Summary
Burada, proteinler parafin gömülü fare epididimal bölümlerde yer tespiti ve bu bir ölümsüzleştirdi epididimal hücre hattı (mECap18) iletişim kuralları göstermek için dynamin ayirt lokalizasyonu raporu. Ayrıca izolasyon epididimal sıvı ve şartına hücre medya salgı proteinlerin protokollerde açıklar.
Abstract
Memeli epididim biri herhangi bir endokrin bezinin en karmaşık intraluminal sıvıların sonrası testis olgunlaşma ve sperm hücreleri depolanmasını desteklemek üzere oluşturur. Bu karmaşıklık kombine salgı ve dinsel etkinliği astar epitel hücreleri nedeniyle ortaya çıkar. Burada, biz dynamin (DNM) mechanoenzymes modeli protein ailesi de odaklanarak epididimal protein sentezi ve salgı analizi için teknikler tarif; Çift yönlü membran kaçakçılığı olayları düzenleyen potansiyeline sahip büyük GTPases. Protein ifade epididimal doku çalışma için biz hedef proteinlerin parafin gömülü bölümlerde ve bu proteinler kayma dağılımını izleyen tespiti ayirt etiketleme için sağlam metodoloji tarif ayirt mikroskobu. Ayrıca izolasyon ve veziküller, sperm hücrelerinin olgunlaşması ile hücreler arası iletişim katılmaya epididimal lümen içine salgılanan epididymosomes olarak bilinen gibi ya karakterizasyonu için en iyi duruma getirilmiş metodoloji açıklar. Tamamlayıcı bir yaklaşım, ayrıca bir fare SV40 ölümsüzleştirilmiş kaput epididimal epitel (mECap18) hücre kültürünü hedef proteinlerin ayirt algılama açıklar. Ayrıca, biz mECap18 hücre satırı yardımcı programı ile, düzenleme, epididimal salgı faaliyet keşfetmek için uygun vitro model olarak tartışıyorlar. Bu amaçla, biz mECap18 hücre kültürünü ve onların salgı protein profil etkileyen özelliği olan seçici farmakolojik inhibisyon rejimlerinin kullanımı için bakım gereksinimleri kodlamayla tanımlamak. Belgili tanımlık ikinci are kolayca şartına kültür orta, salgılanan proteinler trichloroacetic asit/aseton yağış ile konsantrasyon ve onların sonraki analiz SDS-sayfa ve immunoblotting üzerinden hasat ile değerlendirildi. Bu kombine Yöntemler sperm olgunlaşma ve/veya depolama fonksiyonel rollerinin belirlenmesi için bir başlangıç olarak alternatif epididimal protein hedeflerin analizleri için uygun olduğunu iddia.
Introduction
Sperm hücreleri tüm memeli türlerinin ileri aşamalı hareketliliği görüntülemek için ve bir yumurta sırasında uzun süreli düşüşünü epididim, çok özel bir bölge olabilir erkek ekstra testis kanal sistemi ile döllemek için potansiyel elde 7-14 gün (tür bağlı olarak) gezinmek için1. Baba tarafından kromatin aşırı yoğunlaşma ve testis içinde sperm cytodifferentiation eşlik eden sitoplazma çoğunluğu dökülme nedeniyle, onların sonraki fonksiyonel olgunlaşma sadece onların etkileşim tarafından tahrik edilmektedir epididimden microenvironment ile. Bu ortamın sırayla, astar epididimal soma salgı ve dinsel etkinliği tarafından oluşturulur ve olağanüstü bir parça-parça değişimi1düzeyini görüntüler. Böylece, protein sentezi ve salgı açısından en aktif kesimleri epididimlerden (yani, kaput ve corpus)2proksimal kısmında bulunan bunlar. Bu etkinlik sperm, fonksiyonel yetkinlik işaretlerinden görüntülemek için hücreleri ilk başlangıcı ile fonksiyonel profil aynalar (i.e., asit çözündürüldükten zona glikoproteinlerin için bağlama yeteneği ve ilerici hareket) aşağıdaki onların geçit ile kaput epididim3. Bu işlev öznitelikler sperm boşalma için hazırlık içinde sakin bir durumda neyin saklandıkları distal epididimal kesimi (Kauda), ulaştığı en yüksek düzeyleri ulaşmadan önce geliştirmeye devam. Oluşumu ve bu sperm depolama haznesi bakımından da yakından hangi Kauda güçlü dinsel etkinlik4,5tarafından hakimdir astar epitel bağlıdır. Bildirilen6,7,8anatomik farklılıklar olmasına rağmen işbölümü bölgeselleştirilmiş bu tür memeli türlerin çoğunluğu arasında paylaşılan epididim karakteristik gibi görünüyor kendi9,10da dahil olmak üzere bugüne kadar okudu. Nitekim, klinik bir bakış açısından, bu o epididimal disfonksiyon erkek faktör infertilite11böylece bu özel doku Yönetmeliği anlama önemini vurgulayarak, etiyolojisi için önemli bir katkı yapar bilinmektedir.
Bu nedenle anlayışımız epididimal Fizyoloji ve sperm olgunlaşma ve depolama bu doku içinde sıralı aşamalarını düzenleyen mekanizmalar tam olarak çözümlenmesi için kalmasını üzüntü vericidir. Katkıda bulunan faktörler arasında sınırlayıcı epididimal araştırma gelişmeler bu doku genel karmaşıklığı ve bilgi luminal onun microenvironment üzerinde yasal denetim mekanizmaları vardır. Anatomik olarak, biz ötesinde kaput, corpus ve kauda kesimleri ayrım, epididim daha da çeşitli bölgelere (Şekil 1A) ayrılmıştır, her septa12 tarafından ayrılmış ve gen/protein ayrı profilleri tarafından karakterize olduğunu biliyorum ifade13,14,15,16,17,18. Nitekim, ayrıntılı transkripsiyon epididim segmental gen ifadesinde profilleme temelinde, en çok 6 ve 9 ayrı epididimal bölgeleri fare ve sıçan modellerinde, sırasıyla19,20bildirilmiştir. Bu karmaşıklık muhtemelen epididimal soma, çok sayıda farklı hücre türleri oluşan bir pseudostratified epitel bileşimi yansıtır; her yolu uzunluğu boyunca kendi bereket, dağıtım ve salgı/dinsel faaliyetleri ile ilgili olarak farklı. Böylece, asıl farkla en bol epididimal hücre türü tüm epitel hücrelerinin % 80 yukarı oluşturan hücrelerdir. Buna göre asıl epididimal protein biyosentezi ve salgı5hacim için sorumlu hücrelerdir. Buna ek olarak, epididimal soma içinde ikinci en bol bulunan hücre türü olarak rütbe, Açik Hücre nüfus öncelikle luminal bileşenlerinin seçici emme ve bu microenvironment5asitleştirme katılmaktadırlar. Karmaşıklık başka bir katmanı ekleme, androjenler ve diğer lumicrine faktörler testis kökenli onların yolu konumlandırma bağlı olarak bu epididimal hücre türlerinin her biri üzerinde değişiklik kontrol uygulamayın.
Böyle karmaşıklığı tarafından uygulanan sınırlamaları rağmen epididimal fonksiyonu mekanik temeli çözme içine yapılması önemli yayılmakta devam. Bu çalışmalar için bir anahtar ilk anketler arasından seçilen bireysel proteinlerin ayrıntılı analizler ile tandem epididimal Proteom geniş ölçekli stoklar kurmak için gelişmiş kütle spektrometresi stratejileri uygulanması olmuştur. Mechanoenzymes fare modeli21DNM ailesinin son bizim karakterizasyonu bu yaklaşım örnektir. DNM ilk bizim ilgi exo - ve endocytotic süreçlerin kaplin içinde çift kendi eylem tarafından yakıt. Bu gözlemler üzerinde bina, biz DNM (DNM1 - DNM3) üç kurallı izoformlarının çok fare epididim ifade ve protein salgılanması ve emme21 düzenleyici rolleri yerine getirmek için uygun şekilde konumlandırılmış . Ayrıca, biz böylece tamamlayıcı, epididimal epitel21içinde gereksiz, aktivite karşı sahip oldukları öne açıkça onların hücresel ve alt hücresel yerelleştirme temelinde her DNM izoformu ayırt etmek başardık.
Burada, bu bilgi daha geniş uygulama alternatif epididimal proteinler karakterizasyonu bulmak ve böylece katkıda umut ile fare epididim ifadede DNM çalışma için istihdam deneysel yöntemi açıklamak bizim Erkek üreme sistemi önemli bu öğenin işlevini anlama. Özellikle, biz hedef proteinlerin epididimal bölümlerde parafin gömülü ve bu proteinler ayirt üzerinden kayma dağılımını izleyen tespiti ayirt etiketleme için sağlam metodoloji geliştirilmesi tarif mikroskobu. Biz daha fazla yalıtım ve epididymosomes karakterizasyonu için bizim son zamanlarda en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları22 belge; epididimal salgı profili temel unsurları teşkil ve sperm olgunlaşma23teşvik önemli bir rol tutmak için görünen küçük eksozom benzeri veziküller. Tamamlayıcı bir yaklaşım biz de bir ölümsüzleştirdi fare kaput epididimal epitel (mECap18) hücre kültürünü hedef proteinlerin ayirt algılama ve bu kaynak kullanımı ile düzenleme, epididimal keşfetmek için bir model olarak tarif salgı faaliyet içinde vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan doku koleksiyonu içeren tüm deneysel prosedürler Newcastle Üniversitesi'nın hayvan bakım ve Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. ayirt parafin gömülü epididimal bölümlerini (Şekil 1 ve 2) boyama
- Hemen sonra ötenazi CO2 inhalasyon (İsviçre fareler, 8 hafta boyunca) ile yetişkin farelerin, dikkatle (cerrahi makas ve cımbız kullanarak) epididim teşrih bağ dokusu ve yağ örten ücretsiz ve Bouin'ın sabitleştirici bırakın Çözüm (> 10 kat birim/doku ağırlık) gecede fiksasyon için.
- Doku % 70 etanol ile 2 × değişiklik ile her gün 2 gün boyunca yıkama ve infiltrasyon ve parafin blok içine gömmek için hazırlık kademeli etanol (% 70, % 95 ve % 100) kurutmak.
- Parafin blok kalınlığı 4-6 µm ve mount ayirt boyama için hazırlık slaytlarda, bölüm.
- Bir duman başlık, epididimal parafin kesitler ksilen yeterli miktarda tamamen doku bölümü (3 × 5 dk her zaman) sokmak için slayt kavanoz ekleyerek dewax.
- Saf H2O seyreltilmiş kademeli etanol çözümlerinde daldırma tarafından doku bölümleri rehydrate (% 100 etanol 5 dk, 5 dk, % 90 etanol 1 dk, % 80'i etanol 1 dk, % 70 Etanol Etanol % 100 1 dk ve % 50 Etanol 1dk).
- Bir kez yeterli fosfat tamponlu tuz tamamen tüm doku bölümü sokmak için (PBS) ile 5 min için bir slayt kavanoz bölümlerde yıkayın (tüm sonraki yıkama için bu yönergeleri izleyin).
- Uygun antijen alma çözüm dikkatle boşaltmak (i.e., 10 mmol/L sodyum sitrat, 50 mmol/L Tris pH 10,5 veya alternatif antijen alma isn'ta bağlı olarak algılanabilmesi için antijen) bir slayt raf ve kaynar kadar mikrodalga. Bu çözüm içine slaytlar bırakın ve doku bölümlerde ısı kaynaklı antijen alma koşulları bireysel antikorlar (bkz. Tablo 1) için en iyi duruma getirilmiş tabi.
Dikkat: emin olun slaytları tam antijen alma işlemi sırasında antijen alma çözümde daldırılır. - Slayt konteyner mikrodalga ve serin oda sıcaklığına çıkarın.
- PBS ile slaytlar durulama ve doku bölümü sıvı keşfedilmeden slayt marker kalem izlemek için kullanın.
- Slaytlar (kapsayıcı temelini ıslatılmış bir doku tarafından oluşturulan) bir oksijen kapsayıcı yerleştirin ve engelleme çözümü uygulamak (% 3 BSA/PBS, daha önce filtre 0,45 µm filtreden) 37 ° C'de 1 h için
- Bir kez PBS ile slaytlar durulayın.
- Filtre uygulanan % 1'deneysel olarak en iyi duruma getirilmiş bir konsantrasyon için seyreltilmiş uygun birincil antikor ile bölümleri kuluçkaya BSA/PBS gecede 4 ° C'de (anti-DNM1, DNM2 ve DNM3 için 1:60 antikorlar; 1: 100 için anti-ATP6V1B1 antikor, malzemeler tablo bkz: antikor Ayrıntılar için).
Not: ayırt etmek için non-spesifik antikor bağlama, belirli bu sıkı negatif eklemek gereklidir (i.e., ikincil antikor tek, birincil antikor peptid immunizing karşı preabsorbed) ve pozitif denetimleri24. - Slaytları, oda sıcaklığında 30 dakika yerleştirerek ısıt.
- PBS ile slaytlar 3 × bir platformda sallayarak (60 rpm) 10 dakika yıkayın.
- %1 içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikor ile bölümleri kuluçkaya BSA/PBS için 1 h 37 ° C'de (0,45 µm filtreden filtre) (1: 400 seyreltme için tüm ikincil antikorlar, görmek Tablo reçetesi antikor Ayrıntılar için).
Dikkat: slayt konteyner bu adımından itibaren karanlıkta bırakın. Çift etiketleme için ikincil antikorlar uyumlu birleşimini seçin (i.e., ikincil antikorlar gerekir yükseltilmiş oldu farklı türler). - PBS ile slaytlar 3 × bir platformda sallayarak (60 rpm) 10 dakika yıkayın.
- Propidium iyodür (PI, 7.48 μmol/L) ya da 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) hücre çekirdeği etiketlemek için oda sıcaklığında 2 min için bölümlerle counterstain.
- PBS ile iki kez slaytlar bir platformda sallayarak (60 rpm) 5 dakika yıkayın.
- Mowiol 4-88 hazırlanan % 30 gliserol 0.2 mol/L Tris (pH 8,5) içinde bir çözümde % 10 bölümlerle mount ve %2.5 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-oktan.
- Tırnak vernik ile coverslip mühür ve gelecekteki gözlem için 4 ° C'de slaytları depolama.
Dikkat: Bu görüntüleme slaytların sürede pratik olarak sonra aşırı floresan kaybı olmaması için hazırlık yapmak önerilir.
Epididymosomes fare kaput epididimlerden (Şekil 3) üzerinden 2 yalıtım
- Hemen yolu ile CO2 inhalasyon (İsviçre fareler 8 hafta boyunca) yetişkin fareler ötenazi sonra onların damarlara (37 ° C-kan kirlenme epididimal dokusunun en aza indirmek için önceden ısındı) PBS ile sıvı.
Dikkat: kan plazması farklı nüfus epididymosomes25benzer büyüklükte olan exosomes içerir. Kan izni epididimal dokusundan etkinliğini erişilebilir ilk kesimi muayene ile son derece bozukluklarına epididimal segment bulunan proksimal kaput bölümüne (i.e., 1 Şekil1a bölge) - Dikkatle yüzey için herhangi bir potansiyel azaltmak için epididimlerden örten yağ ve bağ dokusu ve durulama ücretsiz değiştirilmiş Biggers, Whitten ve Whittingham ile orta (BWW; pH 7.4, osmolalite 300 mmol/kg su26,27) incelemek kan kirlenme.
- Aşırı medyayı çıkarın, kaput epididim incelemek için epididimal doku leke (i.e., 2-5 içinde Şekil 1Abölgeleri) ve BWW orta içeren transfer taze Petri kabına (35 × 10 mm). Orta miktarda final kurtarma için yeterli olduğundan emin olun.
Not: 6 kaput epididymides için eşit olarak bölünmüş ve sonra üstüne (bkz. Adım 2,9) 2 önceden hazırlanmış degradeler uygulanan ~ 900 µL bir iyileşme için izin vermek için orta 1.1 mL kullanmak için önerilir. - Bir tıraş bıçağı ile kaput doku içine küçük kesiler bir dizi yapmak. Doku kıyma değil ve böylece aşırı sitozolik içeriği ile örnek kirletici önlemek. Hafif ajitasyon luminal içeriği serbest bırakmak 30 dk 37 ° C'de dokuyla içeren plaka kuluçkaya.
- Sonuç süspansiyon hücresel enkaz kaldırmak için 70 µm membran aracılığıyla filtre.
- Filtrate toplamak ve bu Art arda aralıklarla adımları 4 ° C'de hücresel enkaz ortadan kaldırmak için hızı artan tabi (i.e., 500 × g, 2.000 × g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min her; 17.000 × g 20 dk ve nihayet 17.000 × g ek bir 10 dk ya kadar hiçbir Pelet Santrifüjü sonra oluşturulur).
Dikkat: Pelet rengini çok az kan kontaminasyon mevcut olduğundan emin olmak için ilk 500 × g Santrifüjü adımdan sonra değerlendirmek önemlidir. Herhangi bir örnek bu pelet pembe rengi görüntülediği atmak. - Kesintili iodixanol gradyanlar (%40, % 20, % 10, % 5 katmanları oluşan) (%60 (w/v) sulu iodixanol oluşan) bir yoğunluk gradient orta sulandrarak 0,25 mol/L sukroz ve 10 mmol/L Tris (pH 7.5) bir çözüm ile hazırlayın.
- Bir ultracentrifuge tüp (11 × 35 mm), degradede 450 µL (Şekil 3) her kısmını hazırlamak. Degrade sonra her kesir uygulanması arabirimler epididimal sıvı örnek yükleme öncesinde her katmanı arasında başarıyla oluşturulur emin olmak için kontrol edin. Her degrade taze kullanım, günde ancak hazırlamak, epididimal luminal sıvı örnek 4 ° c için en fazla 2 saat yükleme öncesi korunmuş.
- Dikkatle (malzeme toplanan 3 epididymides caput karşılık) epididimal luminal sıvı süspansiyon, tek bir geçişin 450 µL ekleyin.
- Ultracentrifuge 160.000 × g 18 h için 4 ° C'de, degradeleri.
Dikkat: Bu Santrifüjü çok yüksek hızda yapılır beri bütün ultracentrifuge tüpler eşleştirilmiş ve olmalı tam olarak dengeli. Tüpler kendi bütünlüğünü tehlikeye atabilecek görünür herhangi bir hasar ücretsiz olduklarından emin olmak için denetleyin. - Yavaşça çıkarın 12 eşit kesirler (her 185 µL oluşan) en üst katmandan başlayarak ve degrade altına doğru ilerliyor. Her degrade varsa kurtarılan eşdeğer kesirler (en çok iki degradeler) havuz.
Not: epididymosomes en çok kesirler 9-1122zenginleştirilmiş fare Şekil 4 ve tartışma bakın. - Kurtarma ve kesirler 9-11, havuzu sonra 2 mL PBS ve ultracentrifuge örnekleri epididymosomes cips için 100.000 × g için 3 saat 4 ° C'de (13 × 56 mm tüp) adlı oranında seyreltin.
Dikkat: epididymosome Pelet görmek zor olabilir bu yana, onlar rotor yerleştirilir ve epididymosome Pelet bekleyen konumunu belirtmek için tüp işaretlemek gibi tüpler yönünü kaydetti olun. Her tüpün yeterli hacim içerdiğinden emin olun (i.e., % 50'sini toplam kapasitesini aşan) tüp çökmesi riskini önlemek için. - Dikkatle Aspire edin ve süpernatant epididymosome Pelet bozmadan.
- Epididymosome saflık (Şekil 4) değerlendirmek.
- Epididymosome Pelet aşağı akım uygulamaları göre istenen orta içine resuspend. Örneğin, BWW orta genellikle sperm hücreleri veya alternatif olarak uygun lizis arabellek epididimal Proteom SDS-sayfa yolu ile çözümlenmesi için hazırlık ile ortak kuluçka içeren deneyler için kullanılır.
3. ayirt Staining mECap18 hücre
- Steril coverslips hazırlanması (bir hücre kültür mahallede yapılacak)
- Coverslips (12 × 12 mm) % 70 etanol için 10 dk içinde ıslatın ve etanol lamba yukarıda yüksek sıcaklık altında kurutma tarafından dezenfekte.
- Coverslip 10 için serin s 12 iyi plakasına aktarmadan önce.
- Steril poli-L-lizin çözüm coverslip kapak ve oda sıcaklığında 10 dakika için yerleşmek için geçerlidir.
- Poli-L-lizin çözüm atmak ve coverslip steril H2O ile durulayın ya da uygun orta.
- Hazırlık mECap18 hücreleri
- 2 × 105 mECap18 hücrelerde her şey coverslips içeren 12 iyi plaka aliquots geçiş.
- MECap18 hücre Orta (%1 L-glutamine, % 1 Sodyum pyruvate, % 1 penisilin/streptomisin ve 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN takıma DMEM) içeren % 10 fetal buzağı serum (FBS) atmosfer % 5 altında 37 ° C kuluçka hücrelerle kültür CO2 gece.
- Sonra hücreleri coverslip için uygun, orta atın ve hücreleri iki kez PBS ile durulayın.
- Tüm coverslip bırakın ve 15 dakika oda sıcaklığında hücreleri saptamak için PBS içinde seyreltilmiş yeterli miktarda % 4 paraformaldehyde (PFA) ekleyin.
- İngiltere'de yılın çözüm atmak ve coverslips iki kez PBS durulayın.
- Ayirt boyama
- MECap18 hücreleri % 0,1 daldırma tarafından permeabilize Triton X-100 PBS için 10 dk içinde.
- Coverslips PBS ile yıkayın.
- MECap18 hücreleri % 3 BSA ile engellemek ve immunolabeling epididimal doku bölümleri için açıklananlara eşdeğer protokolleri kullanan hücre ile devam edin.
4. yalıtım şartına hücre kültür ortamdan proteinlerin
- Klimalı hücre kültür orta topluluğu
- Geçit aliquots hücrelerinin 4 × 105 mECap18 6 her şey de plaka ile mECap18 hücre orta % 10 ile desteklenmiş FBS 24 h için.
- MECap18 hücreleri üç kez mECap18 hücre Orta (FBS hazırlanmış) ile kalan FBS ve ilgili kaldırmak için yıkama protein kirletici.
- Her şey için mECap18 hücre Orta (FBS hazırlanmış) 1,5 mL ekleyin ve 37 ° C kuluçka altında %5 12 h için mECap18 hücreler kuluçkaya CO2.
Not: Bu adımda mECap18 hücreleri için farklı bir hedef antijenleri deneysel tasarım göre tespit edilebilir. - 12 h kuluçka sonra hücre orta ve santrifüj 2.000 × g tüm hücresel enkaz kaldırmak 10 dk de toplamak.
Not: Kuluçka süresi uygun olarak deneysel tasarım/bitiş noktası değerlendirme ve hücrenin tolerans uygulanan treatment(s) için söz konusu değiştirilmesi yapabiliyor. Bu en iyi sonuçları elde emin olmak için belirli deneysel rejimleri göre kuluçka zamanlaması terzi için tavsiye edilir. - MECap18 hücre canlılığı bir standart trypan mavi dışlama tahlil28uygulanması yoluyla değerlendirmek. Tüm malzemesini içinde % 90 ölü ya da can çekişen hücrelerden serbest proteinler tarafından tanıtıldı önyargı ortadan kaldırmak için aşağıda hücre canlılığı reddetti.
- Aşağıdaki gibi proteinler hücre ortamdan izole veya orta-80 ° C'de korumak
- Protein yalıtım (duman mahallede yapılacak)
- Soğutulmuş % 100 trichloroacetic asit hacmi % 20 kültürlü mECap18 hücrelerden serbest protein çökelti şartına cep orta hacmi % 80'i ekleyin. 4 ° C'de gecede sürekli karıştırma ile kuluçkaya.
- Kuluçka sonra zarlarını protein Santrifüjü tarafından cips (17, 000 × g, 10 min için 4 ° C).
Not: Orta salgılanan bekleniyor protein sınırlı miktarı nedeniyle, Pelet kolayca Santrifüjü sonra görüntülenmeyecektir değil ki mümkündür. Bu nedenle doğru biçimde Santrifüjü önce tüp yönlendirmek ve bekleyen Pelet konumu süpernatant kaldırılması sırasında bozmamaya özen için şarttır. - Süpernatant atmak ve Pelet iki kez yeniden Santrifüjü önce soğutulmuş aseton ile yıkayın (17, 000 × g, 10 min için 4 ° C).
- Dikkatle kaldırmak ve süpernatant bir duman başlık içinde herhangi bir kalıntı aseton air-drying önce.
- Bir uygun ayıklama arabellek tam salgı protein profilleri ve/veya bireysel hedef proteinler algılamak bitiş noktası analizi için hazırlık içinde protein Pelet resuspend (Örn., SDS-sayfa, immunoblotting).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resim 1 ve Şekil 2 fare kaput epididim DNM ayirt yerelleştirme temsilcisi sonuçlarını göster. Her biri üç DNM izoformlarının görüntü farklı yerelleştirme profilleri araştırıldı. Böylece, DNM1 ilk segment ve kaput epididimlerden (Şekil 2A) boyunca epididimal hücrelerinin nispeten mütevazı diffüz etiketleme ile karakterizedir. Buna karşılık, DNM2 izoformu ilk hücreleri ilk segmentteki rakip bazal ve apikal kenarlığını çevresinde bitişik aşağı akım kaput segmentin içindeki hücreler, supranuclear etki alanına yeniden konumlandırılmış önce tespit edildi (i.e., 2-5 bölgeleri) (resim 1B, C). Özellikle, ancak, yavaş yavaş etiketleme DNM2 yoğunluğunu kaput epididim, esasen bu epididimal kesimleri21 (Şekil 1B, C) salgı faaliyet aynalar bir sonuç dilimleri 2 ile 5 arasında azalmıştır. Buna göre supranuclear DNM2 etiketleme daha sonra Golgi aygıtı kaput asıl hücreler21içinde dağıtım karşılık gelecek şekilde gösterildi. Spermlerin epididimden aynı bölgeden izole gösterdi yoğun acrosomal DNM2 için etiketleme (Şekil 1 d). Bir uyarı, ancak, eşdeğer DNM2 etiketleme rutin olarak bizim doku bölümleri içinde luminal sperm hücreleri üzerinde algılanmadı. Bir biz karşılaşılan çeşitli vesilelerle bir dizi farklı epididimden sperm/antijenleri hedefleme antikorlar uygularken ve muhtemelen antijen sunumu ile ilişkili ve/veya içinde maskeleme sorunlar nedeniyle ortaya çıkar bu olgudur Parafin gömülü doku bölümler. Her durumda, bu tür farklılıklar paralel immünfloresan bu epididimal dokusunun yanında izole sperm etiketleme iletken önemini vurgulamak. Hem DNM1 hem de DNM2 farklı, DNM3 izoformu esas olarak birlikte etiketleme tarafından açik hücre alt popülasyona karşılık gelecek şekilde gösterildi kaput epitel hücreleri (Şekil 2B, yeşil ok), az sayıda apikal etki alanındaki algılandı tanınan Açik Hücre marker, ATP6V1B1 ile (Şekil 2B, kırmızı oklar). Benzer şekilde, tablo 229,30,31 ' farklı epididimal epitel hücre tipleri differentiating için uygun kanıtlamıştır temsilcisi işaretleri özetlenmiştir , 32 , 33 , 34.
Epididimal epitel içinde bulunan proteinlerin hücre altı yerelleştirme için teknikleri açıklaması ek olarak, burada, aynı zamanda bizim son zamanlarda en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları içinde kapsüllü salgı proteinlerin çalışma için raporu epididymosomes, sperm olgunlaşma ve depolama22destekleyen sorumlu luminal çevre önemli bir bileşeni temsil küçük hücre dışı veziküller. Birlikte, adım 2 ve Şekil 3 epididymosomes fare kaput epididimal dokusundan zenginleştirilmiş nüfus yalıtım için kullanılan metodolojinin detaylı bir adım adım hesabı sağlayın. Özellikle, ancak, bu yöntemlerin kolayca diğer nüfus daha distal epididimal kesimleri kaynaklanan epididymosomes yalıtım için geçerlidir. Bu örneklerin kirlenme potansiyeli nedeniyle, Ayrıca biz düzenli olarak her epididymosome hazırlık için istihdam sıkı karakterizasyonu protokolleri nitelendirdi. Bu boyutu değerlendirilmesi ve heterojenlik yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu ve dinamik ışık saçılım teknikleri kullanarak epididymosome örneğin alınma olasılığını içerir. Tandem, biz de tanınan. hücre dışı sivilce işaretlerinin zenginleştirme ve karşılık gelen devamsızlık özelliği olası kirletici olan proteinlerin değerlendirmek için immunoblotting stratejileri kullanmak (i.e., Anti-hemoglobin (HBB) olarak bir kan kirlenme ve anti-arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15) ve anti-IZUMO1 antikorlar sitoplazmik damlacık ve sperm kirlenme, işaretleyici olarak işaret sırasıyla)22. Her ne kadar biz kirleticileri onlar karşılaştıysanız nadir olduğunu bulmuşlardır hemen epididymosome hazırlık atmak.
Kaput epididim DNM izoformlarının üst üste lokalizasyonu epididimden microenvironment düzenlenmesinde potansiyel rolleri bir daha fazla araştırma istenir. Bu amaçla, bir ölümsüzleştirdi mECap18 hücre kültürünü epididimal hücre salgı faaliyet çalışmaya bir vitro model olarak kullanılmıştır. Bu hücre satır önceki karakterizasyonu o hangi için her iki asıl veya açık hücre işaretleri pozitif leke karma hücre nüfus, limanlar göstermiştir. Ayrıca, mECap18 hücreleri de fizyolojik profilleri farklı vitro tedavi rejimleri35altında epididimal protein ve Gen ifadesinin raporlama için uygun kanıtlanmıştır. Kullanımdan önce DNM yerelleştirme kültürlü mECap18 hücrelerde ve onları ayirt algılama için tabi bunlar poli-L-lizin arıtılmış coverslips (5A rakam) üzerine yerleşme tarafından değerlendirildi. Kaput epididimal doku bölümlerinde kaydedilen dağıtım desenleri ile tutarlı, DNM1 mECap18 hücrelerin sitoplazma DNM2 bu hücreler supranuclear etki alanı içinde konsantre oldu ve DNM3 ayrı olarak karakterize edildi algılandı Foci içindeki küçük alt nüfus sayıları boyama membran (i.e., % 11) ATP6V1B1 olan mECap18 hücrelerinin pozitif (Şekil 5B). Bu veri mECap18 hücre satırı yardımcı programı epididimal hücre salgı/dinsel etkinliği düzenleyen DNM rolünün araştırılması için değerli bir kaynak olarak teyit.
Buna göre adım 4 mECap18 hücre salgı faaliyet analizi için metodoloji açıklar; geniş bir dizi farklı deneysel koşullar etkisini değerlendirmek için mükellef bulunmaktadır teknikleri. Bizim çalışmada, biz DNM1 ve DNM2 görsel öğe önce aktivite ve miktar şartına orta21mECap18 hücrelerden serbest protein profilinin bastırmak için seçici farmakolojik müdahaleler uygulanır. Önemli bir özelliği, bu analiz, ancak, mECap18 hücreler iyice yıkanmış ve FBS takviyesi yokluğunda kültürlü sağlamak oldu. Böyle bir adım şartına orta türetilmiş FBS proteinler ile kontaminasyonu önlemek için gerekli iken, yine de mECap18 hücre büyümesi ve/veya canlılığı olumsuz yönde etkileyen görevli riski taşımaktadır. Bu olasılık için kontrolünde, biz mECap18 hücre kültürünü FBS özgür kültür ve DNM inhibitörleri giriş kuluçka penceremiz süresi için tolere kaydetti (i.e., 12 h). Nitekim, bu süre boyunca, tüm deneysel çoğaltır % 90 üzerinde hücre canlılığı kaldı. Bu yaklaşım bu nedenle gen düzenleme stratejileri içine yatırım için taahhütte bulunmadan önce belirli epididimal proteinlerin işlevini tanımlamak için yararlı bir kanıtı-of-concept strateji olarak hizmet verebilir.
| Isı epitope alma çözüm indüklenen | 10 mmol/L sodyum sitrat | 50 mmol/L Tris (pH 10,5) |
| Zaman | 3 dk. | 3 dk. |
| 6 dk | 6 dk | |
| 9 dk. | 9 dk. | |
| 12 dk | 12 dk |
Tablo 1 : Isı kaynaklı antijen alma epididimal bölümleri parafin gömülü kullanılmak üzere en iyi duruma getirme için genel koşullar. Farklı epitopları kez farklı fiksasyon teknikleri, böylece metodoloji her antijen için optimize edilmiştir gerektiren gerektirdiği fiksasyon işlemi sorunlu olabilir.
| Epitel hücre türü | Dağıtım | Marker | Referanslar (PMID) |
| Asıl hücre | Bütün epididim | AQP9 | 11027599, 17360690 |
| Açik Hücre | Kaput, corpus ve kauda | V-ATPases, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
| Bazal Hücre | Bütün epididim | CLDN1 | 11159859, 21441423 |
| Dar hücre | İlk kesimi | V-ATPases, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
Tablo 2 : Temsilcisi işaretleri farklı birincil epididimal epitel hücre tipleri tespiti için uygun.
Şekil 1: DNM 2 kayma ifade proksimal fare epididim içinde. (A) fare epididim üzerinde 10 bölgelere fiziksel olarak bölümleme tasvir epididim şematik modeli septa Turner ve meslektaşlarımız20tarafından bildirildiği gibi ayrılmış. Bu modelde, bölge 1 ilk kesimine karşılık gelen, bölgeler 2-5 kaput epididim karşılık gelir, bölgeler 6-7 corpus epididim karşılık gelir ve bölgeler 8-10 Kauda epididim temsil eder. (B-C) DNM2 ayirt yerelleştirme bölgeye özgü dağıtım desenleri (beyaz ok ucu ve ok ile gösterilen) saptandı. Zone 1 ve 2 arasında sınır tarafından noktalı bir çizgi olarak ya da sarı oklarla gösterilir. (D) DNM2 Ayrıca kaput epididim izole sperm peri acrosomal etki alanındaki ifade edilir. Ancak, hiçbir tür boyama rutin luminal spermlerin epididimden karşılık gelen bölümler içinde olarak algılandı. EP, epitel hücreleri; l, lumen; Negatif, ikincil antikor sadece kontrol. Deneyler üç hayvan malzeme üzerinde çoğaltılmış ve temsilcisi ayirt resimleri sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: fare kaput epididim ayirt algılaması DNM 1 ve DNM 3. (A) DNM136 lokalizasyonu fare kaput epididim incelenmiştir. (B) DNM3 Co yerelleştirme36 ve açik hücre marker, ATP6V1B137 fare kaput epididim içinde. Bu analiz doğruladı her iki DNM3 (yeşil ok) ve ATP6V1B1 (kırmızı oklar) Açik Hücre alt nüfus içinde bulunan ancak en az alt hücresel örtüşme görüntüler. EP, epitel hücreleri; int interstitium; l, lumen; SP, sperm; Negatif, ikincil antikor sadece kontrol. Hücre çekirdeği DAPI (mavi) ile counterstained. Deneyler üç hayvan malzeme üzerinde çoğaltılmış ve temsilcisi ayirt resimleri sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: fare kaput epididymosomes zenginleştirme için kullanılan yalıtım iletişim kurallarının şematik. Sonra diseksiyon, kaput epididimal doku BWW orta bir damlacık dalmış ve luminal içeriği serbest bırakmak için basamağında. Luminal sıvı sonra 70 µm membran filtre uygulanır ve sonuç süspansiyon herhangi bir kalıntı hücre artıkları cips için hızı artan centrifuged. Temizlenen süspansiyon sonra üstüne bir kesintili yoğunluğu degrade (iodixanol çözüm) yüklü ve gecede ultrasantrifüj tabi. Havuza, Epididymosomes bölümü kesirler 9-11, içine yolu ile seyreltme PBS içine yıkanmış ve epididymosomes cips için ultracentrifuge döndü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: epididymosome saflık değerlendirilmesi. On iki eşit kesirler geçişin ultrasantrifüj ve her (A) protein için hazırlanan bir aliquot sonra ele geçirildi ve RNA miktar, (B) yanında istimal dinamik ışık saçılma ve heterojenlik değerlendirme boyutu (C). epididymosome işaretçisi dağıtım immunoblot analizi. (D) çift-etiketleme aldehid/sülfat lateks boncuk, (E) iletim elektron mikroskobu değerlendirme ve sperm hücreleri (F) immunoblot değerlendirmesi konsantre epididymosomes, ek karakterizasyonu adımlar dahil (Sperm) ve anti-arachidonate 15-lipoxygenase (ALOX15, sitoplazmik damlacık/sperm kirlenme) veya anti-hemoglobin kullanarak kırmızı kan hücresi (RBC) kontaminasyon (HBB, RBC kirlenme). Immunoblots da bilinen epididymosome kargo (26S proteasome ATPaz sigara yasal alt birim 7, PSMD7; Isı şok protein 90kDa beta üye 1, HSP90B1; ve beta tübülin, TUBB) probed. Bu veri başlangıçta bilimsel raporlarda yayımlanan (PMID: 27549865) ve burada yayımcı Springer doğa izni ile çoğaltılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: DNM izoformlarının mECap18 hücrelerdeki tespiti ayirt ortaya dağıtım bu kaput epididimal doku tespit ile bu uyum kalıpları. (A) coverslip hazırlık için steril mECap18 hücre kültürü şematik. (B) temsilcisi ayirt o epididimal doku bölümleri içinde tespit yansıtılmış ortaya hücresel dağıtım desenleri (oklar ve iç metin (çift DNM3 ve Açik Hücre işaretçisi ATP6V1B1 etiketleme)) boyama DNM görüntülerini. Hücre çekirdeği propidium iyodür (PI; kırmızı) ya da DAPI (mavi) ile counterstained. Deneyler üç hayvan malzeme üzerinde çoğaltılmış ve temsilcisi ayirt resimleri sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmalar parafin gömme ve standart parça protokolleri için tabi Bouin'ın sabit epididimal doku kullanımı dahil. Bouin'ın sabitleştirici çözüm özel ve tamamlayıcı bir işleve sahip her bileşeni ile formaldehit, pikrik asit ve asetik asit, karışımından oluşmaktadır. Böylece, formaldehit protein çapraz bağlantıları oluşturmak için Birincil aminler ile reaksiyona girer, pikrik asit tuzları oluşturan doku yavaş yavaş nüfuz eder ve dolayısıyla koagulasyon temel proteinler ve tersine, asetik asit hızla dokuya nüfuz eder ve koagülasyon, neden olur Nükleik asitler. Bu kombine özellikleri morfolojik ayrıntı korunması için tercih edilen bir sabitleştirici olarak Bouin'ın doğurduğu ve kullanımı yaygın epididimal literatürde bildirilen. Ancak, Bouin'ın çözüm ve formaldehit indüklenen cross-linking sabitleştirici indüklenen floresan için hedef antijenleri maskeleyebilir eğilimi dahil kendi sınırlamaları değildir.
Arka plan floresan için potansiyel çalışmalarımız içinde birincil antikor, ikincil antikor ihmal ihmal dahil ve nerede reaktifleri kullanılabilir, sıkı negatif denetimleri kullan, birincil antikor kullanımı gerektirir Onlar üretilen immunizing peptid karşı preabsorbed. Bu tür denetimler uygulama ayrıntılarını fare epididim21dynamin DNM ifadenin önceki çalışma örneği. İdeal olarak, bu sonuçlar da nakavt hayvanlardan elde edilen doku kullanımı ile doğrulanması gerektiğini, ancak, bu malzeme her zaman kullanıma hazır değil. Sayaç çapraz bağlı veya kimyasal olarak değiştirilmiş hedef antijenleri ikincil problem için arayışı içinde sık sık fiksasyon tarafından değiştirilmiş epitopları meydana çıkarmak için antijen alma şeklinde bazı gerçekleştirmek ve böylece antikor potansiyeli geri yüklemek gerekli olan bağlama. Metodoloji alma için kullanılan hedef antijen, antikor, doku türü ve fiksasyon yöntemi de dahil olmak üzere pek çok değişkene bağlı. Ancak, en yaygın olarak kabul edilen teknikler her iki ısı-aracılı veya proteolitik indüklenen antijen alma kullanma şekil. İmmunoreactivity, sıcaklık rejimleri ve biz sık tablo 1' de belgelenmiştir fakat gerektiği gibi kullanmak alma çözümleri ayrıntıları ile geri yükleme için daha yüksek bir başarı oranı nedeniyle tercih yaklaşımımız ile eski özellikleri. Ancak, bu hiç ayrıntılı bir liste değildir ve sonuçta her protein hedef/antikor birleşimi için antijen alma optimizasyonu ön çalışmalar bir matris zaman, sıcaklık ve pH kombinasyonları kullanarak gerektirir dikkatli olun. Dikkat edilecek diğer noktalar doku hasarı temin ve/veya artefactual etiketleme neden ısı alma olasılığını içerir. Böylece, negatif denetimleri yukarıda belgelenen uygulama yanı sıra, aynı zamanda düzenli olarak olumlu denetimleri gibi anti-Golgin-97, farklı hücre organelleri tanıyan antikorlar, featuring dahil.
Proteinler DNM ailesine ait olanlar gibi yerine getirmek gereksiz, tamamlayıcı, epididimal doku işlevlerinde karşı olup olmadığını kurmak için arayışı içinde özellikle bu gibi çift etiketleme deneyler gerçekleştirmek için bilgilendirici bulduk Şekil 2Bresimli. Bu strateji takip çiftleri (farklı tür kaldırdı) birincil antikorların uygun ikincil antikorlar farklı konjuge fluorophores bölümlerle doku sıralı etiketlerine göre içerir. Ancak, zaman zaman bu çift etiketleme çalışmaları gerçekleştirmek arayışı içinde doğar bir karıştırıcı ile birincil her antikor en uygun etiketleme için gerekli antijen alma kurallarının uyumsuzluk özelliğidir. Bu sınırlama DNM 2 Golgin-97 bizi ardışık seri bölümler (farklı olarak aynı bölüm)21kullanmak için fare kaput epididim içinde birlikte etiketleme ve söz konusu olduğunda karşılaşıldı. Yine de, ya bu yaklaşımların protein ifadeyi belirli hücre türüne Bu pseudostratified epididimal epitel temsil arasında ascribing bağlamında son derece yararlı. Aklında bu amaç ile temsilcisi hücre tipi işaretleri ve bunların bildirilen dağıtım şekillerine epididimal tübül (tablo 2) uzunluğu boyunca listesi dahil ettik. Bir dilek hücre tipi gidin ve hedef proteinlerin hücre altı dağıtım keşfetmeye başlamak için Golgin-97 gibi tanınmış organel işaretçileri olan çift etiketleme kullanımı farklı avantajlar sunuyor. Alternatif olarak, yüksek çözünürlüklü elektron mikroskopi immunogold etiketleme ile tandem uygulama yönteminin seçimi ayrıntılı ultrastructural yerelleştirme ve doğrulama boyama desenleri ayirt21 kullanılarak elde kalır .
Epididymosomes çalışma tarafından yöneltilen sınırlamalar arasında onların küçük büyüklük ve detaylı bitiş noktası analizleri, yeterli miktarda özellikle yaygın olarak elde etme zorluğu fare gibi laboratuar türleri kullanılır. Ancak, Sullivan ve meslektaşları38,39,40öncü çalışmalar büyük harfe çevirmeyi biz sağlam metodoloji fare epididymosome izolasyonu için en iyi duruma getirmek mümkün olmuştur (bkz. Adım 2) modeli. Biz, ancak, değerlendirmek için sıkı denetimler ve fiziksel özellikleri nedeniyle sperm, sitoplazmik damlacıkları ve/veya kan yoluyla exosomes (potansiyel kirlenme zenginleştirilmiş epididymosome nüfus41 empoze gerek stres bkz. Şekil 4). Bu amaçla, rutin bir arada kullanmak: (i) yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu boyutu ve epididymosome hazırlık, (ii) Ortalama partikül boyutu ve heterojen (III) konsantrasyonu hesaplanması heterojen görselleştirmek için epididymosomes üstüne 4 µm aldehid/sülfat lateks boncuk ve floresan etiketlerine göre eksozom yüzey işaretleyicileri, CD9 ve FLOT1, gibi tanınmış ve izole epididymosomes (IV) immunoblotting a maiyet-in antikorlar ile tavsiye için deneysel exosomes doğrulama (Örn., anti-CD9, anti-FLOT1), Sperm hücreleri (anti-IZUMO1), sperm sitoplazmik damlacıkları (anti-ALOX15) veya kan (anti-HBB)22sınırlandırılmalıdır antijenleri karşılık gelen de negatif olarak kontrol eder. Bu standartları yerine getirilmesi, sonra izole epididymosome hazırlıklar kolayca sperm hücreleri ile ortak kuluçka dahil aşağı akım uygulamalarda kullanım için mükellef bulunmaktadır ve/veya kargo profil oluşturma inceliyor22,42, ikisi de epididymosomes epididimden sperm olgunlaşma1düzenlenmesinde rol anlayışımızı geliştirmek için güçlü yaklaşımlar vardır.
Bu çalışmada, biz DNM katılımı epididimal salgı faaliyet21 düzenlenmesi hem de etkisini incelemek için kullanılan bir fare SV40 ölümsüzleştirilmiş kaput epididimal epitel (mECap18) hücre hattı, uygulama tarif çevre toxicants tarihinde epididimal Fizyoloji43. MECap18 hücre kültürünü önemli bir özelliği olduğunu her iki asıl ve net hücreleri21,35,44temsilcisi nüfusu geçişleri ve özellikler arasındaki fenotipik istikrar görüntüler. Birincil epididimal hücre kültürleri için karşılaştırıldığında, mECap18 hücre kültürünü de fetal buzağı serum süresi ve deneysel müdahaleler doğası bu hücreler uzatır ücretsiz orta için iken aynı zamanda olma gösterilebilir kültür toleransı görüntüler daha yüksek bir bereket fışkırmış proteinlerin şartına ortamından kurtarma keyfi. Bir mECap18 hücre kültürünü, ancak, ölümsüzleştirdi olmuştur ve böylece farklı strese yanıt verebilir ve / veya birincil hücre kültürleri veya bu hücreler içinde vivomevcut bağışıklık ile ilgili uyaranlara kıyasla kısıtlamasıdır. Akılda bu sınırlama ile bu vivo yanıtları mümkün olduğunda mECap18 hücreleri kullanılarak elde edilen sonuçları karşılaştırmak için tavsiye edilir. Özet olarak, bu hücre satırı yardımcı programı ile hangi hedef proteinler kaput epididim içinde işlevselliğini çalışmaya başlamak bir araç olarak tarif biz protokolleri vurgulayın. Gerçekten, ticari protein inhibitörleri ve/veya genom düzenleme araçları (örneğin, CRISPR-Cas9) ile birlikte kullanımı, mECap18 hücre kültürünü epididimal fonksiyonu mekanik temeli gidermek için önemli bir potansiyel tutar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar bu eser destek için Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi, Avustralya proje Grant APP1103176 kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
References
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
- Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
