Summary
Aquí, divulgamos la localización de la inmunofluorescencia de Dynamín para ilustrar los protocolos para la detección de proteínas en secciones de epidídimo de ratón embebido en parafina y las de una línea de células epidídimo inmortalizadas (mECap18). También se describen los protocolos para el aislamiento de proteínas secretoras de fluido Epididimal y medios condicionados de la célula.
Abstract
El epidídimo mamífero genera uno de los más complejos líquidos intramural de cualquier glándula endocrina para apoyar la maduración post-testicular y el almacenamiento de espermatozoides. Tal complejidad se presenta debido a la actividad secretora y absortiva combinada de las células epiteliales de revestimiento. Aquí, describimos las técnicas para el análisis de la secreción y síntesis de la proteína Epididimal centrándose en la familia de proteínas modelo de Dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPasas grandes que tienen el potencial para regular eventos tráfico bidireccional de membrana. Para el estudio de expresión de la proteína en tejido Epididimal, describimos la metodología robusta para inmunofluorescencia etiquetado de proteínas blanco en secciones parafina-encajadas y la posterior detección de la distribución espacial de estas proteínas a través de microscopia de la inmunofluorescencia. También describimos la metodología optimizada para el aislamiento y la caracterización de los exosomas como vesículas, conocido como epididymosomes, que son secretadas en el lumen del epidídimo para participar en la comunicación intercelular con maduración células de la esperma. Como un enfoque complementario, también Describimos la detección de inmunofluorescencia de las proteínas de la blanco en una línea de células de ratón inmortalizó SV40 caput epitelio Epididimal (mECap18). Además, discutimos la utilidad de la línea celular de mECap18 como un modelo adecuado en vitro con el cual explorar la regulación de la actividad secretora de epidídimo. Para ello, se describen los requerimientos de cultivo para el mantenimiento de la línea de celular mECap18 y el uso de regímenes de inhibición farmacológica selectiva que son capaces de influir en su perfil de la proteína secretora. Los últimos son fácilmente evaluaron por cosecha del medio de cultivo condicionado, concentración de proteínas secretadas mediante precipitación de ácido tricloroacético/acetona y su posterior análisis mediante SDS-PAGE e immunoblotting. Sostenemos que estos métodos combinados son adecuados para el análisis de objetivos alternativos proteína Epididimal como preludio para determinar su papel funcional en la maduración del esperma o almacenamiento.
Introduction
Los espermatozoides de todas las especies mamíferas adquieran el potencial para mostrar motilidad progresiva hacia adelante y fertilizar un óvulo durante su descenso prolongado por el epidídimo, una región altamente especializado del sistema masculino conducto extra testiculares, que pueden 7-14 días para navegar (dependiendo de la especie)1. Debido a la extrema condensación de la cromatina paterna y el derramamiento de la mayoría del citoplasma que acompaña el cytodifferentiation de espermatozoides en los testículos, su posterior maduración funcional está impulsado exclusivamente por su interacción con el microambiente epidídimo. Este medio es, a su vez, creado por la actividad secretora y absortiva del soma epididymal de guarnición y muestra un nivel excepcional de segmento variación1. Así, los segmentos más activos en cuanto a la síntesis de proteínas y la secreción son los situados en la porción proximal del epidídimo (es decir, la cabeza y corpus)2. Esta actividad refleja el perfil funcional de los espermatozoides, con el primer principio de las células para mostrar características distintivas de la competencia funcional (es decir., motilidad progresiva y la capacidad de enlazar a glicoproteínas de la zona ácido solubilizado) siguientes sus paso por el epidídimo cápita del3. Estos atributos funcionales continúan desarrollándose antes de llegar a niveles óptimos mientras los espermatozoides alcanzan el segmento distal del epidídimo (cauda), en donde se almacenan en un estado quiescente en la preparación para la eyaculación. La formación y el mantenimiento de este depósito del almacenaje de la esperma está también íntimamente ligada al epitelio de revestimiento, que en la cauda está dominado por la fuerte actividad de absorción4,5. Aunque las diferencias anatómicas se han reportado6,7,8, tal división regionalizada del trabajo parece ser una característica de epidídimo que es compartido entre la mayoría de las especies de mamíferos estudiados hasta la fecha, incluyendo nuestra propia de9,10. De hecho, desde una perspectiva clínica, se conoce que la disfunción epidídimo hace una importante contribución a la etiología del factor masculino infertilidad11, subrayando así la importancia de comprender la regulación de este tejido especializado.
Por lo tanto, es lamentable que nuestra comprensión de la fisiología del epidídimo y los mecanismos que regulan las fases secuenciales de la maduración de espermatozoides y almacenamiento dentro de este tejido, quedan por resolverse completamente. Entre los factores que contribuyen, limitando los avances en investigación epidídimo son la complejidad total de este tejido y conocimiento de los mecanismos que ejercen control regulador sobre su microambiente luminal. Anatómicamente, sabemos que más allá de la distinción de segmentos corpus, caput y cauda, el epidídimo se puede subdividir en varias zonas (figura 1A), cada uno separados por septos12 y caracterizado por perfiles discretos de gene/proteína 14,13,15,16,de expresión de17,18. De hecho, sobre la base de detallados transcripcional de perfiles de expresión génica segmentaria en el epidídimo, como 6 y 9 zonas epidídimo se han divulgado en los modelos de ratón y rata, respectivamente19,20. Tal complejidad probablemente refleja la composición del epidídimo soma, un epitelio seudoestratificado compuesto por numerosos tipos celulares diferentes; cada diferente con respecto a sus abundancia, distribución y secreción/absorción actividades a lo largo de la longitud de la zona. Así, las células principales son por mucho los más abundantes células epidídimo tipo constituyendo más del 80% de todas las células epiteliales. En consecuencia, las células principales son responsables de la mayor parte de la biosíntesis y la secreción de proteína Epididimal5. En contraste, la población de células claras, que alinea como el segundo más abundante tipo de célula en el epidídimo soma, principalmente participan en la absorción selectiva de componentes luminales y la acidificación de este microambiente5. Añadiendo otro nivel de complejidad, los andrógenos y otros factores de lumicrine de origen testicular ejercen control diferencial sobre cada uno de estos tipos de células epidídimo dependiendo de su posición a lo largo de la zona.
A pesar de las limitaciones impuestas por tal complejidad, incursiones significativas se siguen haciendo en resolver la base mecanicista de la función del epidídimo. Una clave a estos estudios ha sido la aplicación de estrategias avanzadas de espectrometría de masas para establecer inventarios de amplia escala del proteoma epididymal, junto con análisis detallados de proteínas individuales seleccionados entre estos estudios iniciales. Una ilustración de ello es la reciente caracterización de la familia de la DNM de mechanoenzymes en el ratón modelo21. Nuestro interés inicial en la DNM fue alimentado por su doble acción en el acoplamiento de procesos endocytotic y exo. Basándose en estas observaciones, hemos sido capaces de demostrar que las tres isoformas canónicas de la DNM (DNM1 - DNM3) son altamente expresadas en el epidídimo de ratón y colocadas de forma apropiada para cumplir con funciones reguladoras en la secreción de la proteína y absorción de21 . Por otra parte, hemos sido capaces de diferenciar claramente cada isoforma de la DNM en base a su localización celular y subcelular, así sugiriendo que poseen complementarias frente a actividad redundante, en el epitelio Epididimal21.
Aquí, describimos la metodología experimental empleada para el estudio de la expresión de la DNM en el epidídimo de ratón con la esperanza de que esta información se encuentra aplicación en la caracterización de proteínas epididimales alternativas y así contribuir a nuestra comprensión de la función de este importante elemento del tracto reproductivo masculino. Específicamente, se describe el desarrollo de una metodología robusta para inmunofluorescencia etiquetado de proteínas blanco en secciones parafina-encajadas de epidídimo y la posterior detección de la distribución espacial de estas proteínas por inmunofluorescencia microscopia. Documentamos más nuestros protocolos recientemente optimizado22 para el aislamiento y caracterización de epididymosomes; exosomas como pequeñas vesículas que constituyen elementos clave del perfil secretor epididymal y parecen sostener un papel destacado en la promoción de la maduración de espermatozoides23. Como un enfoque complementario, también Describimos la detección de inmunofluorescencia de las proteínas de la blanco en una línea de células inmortalizadas ratón caput epitelio Epididimal (mECap18) y el uso de este recurso como un modelo con el cual explorar la regulación de epidídimo in vitrode la actividad secretora.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales que implican recogida de tejido animal fueron aprobados por el cuidado Animal y Comité de ética de la Universidad de Newcastle.
1. inmunofluorescencia, tinción de las secciones parafina-encajadas Epididymal (figuras 1 y 2)
- Inmediatamente después de la eutanasia de ratones adultos por inhalación de CO2 (ratones suizos, más de 8 semanas de edad), diseccionar cuidadosamente el epidídimo (usando tijeras quirúrgicas y pinzas) gratuita que cubre el tejido conectivo y grasa y sumergir en fijador de Bouin solución (> peso de volumen tisular diez veces) para la fijación durante la noche.
- Lavar el tejido con etanol al 70% con 2 × cambios diariamente durante 2 días y luego deshidratar a través gradual etanol (70%, 95% y 100%) en preparación para la infiltración y embebido en un bloque de parafina.
- Sección de los bloques de parafina en un espesor de 4 a 6 μm y montaje de las diapositivas en preparación para la tinción de inmunofluorescencia.
- En una campana de humos, dewax las secciones de parafina epidídimo mediante la adición de una cantidad suficiente de xileno a la jarra de la diapositiva para sumergir completamente la sección del tejido (3 × 5 min cada vez).
- Rehidratar las secciones de tejido por inmersión en soluciones de etanol graduado diluido en purificado de H2O (100% etanol 5 min, etanol al 100% 5 min, etanol al 90% 1 min, etanol al 80% 1 min, etanol al 70% 1 min y etanol al 50% 1 min).
- Lávese las secciones en un tarro de diapositivas una vez durante 5 minutos con suficiente solución salina amortiguada de fosfatos (PBS) para sumergir completamente la sección del tejido entero (siga estas instrucciones para los lavados posteriores).
- Decantar la solución de recuperación del antígeno correspondiente (es decir., 10 mmol/L citrato de sodio, 50 mmol/L Tris pH 10.5 o soluciones de recuperación de antígeno alternativos, dependiendo del antígeno a detectar) en una parrilla y un microondas hasta que hierva. Sumerja los portaobjetos en esta solución y someter a las secciones de tejido a las condiciones de recuperación de antígeno provocado por el calor optimizadas para anticuerpos individuales (ver tabla 1).
PRECAUCIÓN: Asegúrese de que las diapositivas se sumergen totalmente en la solución de recuperación de antígeno durante el proceso de recuperación de antígeno. - Retire el contenedor de la diapositiva de la microondas y fresco a temperatura ambiente.
- Enjuague los portaobjetos con PBS y utilice un rotulador impermeable deslizante para trazar alrededor de la sección de tejido.
- Coloque los portaobjetos en un recipiente humedecido (creado por un pañuelo de papel humedecido en la base del recipiente) y aplicar solución de bloqueo (3% BSA/PBS, filtrada previamente a través de un filtro de 0.45 μm) por 1 h a 37 ° C.
- Enjuague los portaobjetos una vez con PBS.
- Incubar las secciones con anticuerpo primario apropiado diluido a una concentración optimizada experimentalmente en el filtrado 1% BSA/PBS a 4 ° C durante la noche (1: 60 para anti-DNM1, DNM2 y DNM3 anticuerpos; 1: 100 para el anticuerpo anti-ATP6V1B1, ver tabla de materiales para detalles de anticuerpos).
Nota: Para distinguir específicos de unión de anticuerpos no específicos, es necesario incluir estricta negativo (es decir., anticuerpo secundario único, primario anticuerpos preabsorbed contra inmunización péptido) y controles positivos24. - Recalentar las diapositivas colocando a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Lave el portaobjetos 3 × con PBS en una plataforma de agitación (60 rpm) durante 10 minutos.
- Incubar las secciones con anticuerpo secundario apropiado diluido con 1% BSA/PBS (filtrado a través de un filtro de 0.45 μm) a 37 ° C durante 1 hora (dilución 1: 400 para todos los anticuerpos secundarios, véase Tabla de materiales para detalles de anticuerpos).
PRECAUCIÓN: Mantenga el envase de la diapositiva en la oscuridad de este paso adelante. Para el doble etiquetado, elegir una combinación compatible de anticuerpos secundarios (ej., anticuerpos secundarios deben se han planteado en diferentes especies). - Lave el portaobjetos 3 × con PBS en una plataforma de agitación (60 rpm) durante 10 minutos.
- Contratinción las secciones con yoduro de propidio (PI, 7,48 μmol/L) o 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) por 2 min a temperatura ambiente para el núcleo de la etiqueta.
- Lave los portaobjetos dos veces con PBS en una plataforma de agitación (60 rpm) durante 5 minutos.
- Monte las secciones con 10% Mowiol 4-88 preparada en una solución de glicerol al 30% en 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) y 2.5% 1, 4 - Diazabiciclo-(2.2.2)-octano.
- Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y guardar las diapositivas a 4 ° C para la observación futuro.
PRECAUCIÓN: Se recomienda realizar la proyección de imagen de las diapositivas tan pronto como sea posible después de la preparación para evitar la pérdida excesiva de fluorescencia.
2 aislamiento de Epididymosomes de la cabeza del ratón del epidídimo (Figura 3)
- Inmediatamente después de la eutanasia de ratones adultos por inhalación de CO2 (ratones suizos durante 8 semanas de edad), inundar su vasculatura con PBS (previamente calentado a 37 ° C) para reducir al mínimo la contaminación de la sangre del tejido Epididimal.
PRECAUCIÓN: el plasma sanguíneo contiene diversas poblaciones de exosomas, que son de tamaño similar al de epididymosomes25. La eficacia de la separación de la sangre del tejido del epidídimo puede accederse a través de la inspección del segmento inicial, un segmento epididymal altamente vascularizado localizado proximal al segmento de caput (es decir., zona 1 en la figura 1A) - Disecar cuidadosamente el epidídimo libre de grasa que lo recubre y tejido conectivo y enjuague con medio modificado de Biggers, Whitten y Whittingham (BWW; pH 7,4, osmolalidad de 300 mmol/kg agua26,27) para reducir cualquier posibilidad de superficie contaminación de la sangre.
- Secar el tejido Epididimal para eliminar exceso de medios, diseccionar el epidídimo de la cabeza (es decir., zonas 2-5 en figura 1A) y la transferencia a un fresco plato de Petri (35 × 10 mm) que contiene medio de BWW. Asegúrese de que la cantidad de medio es suficiente para la recuperación final.
Nota: Para 6 caput epidídimos, es aconsejable utilizar 1,1 mL de medio para permitir una recuperación de ~ 900 μl, que es uniformemente dividida y aplicado en la cima de 2 gradientes preparados (ver paso 2.9). - Hacer una serie de pequeñas incisiones en el tejido de la cabeza con una cuchilla de afeitar. No tienes pelos en el tejido y así evitar contaminar la muestra con excesivo contenido citosólico. Incube la placa que contiene el tejido con suave agitación a 37 ° C por 30 min liberar el contenido luminal.
- Filtrar la suspensión resultante a través de 70 μm membranas para eliminar los desechos celulares.
- Recoger el filtrado y esta sujeto a pasos sucesivos centrifugación a 4 ° C con el aumento de velocidad para eliminar los detritos celulares (es decir., × 500 g× 2.000 g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min cada uno; 17.000 × g por 20 min y finalmente 17.000 x g para un 10 minutos adicionales o hasta que no pellet está formado después de la centrifugación).
PRECAUCIÓN: Es importante evaluar el color de la pelotilla después del inicial 500 × g paso de centrifugación para contaminación de sangre mínimo está presente. Deseche todas las muestras donde esta pelotilla muestra coloración rosa. - Preparación de gradientes discontinuos iodixanol (compuesto de 40%, 20%, 10%, 5% capas) diluyendo un medio de gradiente de densidad (compuesto de 60% (w/v) acuosa iodixanol) con una solución de 0.25 de mol/L sacarosa y 10 mmol/L Tris (pH 7.5).
- Preparar el gradiente en un tubo de ultracentrífuga (11 × 35 mm), con cada fracción de 450 μl (figura 3). Inspeccione visualmente el degradado después de la aplicación de cada fracción para asegurar que las interfaces están formadas con éxito entre cada capa antes de cargar la muestra de fluido Epididimal. Preparar cada gradiente fresco en el día de uso, sin embargo, la muestra de líquido luminal epidídimo puede ser conservada a 4 ° C por hasta 2 h antes de la carga.
- Cuidadosamente añadir 450 μl de epididymal luminal líquido suspensión (correspondiente al material recogido de la cabeza de 3 epidídimos) encima de una sola pendiente.
- Ultracentrífuga los gradientes a 160.000 × g a 4 ° C por 18 h.
PRECAUCIÓN: Puesto que esta centrifugación se realiza a muy alta velocidad, todos los tubos de ultracentrífuga deberán asociarlo y equilibrados precisamente. Compruebe los tubos para asegurar que estén libres de daños visibles que pudieran comprometer su integridad. - Suavemente Retire 12 fracciones iguales (cada uno compuesto por 185 μL) a partir de la capa superior y progresando hacia la parte inferior de la gradiente. Las fracciones equivalentes recuperadas de cada gradiente si corresponde (hasta dos gradientes) de la piscina.
Nota: El ratón epididymosomes están más altamente enriquecidos en fracciones 9 1122, ver figura 4 y discusión. - Después de la recuperación y puesta en común de fracciones 9 – 11, diluir en 2 mL de PBS y ultracentrífuga las muestras a 100.000 × g a 4 ° C para 3 h (13 × 56 mm tubo) para el epididymosomes de la pelotilla.
PRECAUCIÓN: Puesto que el pellet de epididymosome puede ser difícil de ver, asegúrese de que la orientación de los tubos se observa como se colocan en el rotor y marque el tubo para indicar la posición expectante de la pelotilla epididymosome. Asegúrese de que cada tubo contiene un volumen suficiente (es decir., superior al 50% de su capacidad total) para prevenir el riesgo de colapso del tubo. - Aspirar y descartar el sobrenadante sin perturbar el pellet de epididymosome.
- Evaluar la pureza de epididymosome (figura 4).
- Resuspender el precipitado de epididymosome en el medio deseado según las aplicaciones posteriores. Por ejemplo, medio BWW se utiliza generalmente para los experimentos de incubación conjunta con espermatozoides o, alternativamente, un tampón de lisis apropiado en la preparación para la resolución del proteoma epidídimo mediante SDS-PAGE.
3. inmunofluorescencia tinción de las células mECap18
- Preparación de cubreobjetos estériles (para llevarse a cabo en una campana de cultivo celular)
- Remoje el cubreobjetos (12 × 12 mm) en etanol al 70% durante 10 min y desinfectar secando bajo temperatura alta por encima de una lámpara de etanol.
- Enfriar el cubreobjetos por 10 s antes de transferirlas a una placa bien 12.
- Aplicar solución de poli-l-lisina estéril para cubrir el cubreobjetos y colocar por 10 min a temperatura ambiente.
- Deseche la solución de poli-l-lisina y enjuague el cubreobjetos con estéril de H2O o caso medio.
- Células de mECap18 de preparación
- Paso las alícuotas de 2 × 105 células de mECap18 en cada pocillo de la placa bien 12 con el cubreobjetos.
- Las células con mECap18 celular medio (DMEM suplementado con 1% L-glutamina, 1% piruvato de sodio, 1% de penicilina/estreptomicina y 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 μmol/L) que contiene 10% fetal suero de ternera (FBS) en una incubadora de 37 ° C bajo una atmósfera de 5% de la cultura CO2 durante la noche.
- Una vez que las células se adhieren al cubreobjetos, deseche el medio y enjuague las células dos veces con PBS.
- Añadir una cantidad suficiente de paraformaldehído al 4% (PFA) diluida en PBS a sumergir el cubreobjetos todo y fijar las células a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Deseche la solución de la PFA y enjuague el cubreobjetos dos veces en PBS.
- Tinción de inmunofluorescencia
- Permeabilizar las células mECap18 por inmersión en 0,1% Tritón X-100 en PBS durante 10 minutos.
- Enjuague el cubreobjetos con PBS.
- Bloque de células mECap18 con 3% de BSA y proceder con inmunomarcación de las células utilizando protocolos equivalentes a los descritos para las secciones de tejido Epididimal.
4. aislamiento de proteínas del medio de cultivo celular condicionada
- Colección del medio de cultivo celular condicionada
- Alícuotas de paso de 4 × 105 mECap18 células en cada pozo de 6 bien la placa con mECap18 celular suplementado con 10% FBS para 24 h.
- Lavar las células mECap18 tres veces con medio de mECap18 celular (preparado sin SFB) para quitar FBS residual y cualquier asociado contaminantes de la proteína.
- Añadir 1,5 mL de medio de mECap18 celular (preparado sin SFB) a cada pozo e incubar con las células mECap18 por 12 h en una incubadora de 37° C debajo del 5% CO2.
Nota: las células de mECap18 en este paso pueden ser evaluadas para antígenos diferentes según el diseño experimental. - Después de 12 h de incubación, recoge el medio celular y centrifugar a 2.000 × g por 10 min eliminar todos los desechos celulares.
Nota: La duración de la incubación es capaz de modificarse según evaluación diseño experimental/extremo y teniendo en cuenta la tolerancia de la célula al tratamiento aplicado. Se recomienda adaptar el tiempo de incubación basado en regímenes experimentales específicos para lograr resultados óptimos. - Evaluar la viabilidad de las células mECap18 través de la aplicación de un estándar trypan azul exclusión ensayo28. Deseche todo el material en que la viabilidad celular ha disminuido por debajo del 90% para eliminar el sesgo introducido por las proteínas de las células muertas o moribundas.
- Aislar proteínas del medio celular como sigue o preservar el medio a-80 ° C.
- Aislamiento de la proteína (a llevarse a cabo en una campana de humos)
- Añadir 20% volumen de frío 100% el ácido tricloroacético al 80% del volumen de medio condicionado de la célula para precipitar las proteínas de las células mECap18 cultivadas. Incubar a 4 ° C durante la noche con la mezcla constante.
- Después de la incubación, de la pelotilla de proteína precipitada por centrifugación (17, 000 × g, 4 ° C por 10 min).
Nota: Debido a la limitada cantidad de proteínas que se secretan en el medio, es posible que la pastilla no se ser visualizada fácilmente después de la centrifugación. Por lo tanto, es imperativo orientar el tubo antes de la centrifugación y tenga cuidado de no para perturbar la ubicación de pellets expectante durante la extracción del sobrenadante correctamente. - Deseche el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con acetona enfriada antes del volver a centrifugar (17, 000 × g, 4 ° C por 10 min).
- Cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante antes de secado al aire cualquier acetona residual dentro de una campana de humos.
- Resuspender el precipitado de proteína en un tampón de extracción adecuada en preparación para el análisis de punto final detectar perfiles de proteína secretora completa o proteínas objetivo individual (por ej., SDS-PAGE, immunoblotting).
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Representative Results
Figura 1 y Figura 2 muestran resultados representativos de la localización de la inmunofluorescencia de la DNM en el epidídimo de la cabeza de ratón. Cada una de las tres isoformas de la DNM había investigado pantalla localización distintos perfiles. Así, DNM1 se caracteriza por la relativamente modesta etiqueta difusa de las células del epidídimo a través del epidídimo de segmento y caput inicial (figura 2A). Por el contrario, la isoforma DNM2 primero fue detectada en las proximidades de la frontera opuesta basal y apical de las células en el segmento inicial, antes de ser colocado de nuevo el dominio supranuclear en células dentro del segmento adyacente cabeza abajo (es decir., zonas 2-5) (figura 1B, C). En particular, sin embargo, la intensidad de DNM2 etiquetado gradualmente disminuyó entre las zonas 2 y 5 del epidídimo cápita, un resultado que refleja esencialmente la actividad secretora de estos segmentos epididymal21 (figura 1B, C). Por consiguiente, el etiquetado de supranuclear de DNM2 posteriormente mostró corresponden a la distribución del aparato de Golgi dentro de las células principales de caput21. Espermatozoides aislados de la misma región epididymal demostraron intenso etiquetado acrosómica para DNM2 (figura 1). Como una advertencia, sin embargo, equivalente DNM2 etiquetado no fue detectan rutinariamente en luminales espermatozoides dentro de nuestras secciones de tejido. Este fenómeno es que hemos encontrado en varias ocasiones al aplicar una serie de anticuerpos dirigidos a antígenos diferentes/de espermatozoides del epidídimo y presumiblemente se presenta debido a problemas asociados a la presentación del antígeno y/o enmascaramiento en la secciones de tejido embebido en parafina. En cualquier caso, tales diferencias enfatizan la importancia de realizar etiquetado inmunofluorescente paralelo de espermatozoides aislados junto con el del propio tejido Epididimal. Difiere DNM1 y DNM2, la isoforma DNM3 se detectó principalmente en el dominio apical de un pequeño número de caput células epiteliales (figura 2B, las flechas verdes), que corresponde a la subpoblación de células claras por etiquetado Co con el marcador de células claras reconocidas, ATP6V1B1 (figura 2B, flechas rojas). De manera similar, marcadores representativos que han demostrado ser adecuados para diferenciar los tipos de células epiteliales epididymal diferentes se resumen en la tabla 229,30,31 , 32 , 33 , 34.
Además de la descripción de las técnicas para la localización subcelular de las proteínas que se encuentra en el epitelio Epididimal, también presentamos nuestros protocolos recientemente optimizados para el estudio de las proteínas secretoras encapsulado dentro de epididymosomes, pequeñas vesículas extracelulares que representan un componente importante del ambiente luminal responsable para apoyar la maduración y almacenamiento de espermatozoides22. Combinado, paso 2 y figura 3 proporcionan una descripción detallada paso a paso de la metodología utilizada para el aislamiento de poblaciones altamente enriquecidos de epididymosomes del tejido Epididimal de cabeza de ratón. En particular, sin embargo, estos métodos son fácilmente aplicables para el aislamiento de poblaciones alternas de epididymosomes procedentes de segmentos más distales de epidídimo. Debido a la posibilidad de contaminación de estas muestras, también se describen los protocolos de caracterización rigurosa que habitualmente empleamos para cada preparación de epididymosome. Estos incluyen la evaluación del tamaño y heterogeneidad de las poblaciones de epididymosome utilizando técnicas de dispersión dinámica de luz y microscopia electrónica de alta resolución. Paralelamente, también utilizamos estrategias de immunoblotting para evaluar el enriquecimiento de vesículas extracelulares reconocidos marcadores y la correspondiente ausencia de proteínas que son características de los contaminantes potenciales (es decir., la hemoglobina (HBB) como un marcador de contaminación de la sangre y anti-araquidonato 15-lipooxigenasa (ALOX15) y anticuerpos anti-IZUMO1 como marcadores de gota citoplasmática y la contaminación de la esperma, respectivamente)22. Aunque hemos encontrado que los contaminantes son raros, si ellos se encuentran, inmediatamente desechamos la preparación epididymosome.
La localización no superpuestos de las isoformas de la DNM en el epidídimo de la cabeza llevó una investigación adicional de sus papeles potenciales en la regulación del microambiente epidídimo. Para ello, una línea de células inmortalizadas mECap18 fue utilizada como modelo para estudiar la actividad secretora de las células epidídimo en vitro . Caracterización anterior de esta línea celular ha demostrado que alberga una población de mezclado de la célula, que tinción positiva para cualquiera de los dos marcadores de células principales o claras. Por otra parte, las células mECap18 también han demostrado convenientes para reportar perfiles fisiológicos de expresión de gene y proteína Epididimal bajo diferentes en vitro tratamiento regímenes35. Antes de su uso, localización DNM se evaluó en las células mECap18 cultivadas por colocar estas sobre cubreobjetos Tratado de poli-l-lisina (figura 5A) y sometiéndolos a detección de inmunofluorescencia. Consistente con los patrones de distribución en secciones de tejido Epididimal de caput, DNM1 fue detectado por todo el citoplasma de las células mECap18, mientras DNM2 se concentró dentro del dominio supranuclear de estas células y DNM3 se caracterizó por la discreta focos de coloración dentro de una serie de subpoblación pequeña de la membrana (es decir., 11%) de las células de mECap18 que eran ATP6V1B1 positivo (figura 5B). Estos datos afirman la utilidad de la línea celular de mECap18 como un recurso valioso para investigar el papel de la DNM en la regulación de la actividad de secreción/absorción las células epidídimo.
Por consiguiente, paso 4 describe la metodología para el análisis de la actividad secretora de la célula de mECap18; las técnicas que son susceptibles de ampliamente para evaluar el impacto de una variedad de diferentes condiciones experimentales. En nuestro estudio, se aplicaron intervenciones farmacológicas selectivas para suprimir la actividad de DNM1 y DNM2 antes de la visualización y cuantificación del perfil de proteínas liberadas de las células mECap18 en medio acondicionado21. Una característica importante de este análisis, sin embargo, era asegurar que las células mECap18 bien lavadas y cultivadas en ausencia de suplementación de FBS. Mientras que este paso era esencial para evitar la contaminación del medio condicionado con FBS derivados de proteínas, sin embargo lleva el riesgo acompañante de impactando negativamente el crecimiento de las células mECap18 o viabilidad. En el control de esta posibilidad, observamos que la línea celular de mECap18 tolerado cultura libre FBS y la introducción de los inhibidores de la DNM para la duración de nuestra ventana de incubación (es decir., 12 h). De hecho, en este transcurso de tiempo, viabilidad celular mantenido por encima del 90% en todas las repeticiones experimentales. Este enfoque podría servir por tanto como una estrategia de prueba de concepto útil para identificar la función de proteínas específicas de epidídimo antes de comprometerse a la inversión en estrategias de manipulación génica.
| Calentar la solución de recuperación del epítopo inducido | citrato de sodio 10 mmol/L | 50 mmol/L Tris (pH 10.5) |
| Tiempo | 3 min | 3 min |
| 6 min | 6 min | |
| 9 min. | 9 min. | |
| 12 min | 12 min |
Tabla 1 : Condiciones generales para la optimización de la recuperación de antígeno provocado por el calor para el uso con secciones parafina-encajadas de epididymal. El proceso de fijación puede ser problemático como epitopos diferentes a menudo requieren el uso de técnicas de fijación diferentes, de tal modo, que hacía necesario que la metodología está optimizada para cada antígeno.
| Tipo de célula epitelial | Distribución | Marcador | Referencias (PMID) |
| Célula principal | Epidídimo entero | AQP9 | 11027599, 17360690 |
| Claro de la célula | Caput, corpus y cauda | V-ATPasas, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
| Células basales | Epidídimo entero | CLDN1 | 11159859, 21441423 |
| Angosta celda | Segmento inicial | V-ATPasas, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
Tabla 2 : Representante marcadores adecuados para la detección de tipos de células epiteliales epididymal primaria diferentes.
Figura 1: expresión espacial de la DNM 2 dentro del epidídimo de ratón proximal. (A) modelo esquemático del epidídimo que repartir en el epidídimo de ratón en 10 zonas físicamente separadas tabiques según Turner y colegas20. En este modelo, la zona 1 se corresponde con el segmento inicial, zonas 2-5 corresponden al epidídimo de la cabeza, zonas 6 y 7 corresponden al epidídimo corpus y zonas 8-10 representan el epidídimo cauda. (B-C) Localización de inmunofluorescencia de DNM2 reveló patrones de distribución de zona específica (indicados por flecha y punta de flecha blanca). La frontera entre la zona 1 y 2 está delimitada por una línea punteada o indica con flechas amarillas. (D) DNM2 también se expresa en el dominio peri-acrosómica de los espermatozoides aislados desde el epidídimo de la cabeza. Sin embargo, ninguna tal coloración fue detectada rutinariamente en espermatozoides luminales en las secciones correspondientes del epidídimo. EP, las células epiteliales; l, luz; NEG, control único anticuerpo secundario. Experimentos se replicaron en material de tres animales y se presentan imágenes representativas de la inmunofluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: detección de inmunofluorescencia de DNM 1 y 3 de la DNM en el epidídimo de ratón cabeza. (A) la localización de DNM136 fue examinada en el epidídimo de la cabeza de ratón. (B) co-localización de DNM336 y el marcador de células claras, ATP6V1B137 en el epidídimo de la cabeza de ratón. Este análisis confirmó que ambos DNM3 (flechas verdes) y ATP6V1B1 (flechas rojas) reside en la subpoblación de células claras sino mostrar la mínima superposición celular. EP, las células epiteliales; int, intersticio; l, luz; SP, esperma; NEG, control único anticuerpo secundario. Los núcleos de célula fueron contratinción con DAPI (azul). Experimentos se replicaron en material de tres animales y se presentan imágenes representativas de la inmunofluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: esquema de protocolos de aislamiento utilizados para el enriquecimiento de ratón caput epididymosomes. Después de la disección, caput epididymal tejido es sumergido en una gota de medio BWW e incidida para liberar el contenido luminal. Luego se filtra el fluido luminal a través de una membrana μm 70 y la suspensión resultante se centrifuga a aumentar la velocidad para cualquier residuo de células residuales de la pelotilla. La suspensión despejada es entonces cargada encima de un gradiente de densidad discontinuo (iodixanol solución) y somete a ultracentrifugación durante la noche. Partición de Epididymosomes en fracciones 9-11, que son, lavado por dilución en PBS y regresó a la ultracentrífuga para la epididymosomes de la pelotilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: evaluación de pureza epididymosome. Doce fracciones iguales fueron recuperados después de la ultracentrifugación del gradiente y una alícuota de cada preparado de proteína (A) y cuantificación de RNA, (B) evaluación de la heterogeneidad del tamaño mediante dispersión de luz dinámica y (C). análisis de immunoblot de marcador epididymosome. Medidas de caracterización adicionales incluyen (D) doble etiquetado de epididymosomes concentrado en gotas de látex de aldehído/sulfato, evaluación de la microscopia electrónica de transmisión (E) y (F) evaluación de immunoblot de espermatozoides (Espermatozoides) y células de sangre rojas (RBC) contaminación mediante anti-araquidonato 15-lipooxigenasa (ALOX15, contaminación de la gota citoplasmática/espermatozoides) o la hemoglobina (HBB, contaminación de RBC). Immunoblots también fueron probados con carga conocida epididymosome (subunidad reguladora de una no-ATPasa de proteasoma 26S 7, PSMD7; calor choque proteína 90kDa miembro de beta 1, HSP90B1; y tubulina beta, TUBB). Estos datos fueron publicados originalmente en informes científicos (PMID: 27549865) y se han reproducido aquí con el permiso de la editorial, naturaleza de Springer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: detección de inmunofluorescencia de DNM isoformas en células mECap18 revelar patrones de distribución que estén de acuerdo con los detectados en el tejido Epididimal caput. (A) esquema de preparación de cubreobjetos para cultivo celular de mECap18 estéril. (B) imágenes de inmunofluorescencia representante de DNM manchas patrones de distribución de celulares reveló (las flechas y la inserción (etiquetado dual de DNM3 y marcador de células claras ATP6V1B1)) que duplican a los detectados en las secciones de tejido Epididimal. Los núcleos de célula fueron contratinción con yoduro de propidio (PI; rojo) o con DAPI (azul). Experimentos se replicaron en material de tres animales y se presentan imágenes representativas de la inmunofluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Estos estudios incorporan el uso de tejido de epidídimo fijo de Bouin que había sido objeto de inclusión en parafina y protocolos de seccionamiento. Solución fijador de Bouin compone de una mezcla de formaldehído, el ácido pícrico y el ácido acético, con cada componente tiene una función específica y complementaria. Por lo tanto, formaldehído reacciona con aminas primarias para formar enlaces cruzados proteína, ácido pícrico penetra lentamente el tejido formando sales y por lo tanto, la coagulación de proteínas básicas y por el contrario, el ácido acético rápidamente penetra el tejido y provoca la coagulación de la ácidos nucleicos. Estas propiedades combinadas han engendrado de Bouin como fijador de elección para la preservación de detalles morfológicos y su uso es ampliamente divulgado en la literatura de epidídimo. Sin embargo, la solución de Bouin no es sin sus limitaciones, que incluyen la propensión para fluorescencia inducida fijador y formaldehído inducida por Cross-linking que puede enmascarar los antígenos target.
El potencial para la fluorescencia de fondo requiere el uso estrictos controles negativos, que en nuestros estudios incluyen la omisión del anticuerpo primario, omisión del anticuerpo secundario, y donde los reactivos están disponibles, el uso de anticuerpos primarios preabsorbed contra el péptido inmunizante de la cual se generaron. Detalles de la aplicación de dichos controles son ejemplificados en nuestro anterior estudio de la expresión de DNM Dinamina en el epidídimo de ratón21. Idealmente, estos resultados también deben validarse mediante el uso de tejido de animales knockout, sin embargo, este material no siempre está fácilmente disponible. En la búsqueda de contrarrestar el problema secundario de antígenos blanco reticulado o químicamente modificado, es con frecuencia necesario realizar algún tipo de recuperación de antígeno para desenmascarar a epítopos alterados por fijación y restaurar así su potencial para el anticuerpo enlace. La metodología utilizada para la recuperación depende de muchas variables, incluyendo el antígeno Diana, anticuerpos, tipo de tejido y el método de fijación. No obstante, las técnicas más ampliamente adoptadas incluyen la aplicación de cualquier recuperación de antígeno inducida mediada por calor o proteolítica. Las anteriores características como nuestro enfoque favorecido debido a una mayor tasa de éxito para restaurar el immunoreactivity, con los detalles de los regímenes de calor y soluciones de recuperación que utilizamos comúnmente está documentado en la tabla 1. Sin embargo, advertimos que esto no es una lista exhaustiva y, en definitiva, la optimización de la recuperación de antígeno para cada combinación de blanco/anticuerpo proteína requiere estudios preliminares usando una matriz de combinaciones de tiempo, temperatura y pH. Consideraciones adicionales incluyen el potencial para la recuperación de calor provocar daño tisular o causa etiquetado artefactual. Así, además de la aplicación de los controles negativos documentados anteriormente, habitualmente incorporan controles positivos con anticuerpos tales como anti-Golgin-97, que reconocen los distintos orgánulos celulares.
Tratando de establecer si las proteínas tales como perteneciente a la familia DNM cumplan redundante, en comparación con funciones complementarias, en el tejido Epididimal, hemos encontrado lo especialmente informativo para llevar a cabo dos experimentos de etiquetado tales como ilustrado en la figura 2B. Esta estrategia implica etiquetado secuencial de las secciones de tejido con pares de anticuerpos primarios (levantados en diferentes especies) seguidos apropiados anticuerpos secundarios conjugados a diferentes fluoróforos. Sin embargo, una confusión que en ocasiones se presenta en la búsqueda de realizar estos estudios de etiquetado doble es la incompatibilidad de los protocolos de recuperación de antígeno necesario para etiquetado óptimo con cada anticuerpo primario. Esta limitación se ha encontrado en el caso de co etiquetado de DNM 2 y Golgin-97 en el epidídimo de cabeza de ratón, que nos lleva a utilizar las secciones seriales consecutivos (en oposición a la misma sección)21. Sin embargo, cualquiera de estos enfoques son extremadamente útil en el contexto de atribuirle la expresión de la proteína a un tipo de célula particular entre los que se representan en el seudoestratificado epitelio Epididimal. Con este objetivo en mente, hemos incluido una lista de marcadores de tipo representativo de la célula y sus patrones de distribución reportados a lo largo de la longitud de los túbulos epididymal (tabla 2). Cuando uno desea ir más allá del tipo de la célula y comienzan a explorar la distribución subcelular de las proteínas de la blanco, el uso de doble etiquetado con marcadores de organelo reconocidos, tales como Golgin-97, ofrece claras ventajas. Por otra parte, la aplicación de microscopía de alta resolución junto con el etiquetado de immunogold sigue siendo el método de elección para la localización ultraestructural detallada y validación de manchar patrones alcanzados usando inmunofluorescencia21 .
Entre las limitaciones que plantea el estudio de la epididymosomes son su pequeño tamaño y la dificultad de obtener cantidades suficientes para los análisis de punto final detallada, particularmente en comúnmente utiliza especies de laboratorio como el ratón. Sin embargo, capitalizando los estudios pioneros de Sullivan y colegas38,39,40, hemos podido optimizar robusta metodología para el aislamiento de epididymosome del ratón modelo (ver paso 2). Estrés, sin embargo, la necesidad de imponer estrictos controles a evaluar y las características físicas de los epididymosome enriquecido poblaciones41 debido a la contaminación potencial de los espermatozoides, gotas citoplásmicas o hematógenas exosomas ( Ver figura 4). Para este propósito, habitualmente utilizamos una combinación de: (i) alta resolución microscopia electrónica para visualizar el tamaño y la heterogeneidad de la preparación de epididymosome, (ii) el cálculo de la media de la partícula tamaño y heterogeneidad (iii) concentración de la epididymosomes sobre 4 μm aldehído/sulfato látex y etiquetado fluorescente de reconocido exosomas marcadores de superficie, incluyendo CD9 y FLOT1, y (iv) immunoblotting de epididymosomes aislados con una serie de anticuerpos se recomienda para experimental validación de exosomas (por ej., anti-CD9, anti-FLOT1), así como la negativa controles correspondientes a los antígenos que deberían limitarse a espermatozoides (anti-IZUMO1), gotas citoplasmática de esperma (anti-ALOX15) o sangre (anti-HBB)22. Si estas normas se cumplen, entonces las preparaciones de epididymosome aisladas son fácilmente susceptibles para su uso en aplicaciones posteriores, incluyendo la incubación con espermatozoides o perfiles de cargo analizan22,42, que son enfoques de gran alcance para mejorar nuestra comprensión del papel de epididymosomes en la regulación de la maduración de espermatozoides del epidídimo1.
En este estudio, describimos el uso de una línea celular inmortalizada de SV40 ratón caput epitelio Epididimal (mECap18) que hemos utilizado para estudiar la implicación de la DNM en la regulación de la actividad secretora epididymal21 así como el impacto de tóxicos ambientales en la fisiología del epidídimo43. Una característica importante de la línea celular de mECap18 es que muestra estabilidad fenotípica entre pasajes y características de una población representativa de ambas células principales y claro21,35,44. En comparación con cultivos celulares primarios de epidídimo, la línea celular de mECap18 también muestra tolerancia al cultivo en suero de ternera fetal medio libre, que se extiende la duración y naturaleza de las intervenciones experimentales de estas células puede estar expuesto a, mientras que también siendo permisiva de la recuperación de una mayor abundancia de proteínas secretadas desde el medio condicionado. Una limitación de la línea celular de mECap18, sin embargo, es que ha sido inmortalizado y así pueden responder diferentemente al estrés y / o estímulos relacionados con el inmunes en comparación con el que de célula primaria las culturas o las células presentan en vivo. Con esta limitación en mente, se recomienda comparar los resultados obtenidos con las células mECap18 en vivo las respuestas siempre que sea posible. En Resumen, los protocolos que describen destacan la utilidad de esta línea celular como una herramienta con la que empezar a estudiar la funcionalidad de las proteínas de la blanco en el epidídimo de la cabeza. De hecho, en combinación con el uso de inhibidores de proteína comerciales o las herramientas de edición de genoma (como CRISPR-Cas9), la línea celular de mECap18 tiene un potencial considerable para ayudar a resolver la base mecanicista de la función del epidídimo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer la National Health and Medical Research Consejo de Australia proyecto Grant APP1103176 de apoyo a este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
References
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