som en værdifuld ressource for at undersøge DNM rolle i reguleringen af epididymis celle sekretoriske/lydabsorberende aktivitet.

I overensstemmelse hermed, trin 4 beskriver metoden til analyse af mECap18 celle sekretoriske aktivitet; de teknikker, der er bred imødekommenhed over for at vurdere virkningen af en række forskellige eksperimentelle betingelser. I vores undersøgelse anvendte vi selektiv farmakologiske interventioner for at undertrykke aktiviteten af DNM1 og DNM2 forud for visualisering og kvantificering af profilen af proteiner frigives fra mECap18 celler i konditioneret medium21. Et vigtigt element i denne analyse, var imidlertid at sikre at mECap18 celler var grundigt vasket og kulturperler i mangel af FBS tilskud. Et sådant skridt var afgørende for at udelukke kontaminering af konditioneret medium med FBS afledt proteiner, bærer det ikke desto mindre den dermed forbundne risiko for negativt påvirker mECap18 cellevækst og/eller levedygtighed. I kontrollerende for denne mulighed, vi bemærket, at mECap18 cellelinje tolereret FBS free kultur og indførelsen af DNM hæmmere for varigheden af vores inkubation vindue (dvs., 12 h). Ja, over dette tidsforløb, cellernes levedygtighed forblev over 90% i alle eksperimentelle replikater. Denne tilgang kan derfor tjene som et nyttigt proof of concept strategi til at identificere funktionen af specifikke epididymis proteiner før at forpligte sig til investeringer i gen manipulation strategier.

Varme induceret epitop hentning løsning 10 mmol/L natriumcitrat 50 mmol/L Tris (pH 10.5)
Tid 3 min 3 min
6 min 6 min
9 min 9 min
12 min 12 min

Tabel 1 : Generelle betingelser for optimering af varme-induceret antigen hentning til brug med paraffin-embedded epididymis sektioner. Fiksering proces kan være problematisk, da forskellige epitoper ofte kræver brug af forskellige fiksering teknikker, hvilket nødvendiggør, at metoden, der er optimeret til hvert antigen.

Epitelcelle type Distribution Markør Referencer (PMID)
Vigtigste celle Hele epididymis AQP9 11027599, 17360690
Klare celle Caput, corpus og cauda V-ATPases, CIC-5 19448084, 12475763
Basal celle Hele epididymis CLDN1 11159859, 21441423
Smalle celle Indledende segment V-ATPases, CIC-5 19448084, 12475763

Tabel 2 : Repræsentant markører egnet til påvisning af forskellige primære epididymis epitelcelle typer.

Figure 1
Figur 1: rumlige udtryk for DNM 2 inden for den proksimale mus epididymis. (A) skematisk model af bitestiklen skildrer en opdeling på musen epididymis i 10 zoner fysisk adskilt septa som rapporteret af Turner og kollegaer20. I denne model, zone 1 svarer til den første segment, zone 2-5 svarer til caput epididymis, zoner 6-7 svarer til corpus epididymis og zoner 8-10 repræsenterer cauda epididymis. (B-C) Immunfluorescens lokalisering af DNM2 afsløret zone-specifik spredningsmønstre (angivet med hvide pilespids og pil). Grænsen mellem zone 1 og 2 er afgrænset af en punkteret eller angivet med gule pile. (D) DNM2 kommer også til udtryk i den peri-acrosomal domæne af sædcellerne isoleret fra caput bitestiklen. Dog blev ingen sådanne pletter rutinemæssigt fundet i luminale sædcellerne inden for de tilsvarende epididymis sektioner. EP, epitelceller; Larsen, lumen; Neg, sekundær antistof eneste kontrol. Eksperimenter blev replikeret af materiale fra tre dyr og repræsentative immunofluorescens billeder præsenteres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: immunofluorescens påvisning af DNM 1 og DNM 3 i mus caput epididymis. (A) lokalisering af DNM136 blev undersøgt i mus caput bitestiklen. (B) co lokalisering af DNM336 og klare celle markør, ATP6V1B137 i mus caput bitestiklen. Denne analyse har bekræftet, at begge DNM3 (grønne pile) og ATP6V1B1 (røde pile) bor i den klare celle delpopulation men vise minimal subcellulære overlapning. EP, epitelceller; int, interstitium; Larsen, lumen; SP, sæd; Neg, sekundær antistof eneste kontrol. Cellekerner var counterstained med DAPI (blå). Eksperimenter blev replikeret af materiale fra tre dyr og repræsentative immunofluorescens billeder præsenteres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: skematisk af isolation protokoller bruges til berigelse af musen caput epididymosomes. Efter dissektion, er caput epididymis væv nedsænket i en dråbe af BWW medium og indsnit for at udgive luminale indhold. Den luminale væske derefter filtreres gennem et 70 µm membran og den deraf følgende suspension centrifugeres ved stigende hastighed for at pille enhver resterende celle debris. De ryddede suspension er derefter indlæst på toppen af en diskontinuerlig tæthed farveforløb (iodixanol løsning) og underkastes overnight ultracentrifugering. Epididymosomes partition i fraktioner 9-11, der sammenlægges, vasket via fortynding i PBS og vendte tilbage til ultracentrifuge at sammenpresse epididymosomes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: vurdering af epididymosome renhed. Tolv lig fraktioner blev genoprettet efter ultracentrifugering farveforløbets og en delprøve af hver forberedt til (A) protein og RNA kvantificering, (B) størrelse heterogenitet vurdering ved hjælp af dynamisk lysspredning, og (C). immunblot analyse af epididymosome markør distribution. Yderligere karakterisering trin inkluderet (D) dual-mærkning af epididymosomes koncentreret på aldehyd/sulfat latex perler, (E) transmissions Elektron Mikroskopi vurdering og (F) immunblot vurdering af sædceller (Sæd) og røde blodlegemer (RBC) forurening ved hjælp af enten anti-arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15, cytoplasmatisk droplet/sæd forurening) eller anti-hæmoglobin (Ulla, RBC forurening). Immunoblots var også aftestede med kendte epididymosome gods (26S proteasom ikke-ATPase regulerende subunit 7, PSMD7, heat shock protein 90kDa beta medlem 1, HSP90B1; og beta tubulin, TUBB). Disse data blev oprindeligt offentliggjort i videnskabelige rapporter (PMID: 27549865) og er blevet gengivet her med tilladelse fra udgiveren, Springer karakter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: immunofluorescens påvisning af DNM isoformer i mECap18 celler afslører distribution mønstre at aftale med dem, opdaget i caput epididymis væv. (A) skematisk af coverslip forberedelse til sterile mECap18 cellekultur. (B) repræsentative immunofluorescens billeder af DNM farvning afslørede cellulære fordeling mønstre (pile og indsatser (dobbelt mærkning af DNM3 og klare celle markør ATP6V1B1)), spejlet dem fundet i epididymis væv sektioner. Cellekerner var counterstained med enten propidium Iodid (PI, red) eller DAPI (blå). Eksperimenter blev replikeret af materiale fra tre dyr og repræsentative immunofluorescens billeder præsenteres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Disse undersøgelser indgår brugen af Bouins faste epididymis væv, der havde været udsat for paraffin indlejring og skære standardprotokoller. Bouins Fikseringsvæske løsning består af en blanding af formaldehyd, picrinsyre syre og eddikesyre, med hver komponent har en specifik og supplerende funktion. Således formaldehyd reagerer med primære aminer til at danne protein cross-links, picrinsyre syre trænger langsomt væv danner salte og dermed koagulation af grundlæggende proteiner og omvendt, eddikesyre hurtigt trænger ind i væv og forårsager koagulation af nukleinsyrer. Disse kombinerede egenskaber har affødt Bouins som fiksativ valg for bevarelsen af morfologiske detaljer og dens anvendelse er meget omtalt i epididymis litteratur. Bouins løsning er imidlertid ikke uden sine begrænsninger, som omfatter tilbøjeligheden for Fikseringsvæske induceret fluorescens og formaldehyd induceret cross-linking som kan sløre mål antigener.

Potentialet for baggrunden fluorescens nødvendiggør brug strenge negative kontroller, som i vores undersøgelser omfatter udeladelsen af det primære antistof, udeladelsen af den sekundære antistof, og hvor reagenserne, der er tilgængelige, brug af primære antistoffer preabsorbed mod den immuniserende peptid, hvorfra de blev genereret. Oplysninger om anvendelsen af sådanne kontroller er eksemplificeret i vores tidligere undersøgelse af dynamin DNM udtryk i mus epididymis21. Ideelt, disse resultater skal også valideres ved hjælp af væv udvundet fra knockout dyr, men dette materiale er ikke altid let tilgængelige. Søger at imødegå de sekundære problem af tværbundet eller kemisk modificerede mål antigener, er det ofte nødvendigt at foretage nogle form af antigen hentning for at afsløre epitoper, der er ændret af fiksering og dermed genskabe deres potentiale for antistof bindende. Metoden til hentning afhænger af mange variabler, herunder target-antigen, antistoffer, vævstype og metode til fiksering. Men de mest bredt vedtaget teknikker har anvendelsen af enten varme-medieret eller proteolytiske induceret antigen hentning. De tidligere funktioner som vores begunstiget tilgang som følge af en højere succesrate for at genoprette immunoreactivity, med angivelse af de varme regimer og hentning løsninger vi almindeligvis udnytte bliver dokumenteret i tabel 1. Vi advarer dog, at dette er på ingen måde udtømmende og i sidste ende optimering af antigen hentning for hvert protein target/antistof kombination kræver forudgående undersøgelser ved hjælp af en matrix af kombinationer af tid, temperatur og pH. Yderligere overvejelser omfatter potentialet for varme hentning at fremkalde vævsskader og/eller forårsage artefactual mærkning. Således ud over anvendelsen af de negative kontroller dokumenteret ovenfor, vil vi også rutinemæssigt indarbejde positive kontroller med antistoffer, som anti-Golgin-97, der anerkender forskellige cellulære organeller.

I forsøget på at etablere om proteiner som dem, der tilhører familien DNM opfylde overflødig, i modsætning til supplerende, funktioner i epididymis væv, har vi fundet det særlig informativ til at udføre dobbelt mærkning eksperimenter som dem illustreret i figur 2B. Denne strategi indebærer sekventielle mærkning af væv sektioner med par af primære antistoffer (rejst i forskellige arter) efterfulgt passende sekundære antistoffer konjugeret til forskellige fluorophores. Men en forstyrrende funktion, der undertiden opstår i forsøget på at udføre disse dobbelt mærkning undersøgelser er uforenelighed af protokollerne antigen hentning behov for optimal mærkning med hver primære antistof. Denne begrænsning opstod for Co mærkning af DNM 2 og Golgin-97 i mus caput epididymis, fører os til at bruge fortløbende serielle sektioner (i modsætning til den samme sektion)21. En af disse fremgangsmåder er dog ekstremt nyttige i forbindelse med tilskrive protein udtryk til en bestemt celletype blandt dem repræsenteret i pseudostratified epididymis epitel. Med dette mål for øje, har vi inkluderet en liste over repræsentative celle type markører og deres rapporterede spredningsmønstre langs længden af den epididymis tubulus (tabel 2). Når man ønsker at gå ud over celletype og begynde at udforske subcellulært fordelingen af target proteiner, tilbyder brugen af dobbelt mærkning med anerkendte organelle markører, såsom Golgin-97, forskellige fordele. Alternativt, anvendelsen af høj opløsning elektronmikroskopi i tandem med Autoradiografi mærkning forbliver metode valg for detaljerede ultrastrukturelle lokalisering og validering af farvning mønstre opnås ved hjælp af immunofluorescens21 .

Blandt de begrænsninger som følge af undersøgelsen af epididymosomes er deres lille størrelse og vanskeligheden ved at opnå tilstrækkelige mængder for detaljerede slutpunktet analyser, særligt i almindeligt anvendte laboratorium arter som musen. Dog ved at udnytte de banebrydende undersøgelser af Sullivan og kolleger38,39,40, har vi været i stand at optimere robust metode til epididymosome isolation fra musen model (Se trin 2). Vi dog understrege behovet for at indføre streng kontrol til at vurdere og fysiske egenskaber af beriget epididymosome populationer41 på grund af den potentielle forurening fra sædcellerne, cytoplasmatisk dråber og/eller blodbårne exosomes ( Se figur 4). Til dette formål, vi rutinemæssigt bruger en kombination af: (i) høj opløsning elektronmikroskopi at visualisere størrelse og heterogenitet af epididymosome forberedelse, (ii) beregning af den gennemsnitlige partikel størrelse og heterogenitet III koncentration af den epididymosomes på 4 µm aldehyd/sulfat latex perler og fluorescerende mærkning af anerkendt exosome overflade markører, herunder CD9 og FLOT1, og (iv) immunoblotting af isoleret epididymosomes med en suite af antistoffer anbefales til eksperimentelle validering af exosomes (fx., anti-CD9, anti-FLOT1), såvel som negativ kontrol svarende til antigener, der skal begrænses til sædcellerne (anti-IZUMO1), sperm cytoplasmatisk dråber (anti-ALOX15) eller blood (anti-Ulla)22. Hvis disse normer er opfyldt, så epididymosome præparater isoleret er let indstillet til brug i downstream applikationer herunder Co inkubering med sædcellerne og/eller fragt profilering analyserer22,42, som begge er kraftfuld tilgange for at øge vores forståelse af rollen, som epididymosomes i reguleringen epididymis sperm modning1.

I denne undersøgelse beskrive vi anvendelsen af en SV40-udødeliggjort mus caput epididymis epitel (mECap18) cellelinje, som vi har udnyttet for at studere DNM inddragelse i reguleringen af epididymis sekretoriske aktivitet21 samt virkningen af miljømæssige giftstoffer på epididymis fysiologi43. Et vigtigt element i den mECap18 cellelinje er, at det viser fænotypiske stabilitet mellem passager og funktioner en repræsentativ befolkning af både primære og klare celler21,35,44. I forhold til primære epididymis cellekulturer, viser mECap18 cellelinje også tolerance til dyrkning i føtalt kalveserum gratis medium, som udvider varighed og art af eksperimenterende indgreb disse celler kan blive udsat for, mens også bliver eftergivende for at inddrive en større overflod af udskilles proteiner fra de konditioneret medium. En ansvarsbegrænsning cellelinje mECap18 er dog, at det er blevet foreviget og kan dermed reagerer forskelligt til stress og / eller immun-relaterede stimuli i forhold til at af primære celle kulturer eller disse celler præsentere in vivo. Med denne begrænsning i tankerne anbefales det at sammenligne de resultater, der opnås ved hjælp af mECap18 celler i vivo svar når det er muligt. I Resumé fremhæve protokollerne beskriver vi nytten af denne cellelinje som et værktøj til at begynde at studere funktionaliteten af target proteiner i caput epididymis. Faktisk, i kombination med brug af kommercielle protein hæmmere og/eller genom-redigering værktøjer (f.eks. CRISPR-Cas9), mECap18-cellelinie holder store muligheder for at hjælpe med at løse det mekanistiske grundlaget for epididymis funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende National sundhed og Medical Research Rådet af Australien Project Grant APP1103176 til støtte for dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamin 1 antibody Abcam ab108458 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 2 antibody Santa Cruz sc-6400 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 3 antibody Proteintech 14737-1-AP Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ATP6V1B1 antibody Santa Cruz sc-21206 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
CD9 antibody BD Pharmingen 553758 Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal
Flotillin-1 antibody Sigma F1180 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ALOX15 antibody Abcam ab80221 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
TUBB antibody Santa Cruz sc-5274 Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal
PSMD7 antibody Abcam ab11436 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit Alexa Fluor 488 Thermo A11008 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 488 Thermo A11055 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 594 Thermo A11058 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594 Thermo A11007 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit HRP Millipore DC03L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat HRP Millipore DC01L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Mouse HRP Santa Cruz sc-2005 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9564
propidium iodide (PI) Sigma P4170
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS-F
DMEM Thermo 11960-044
L-glutamine Thermo 25030-081
penicillin/streptomycin Thermo 15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN Sigma A8380
sodium pyruvate Thermo 11360-070
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma T4049
Paraformaldehyde (PFA) EMS 15710
Xylene VWR Chemicals 1330-20-7
Ethanol VWR Chemicals 64-17-5
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417
Sodium citrate Sigma S1804
Tris Astral 0497-5KG
Glycerol Sigma G5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane Sigma D2522
Poly-L-gysine Sigma P4832
Triton X-100 Sigma 78787
Trypan blue Sigma T6146
Trichloroacetic acid Sigma T9159
Acetone Ajax Finechem A6-2.5 L GL
Sucrose Sigma S0389
Poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
D-Glucose Ajax Finechem 783-500G
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Fluorescence microscopy Zeiss Zeiss Axio Imager A1
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER Optima Max-XP
Microcentrifuges Eppendorf 5424R
Incubator Heracell 150
Large Orbital Shaker Ratek OM7
Microwave LG MS3840SR /00
Lab pH Meter MeterLab PHM220
Liquid-repellent slide marker Daido Sangyo Mini
Coverslip Thermo 586
6 well plate CELLSTAR 657160
12 well plate CELLSTAR 665180
Slide Mikro-Glass SF41296PLMK
0.45 µm filter Millox-HV SLHV033RS
Kimwipes Dustfree Paper KIMTECH 34155
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) BECKMAN COULTER 347356
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) BECKMAN COULTER 362305
Cell strainer 70 µm Nylon FALCON 352350
Petri dish 35 × 10 mm with cams SARSTED 82.1135.500
Slide jar TRAJAN #23 319 00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
  2. Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
  3. Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
  4. Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
  5. Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
  6. Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
  7. Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
  8. Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
  9. Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
  10. Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
  11. Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
  12. Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
  13. Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
  14. Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
  15. Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
  16. Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
  17. Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
  18. Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
  19. Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
  20. Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
  21. Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
  22. Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
  23. Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
  24. Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
  25. Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
  26. Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
  27. Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
  28. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
  29. Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
  30. Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
  31. Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
  32. Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
  33. Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
  34. Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
  35. Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
  36. Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
  37. Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
  38. Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
  39. Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
  40. Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
  41. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  42. Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
  43. Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
  44. Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 138 Dynamin epididymis epididymosome exosome immunofluorescens protein sekretion sperm sperm modning
Analyse af epididymis proteinsyntese og sekretion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, W., Sipilä, P., De… More

Zhou, W., Sipilä, P., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion. J. Vis. Exp. (138), e58308, doi:10.3791/58308 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter