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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Analyse der Epididymal Protein-Synthese und Sekretion

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/58308
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 2,4, 1,2
1Priority Research Centre for Reproductive Science, School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Hunter Medical Research Institute, 3Department of Physiology, Turku Center for Disease Modeling, Institute of Biomedicine, University of Turku, 4School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle

Summary

Hier berichten wir über die Immunfluoreszenz-Lokalisierung von Dynamin, die Protokolle für den Nachweis von Proteinen in Paraffin-eingebetteten Maus epididymal Abschnitten und derjenigen einer epididymal immortalisierte Zelllinie (mECap18) zu illustrieren. Wir beschreiben auch die Protokolle für die Isolierung von sekretorischen Proteine aus epididymal Flüssigkeit und konditionierten Zelle Medien.

Abstract

Der Säugetier-Nebenhoden erzeugt eines der komplexesten Intraluminal Flüssigkeiten endokrine Drüse um die Post-Hoden Reifung und Lagerung von Spermien zu unterstützen. Diese Komplexität entsteht aufgrund der kombinierten sekretorischen und absorptive Aktivität der epithelialen Zellen Futter. Hier beschreiben wir die Techniken für die Analyse der epididymal Protein-Synthese und Sekretion durch die Konzentration auf die Modell-Protein-Familie von Dynamin (DNM) Mechanoenzymes; großen GTPasen, die das Potenzial haben, Bi-direktionale Membran Menschenhandel Veranstaltungen zu regulieren. Für die Untersuchung von Protein-Expression in epididymal Gewebe beschreiben wir robuste Methodik für die Immunfluoreszenz Kennzeichnung von Zielproteinen in Paraffin-eingebetteten Abschnitten und die spätere Erkennung der räumlichen Verteilung dieser Proteine über Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Wir beschreiben auch optimierte Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von exosom wie Bläschen, bekannt als Epididymosomes, die in der epididymal Lumen zur Teilnahme an interzelluläre Kommunikation mit Reifen Spermien abgegeben werden. Als einen komplementären Ansatz beschreiben wir auch die Immunfluoreszenz-Erkennung von Zielproteinen in einer Zelllinie SV40 verewigt Maus Caput epididymal epithelialen (mECap18). Darüber hinaus diskutieren wir den Nutzen der mECap18 Zelle als geeignete in-vitro- Modell mit, um die Regulierung der epididymal sekretorischen Aktivität zu erkunden. Zu diesem Zweck beschreiben wir die Kultivierung Anforderungen für die Aufrechterhaltung der mECap18-Zell-Linie und der Einsatz von selektiven pharmakologische Hemmung Regimen, die ihre sekretorischen Protein Profil zu beeinflussen können. Letztere werden bewertet ohne weiteres über die Ernte der konditionierten Kulturmedium, Konzentration der sekretierten Proteine über Trichloressigsäure Säure/Aceton Niederschlag und ihre anschließende Analyse über die SDS-PAGE und Immunoblotting. Wir behaupten, dass diese kombinierte Methoden für die Analyse von alternativen epididymal Protein-Targets als Auftakt zur Bestimmung ihrer funktionalen Rolle in spermienreifung und/oder Lagerung eignen.

Introduction

Die Spermien von allen Säugetierarten erwerben das Potenzial um vorwärts progressive Motilität anzuzeigen und eine Eizelle befruchten während ihrer längeren Abstieg durch die Nebenhoden, eine hoch spezialisierte Region des männlichen extra Hoden Kanalsystems, die 7-14 Tage (abhängig von der Sorte) navigieren1. Durch die extreme Kondensation des Chromatins väterlicherseits und das Ablösen von der Mehrheit der Zytoplasma, die die Cytodifferentiation der Spermien im Hoden begleitet, wird ihre nachfolgenden funktionellen Reifung ausschließlich durch ihre Interaktion angetrieben. mit der epididymal Mikroumgebung. Dieses Milieu entsteht wiederum durch die sekretorischen und absorptive Aktivität der Auskleidung epididymal Soma und zeigt ein außergewöhnliches Maß an Segment-Segment Variante1. So sind die meisten aktiven Segmente in Bezug auf die Protein-Synthese und Sekretion im proximalen Teil des Nebenhodens (nämlich die Caput und Korpus)2. Diese Tätigkeit spiegelt das funktionale Profil von Spermien, mit dem Zellen ersten anzuzeigenden Markenzeichen der fachliche Kompetenz (i.e., progressive Motilität und die Fähigkeit zur Bindung an Säure solubilisiert Zona Glykoproteine) folgende ihre Durchgang durch das Caput Nebenhoden3. Diese funktionelle Attribute weiter ausbauen vor dem optimalen Niveau zu erreichen, wie das Sperma der distalen epididymal Segment (Cauda), erreichen wobei sie im Ruhezustand in Bereitschaft zur Ejakulation gespeichert sind. Bildung und Erhaltung von diesem Sperma-Lagerung-Reservoir ist auch eng mit der Auskleidung Epithel, die in der Cauda dominiert wird von starken absorptive Aktivität4,5verbunden. Anatomische Unterschiede gemeldeten6,7,8gewesen, scheint solche regionalisierte Arbeitsteilung ein Merkmal des Nebenhodens zu sein, die bei der Mehrheit der Säugetierarten geteilt wird studierte bis Datum, einschließlich unserer eigenen9,10. In der Tat aus klinischer Sicht ist es bekannt, dass epididymal Dysfunktion leistet einen wichtigen Beitrag zur Ätiologie von männlicher Faktor Unfruchtbarkeit11, also Hervorhebung der Bedeutung die Verordnung dieses spezialisierte Gewebe zu verstehen.

Es ist daher bedauerlich, dass unser Verständnis der epididymal Physiologie und die Mechanismen, die die aufeinander folgenden Phasen der spermienreifung und Lagerung in diesem Gewebe zu regulieren nicht vollständig gelöst werden. Unter den beitragenden Faktoren sind limitierende Fortschritte in der epididymal Forschung der Komplexität dieses Gewebes und Wissen über die Mechanismen, die regulatorischen Kontrolle über seine luminalen Mikroumgebung ausüben. Anatomisch, wissen wir, dass über die Unterscheidung von Caput, Korpus und Cauda Segmente, die Nebenhoden kann weiter unterteilt werden in mehrere Zonen (Abbildung 1A), die jeweils getrennt durch Septen12 und zeichnet sich durch diskrete profile gen/Protein Ausdruck13,14,15,16,17,18. In der Tat, wurden auf der Grundlage von detaillierten transkriptionelle Profilierung der segmentalen Genexpression in den Nebenhoden, weniger als 6 und 9 verschiedene epididymal Zonen in der Maus und Ratte Modelle, bzw.19,20gemeldet. Diese Komplexität spiegelt vermutlich die Zusammensetzung der epididymal Soma, eine pseudostratified Epithel, bestehend aus zahlreichen verschiedenen Zelltypen; Jede abweichende in Bezug auf ihre Fülle, Verteilung und sekretorischen/absorptive Aktivitäten entlang der Länge des Traktes. Wichtigsten Zellen sind also bei weitem die am häufigsten vorkommende epididymal Zelle Art bilden mehr als 80 % aller epithelialen Zellen. Dementsprechend sind die wichtigsten Zellen verantwortlich für den Großteil der epididymal Protein Biosynthese und Sekretion5. Im Gegensatz dazu sind die klare Zellpopulation, die Rang als die zweithäufigste Zelltyp innerhalb der epididymal Soma in erster Linie selektive Absorption der luminalen Komponenten und die Versauerung der Mikroumgebung5beteiligt. Hinzufügen einer anderen Ebene der Komplexität, üben Androgene und andere Lumicrine Faktoren der Hoden Herkunft differenzielle Kontrolle über jedes dieser epididymal Zelltypen abhängig von ihrer Positionierung entlang den Trakt.

Trotz der Beschränkungen durch diese Komplexität auch weiterhin bedeutende Überfälle in die mechanistische Grundlage der epididymal Funktion zu lösen. Ein Schlüssel zu diesen Studien wurde die Anwendung der erweiterten Massenspektrometrie Strategien auf breiter Ebene Vorräte des epididymal Proteome im Tandem mit detaillierten Analysen der einzelnen Proteine ausgewählt aus dieser ersten Umfragen zu etablieren. Ein Beispiel für diesen Ansatz ist unsere jüngste Charakterisierung der DNM-Familie der Mechanoenzymes in der Maus Modell21. Unsere anfängliche Interesse an DNM wurde durch seine doppelte Wirkung in der Kupplung von Exo- und endocytotic Prozessen angetrieben. Aufbauend auf diesen Beobachtungen, konnten wir beweisen, dass die drei kanonischen Isoformen von DNM (DNM1 - DNM3) sind hoch in der Maus Nebenhoden ausgedrückt und entsprechend positioniert, um regulatorische Rollen in Protein Sekretion und Absorption21 . Darüber hinaus konnten wir deutlich unterscheiden jedes DNM Isoform auf der Grundlage ihrer zellulären und subzellulären Lokalisation hindeutet, dass sie einander ergänzen, im Gegensatz zu redundanten, Aktivität innerhalb der epididymal Epithel21besitzen.

Hier beschreiben wir die experimentelle Methodik beschäftigt für die Untersuchung von DNM Ausdruck in der Maus Nebenhoden mit der Hoffnung, dass diese Informationen wird in der Charakterisierung der alternative epididymal Proteine breitere Anwendung zu finden und tragen so zu unserer Verständnis der Funktion dieses wichtige Element der männlichen Fortpflanzungsorgane. Im einzelnen beschreiben wir die Entwicklung von robusten Methodik für die Immunfluoreszenz Kennzeichnung von Zielproteinen in Paraffin-eingebetteten epididymal Abschnitten und die spätere Erkennung der räumlichen Verteilung dieser Proteine über Immunfluoreszenz Mikroskopie. Weiter dokumentieren wir unsere kürzlich optimierte Protokolle22 für die Isolierung und Charakterisierung von Epididymosomes; kleinen exosom-wie Bläschen, die Schlüsselelemente des epididymal sekretorischen Profils und eine herausragende Rolle bei der Förderung der Spermien Reifung23zu halten scheinen. Als einen komplementären Ansatz beschreiben wir auch die Immunfluoreszenz-Erkennung von Zielproteinen in einer Zelllinie verewigt Maus Caput epididymal epithelialen (mECap18) und der Umgang mit dieser Ressource als ein Modell mit, um die Regulierung der epididymal zu erkunden sekretorischen Aktivität in Vitro.

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Protocol

Alle experimentellen Verfahren, die Sammlung von tierischem Gewebe wurden von der University of Newcastle Animal Care und Ethik-Kommission genehmigt.

(1) Immunfluoreszenz Färbung der Paraffin-eingebetteten Epididymal Abschnitte (Abbildungen 1 und 2)

  1. Unmittelbar nach der Euthanasie Erwachsener Mäuse durch CO2 Einatmen (Schweizer Mäuse, über 8 Wochen alt) sorgfältig sezieren die Nebenhoden (durch chirurgische Scheren und Pinzetten) der darüber liegenden Bindegewebe und Fett befreien und Tauchen in Bouins Fixiermittel Lösung (> 10 mal Volumen/Gewebe Gewicht) für Übernachtung Fixierung.
  2. Waschen Sie das Gewebe mit 70 % Ethanol mit 2 × täglich für 2 Tage und dann Austrocknen durch abgestufte Ethanol (70 %, 95 % und 100 %) in Vorbereitung auf Infiltration und Einbettung in ein paraffinblock.
  3. Abschnitt der Paraffin-Blöcke bei einer Dicke von 4 bis 6 µm und Halterung auf den Folien in Vorbereitung auf die Immunfluoreszenz-Färbung.
  4. In einer Dampfhaube Wachsentfernung epididymal Paraffin-Abschnitte durch die Folie Glas komplett eintauchen Abschnitt Gewebe (3 × 5 min jedes Mal) eine ausreichende Menge an Xylol hinzufügen.
  5. Die Gewebeschnitte durch das Eintauchen in abgestuften Ethanol Lösungen verdünnt in gereinigten H2O rehydrieren (100 % Ethanol 5 min, 100 % igem Ethanol 5 min, 90 % Ethanol 1 min, 80 % Ethanol 1 min, 70 % igem Ethanol 1 min und 50 % Ethanol 1 min).
  6. Waschen Sie die Abschnitte in einer Folie Glas einmal für 5 min mit ausreichend Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) den gesamte Gewebe Abschnitt komplett Eintauchen (befolgen Sie diese Anweisungen für alle nachfolgenden Wäschen).
  7. Dekantieren entsprechende Antigen-Retrieval-Lösung (zB., 10 Mmol/L Natriumcitrat, 50 Mmol/L Tris pH 10,5 oder alternative Antigen Abruf Lösung(en), je nach dem Antigen erkannt werden) in eine Folie Rack und eine Mikrowelle zum Kochen bringen. Tauchen Sie die Folien in dieser Lösung und die Gewebeschnitte nach Wärme-induzierte Antigen Abruf Bedingungen optimiert für einzelne Antikörper (siehe Tabelle 1).
    Achtung: Sicherstellen Sie, dass die Folien in Antigen-Retrieval-Lösung während des Antigen-Retrieval-Prozesses vollständig eingetaucht sind.
  8. Entfernen des Folie-Containers aus der Mikrowelle und kühl auf Raumtemperatur.
  9. Spülen Sie die Folien mit PBS und verwenden Sie einer flüssigkeitsabweisenden Folie Filzstift zu verfolgen, um die Gewebe-Abschnitt.
  10. Legen Sie die Folien in eine befeuchtete Behälter (erstellt von einem feuchten Gewebe an der Unterseite des Behälters), und wenden Sie blockierende Lösung (3 % BSA/PBS, zuvor gefiltert durch einen 0,45 µm-Filter) für 1 h bei 37 ° C.
  11. Spülen Sie die Folien einmal mit PBS.
  12. Inkubieren Sie die Abschnitte mit entsprechenden Primärantikörper verdünnt, um eine experimentell optimierten Konzentration in gefilterten 1 % BSA/PBS bei 4 ° C über Nacht (1: 60 für Anti-DNM1, DNM2 und DNM3 Antikörper; 1: 100 für Antikörper Anti-ATP6V1B1, siehe Tabelle der Materialien Antikörper Einzelheiten).
    Hinweis: um zu unterscheiden bestimmte unspezifische Antikörper gebunden, es ist notwendig, strenge Negative (i.e., Sekundärantikörper nur, primäre Antikörper preabsorbed gegen Immunisierung von Peptid) und Positivkontrollen24.
  13. Abgekühlter Folien indem man bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
  14. Waschen Sie die Folien 3 × mit PBS auf einer schütteln Plattform (60 u/min) für 10 Minuten.
  15. Inkubieren Sie die Abschnitte mit entsprechenden Sekundärantikörper verdünnt in 1 % BSA/PBS (gefiltert durch einen 0,45 µm-Filter) bei 37 ° C für 1 h (1: 400 Verdünnung für alle Sekundärantikörper, siehe Tabelle der Materialien Antikörper).
    Achtung: Halten Sie die Folie Behälter im Dunkeln von diesem Schritt ab. Für die doppelte Beschriftung, wählen Sie eine kompatible Kombination der Sekundärantikörper (i.e., Sekundärantikörper müssen erhöht werden können, in verschiedenen Arten).
  16. Waschen Sie die Folien 3 × mit PBS auf einer schütteln Plattform (60 u/min) für 10 Minuten.
  17. Counterstain in den Abschnitten mit Propidium Jodid (PI, 7,48 μmol/L) oder 4΄, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 4,37 μmol/L) für 2 min bei Raumtemperatur um den Zellkern zu beschriften.
  18. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit PBS auf einer schütteln Plattform (60 u/min) für 5 min.
  19. Montieren Sie die Abschnitte mit 10 % Mowiol 4-88 in einer Lösung von 30 % Glycerin in 0,2 Mol/L Tris (pH 8,5 zubereitet) und 2,5 % 1, 4 - Diazabicyclo-(2.2.2)-Oktan.
  20. Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack und speichern Sie die Folien bei 4 ° C für zukünftige Beobachtung.
    Achtung: Es wird empfohlen, führen Sie die Bildgebung der Folien so bald wie möglich nach der Zubereitung übermäßigen Verlust der Fluoreszenz zu vermeiden.

2 Isolation des Epididymosomes von der Maus Caput Nebenhoden (Abbildung 3)

  1. Unmittelbar nach der Euthanasie Erwachsener Mäuse durch CO2 Einatmen (Schweizer Mäuse über 8 Wochen alt) durchspülen Sie ihrer Gefäßsystem mit PBS (vorgewärmt auf 37 ° C) um die Blut-Kontamination von epididymal Gewebe zu minimieren.
    Vorsicht: Blutplasma enthält verschiedene Populationen von exosomen, die von ähnlicher Größe wie Epididymosomes25sind. Die Wirksamkeit von Blut Abstand epididymal Gewebe ist erreichbar über die Prüfung des ersten Segments befindet sich ein stark vaskularisierte epididymal Segment proximal zum Segment Caput (i.e., zone 1 in Abbildung 1A)
  2. Sezieren Sie sorgfältig die Nebenhoden frei von darüberliegenden Fett- und Bindegewebe und Spülen mit modifizierten Biggers Whitten und Whittingham Medium (BWW; pH 7,4, Osmolalität von 300 Mmol/kg Wasser26,27) um mögliche Oberfläche zu verringern Blut-Kontamination.
  3. Tupfen Sie das epididymal Gewebe zu entfernen überschüssige Medien, sezieren Caput Nebenhoden (dh., Zonen 2-5 in Abbildung 1A) und Übertragung auf eine neue Petrischale (35 × 10 mm) mit BWW Medium. Stellen Sie sicher, dass die Menge des Mediums für die endgültige Erholung ausreicht.
    Hinweis: Für 6 Caput Nebenhoden empfiehlt es 1,1 mL des Mediums verwenden, um eine Erholung von ~ 900 µL ermöglichen, was wird dann gleichmäßig aufgeteilt und auf 2 vorbereitete Gradienten (siehe Schritt 2,9) angewendet.
  4. Machen Sie einige kleine Einschnitte in das Caput Gewebe mit einer Rasierklinge. Zerkleinere das Gewebe nicht und somit Vermeidung einer Kontamination der Probe mit übermäßigen cytosolischen Inhalt. Inkubieren Sie die Platte mit der Gewebe mit milden Agitation bei 37 ° C für 30 min, der luminalen Inhalt freizugeben.
  5. Filtern Sie die resultierende Aussetzung durch 70 µm Membranen, die zelltrümmer zu entfernen.
  6. Das Filtrat zu sammeln und unterliegen diese Schritte aufeinander folgenden Zentrifugation bei 4 ° C mit zunehmender Geschwindigkeit um zelltrümmer zu beseitigen (i.e., 500 × g, 2 000 × g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min; 17.000 × g für 20 min, und schließlich 17.000 × g für eine zusätzliche 10 Minuten oder bis keine Pellets nach Zentrifugation gebildet wird).
    Achtung: Es ist wichtig zu beurteilen, die Farbe der Pellets nach den ersten 500 × g Zentrifugieren Schritt um sicherzustellen, dass minimal Blut vorhanden ist. Entsorgen Sie keine Proben, in denen diese Pellets rosa Färbung zeigt.
  7. Bereiten Sie diskontinuierliche Iodixanol Gradienten (bestehend aus 40 %, 20 %, 10 %, 5 % Schichten vor) durch Verdünnung ein Dichte-Gradienten-Medium (bestehend aus 60 % (w/V) wässrige Iodixanol) mit einer Lösung von 0,25 Mol/L Saccharose und 10 Mmol/L Tris (pH 7,5).
  8. Bereiten Sie die Steigung in einem Ultrazentrifugen Rohr (11 × 35 mm), mit jedem Bruchteil von 450 µL (Abbildung 3). Überprüfen Sie die Steigung nach der Anwendung der einzelnen Fraktionen um sicherzustellen, dass die Schnittstellen zwischen jeder Schicht vor dem Laden der epididymal Fluid-Probe erfolgreich gebildet werden. Jede Steigung frisch zubereiten, am Tag der Nutzung, jedoch, die epididymal luminalen Fluid-Probe kann bei 4 ° C für bis zu 2 Stunden vor der Verladung bewahrt werden.
  9. Fügen Sie sorgfältig 450 µL epididymal luminalen flüssige Suspension (entsprechend Material gesammelt von Caput 3 Nebenhoden) Spitze eines einzigen Gradienten.
  10. Ultrazentrifugen Steigungen bei 160.000 × g bei 4 ° C für 18 h.
    Achtung: Da diese Zentrifugation mit sehr hoher Geschwindigkeit ausgeführt wird, alle Ultrazentrifugen Rohre müssen gepaart und genau ausgeglichen. Überprüfen Sie die Schläuche um sicherzustellen, dass sie frei von Schäden sichtbar sind, die ihre Integrität gefährden könnten.
  11. Entfernen Sie vorsichtig die 12 gleichen Fraktionen (jeweils bestehend aus 185 µL) ausgehend von der obersten Schicht und im unteren Bereich des Farbverlaufs voran. Bündeln Sie die gleichwertige Brüche erholte sich von jeder Verlauf ggf. (bis zu zwei Steigungen).
    Hinweis: Maus Epididymosomes höchst angereichert werden, in Sekundenbruchteilen 9-11-22, siehe Abbildung 4 und Diskussion.
  12. Nach der Erholung und Bündelung von 9 – 11, Brüche in 2 mL PBS und Ultrazentrifugen verdünnen Sie die Proben bei 100.000 × g bei 4 ° C für 3 Stunden (13 × 56 mm Rohr) zu den Epididymosomes Pellets.
    Achtung: Da Epididymosome Pellet schwer zu erkennen sein kann, sicherzustellen Sie, dass die Ausrichtung der Röhren vermerkt ist, wie sie in den Rotor platziert werden und markieren Sie das Rohr um die werdende Position des Pellet-Epididymosome anzugeben. Sicherstellen, dass jedes Röhrchen ein ausreichendes Volumen enthält (i.e., mehr als 50 % der Gesamtkapazität) um das Risiko des Zusammenbruchs der Röhre auszuschließen.
  13. Sorgfältig abzusaugen und entsorgen des Überstands ohne störende Epididymosome Pellet.
  14. Beurteilen Sie die Epididymosome Reinheit (Abbildung 4).
  15. Epididymosome Pellet in gewünschten Medium nach der nachgeschalteten Anwendung(en) aufzuwirbeln. BWW-Medium wird beispielsweise in der Regel für die Experimente mit Co Inkubation mit Spermien oder alternativ eine entsprechende Lyse-Puffer in der Vorbereitung für die Auflösung des epididymal Proteome per SDS-PAGE verwendet.

(3) Immunfluoreszenz-Färbung von mECap18 Zellen

  1. Vorbereitung der sterilen Deckgläsern (in einer Zelle Kultur Haube durchgeführt werden)
    1. Deckgläsern (12 × 12 mm) in 70 % igem Ethanol für 10 Minuten einweichen und desinfizieren durch Trocknen bei hohen Temperaturen über eine Ethanol-Lampe.
    2. Cool das Deckglas für 10 s vor der Übertragung an einen 12-well-Platte.
    3. Wenden Sie sterile Poly-L-Lysin-Lösung um das Deckglas abdecken und für 10 min bei Raumtemperatur zu begleichen.
    4. Entsorgen Sie die Poly-L-Lysin-Lösung und spülen Sie das Deckglas mit sterilen H2O oder geeigneten Medium.
  2. Vorbereitung mECap18 Zellen
    1. Die Passage der Aliquote von 2 × 105 mECap18 Zellen in jede Vertiefung der 12 well-Platte mit den Deckgläsern.
    2. Kultur der Zellen mit mECap18 Zelle mittlere (DMEM ergänzt mit 1 % L-Glutamin, 1 % Natrium Pyruvat, 1 % Penicillin/Streptomycin und 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN) mit 10 % fetalen Kälberserum (FBS) in einem Inkubator 37 ° C unter einer Atmosphäre 5 % CO2 über Nacht.
    3. Sobald die Zellen das Deckglas anhaften, entsorgen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
    4. Fügen Sie eine ausreichende Menge an 4 % Paraformaldehyd (PFA) verdünnt in PBS Tauchen die gesamte Deckglas und die Zellen bei Raumtemperatur 15 Minuten beheben.
    5. Entsorgen Sie die PFA-Lösung und spülen Sie die Deckgläsern zweimal mit PBS-Puffer.
  3. Immunfluoreszenz-Färbung
    1. Permeabilize mECap18 Zellen durch Eintauchen in 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer für 10 Minuten.
    2. Spülen Sie die Deckgläsern mit PBS.
    3. Blockieren Sie mECap18 Zellen mit 3 % BSA zu, und fahren Sie mit Immunolabeling von Zellen, die entsprechenden Protokolle für epididymal Gewebeschnitte beschriebenen Verwendung.

4. Isolierung von Proteinen aus konditionierten Zellkulturmedium

  1. Sammlung von konditionierten Zellkulturmedium
    1. Durchgang Aliquote von 4 × 105 mECap18 Zellen in jedem Bohrloch 6 Platte gut mit mECap18 Zelle Medium ergänzt mit 10 % FBS für 24 h.
    2. MECap18 Zellen dreimal mit mECap18 Zelle Medium (ohne FBS vorbereitet) waschen, um verbleibende FBS und alle zugeordneten entfernen Protein Verunreinigungen.
    3. Jedes gut 1,5 mL mECap18 Zelle Medium (ohne FBS vorbereitet) hinzu und inkubieren Sie mit mECap18 Zellen für 12 h in einem Inkubator 37° C weniger als 5 % CO2.
      Hinweis: mECap18 Zellen bei diesem Schritt können für unterschiedliche Zielgruppen Antigene nach experimentellen Designs beurteilt werden.
    4. Nach 12 h Inkubation sammeln Sie die Zelle Medium und Zentrifuge bei 2.000 × g für 10 min, alle zelltrümmer zu entfernen.
      Hinweis: Die Dauer der Inkubation ist in der Lage, nach experimentellen Design/Endpunkt Bewertung und unter Berücksichtigung der Zelle Toleranz gegenüber angewandte Behandlung(en) verändert werden. Es empfiehlt sich, passen das Timing der Inkubation basierend auf bestimmten experimentellen Therapien, um sicherzustellen, dass optimale Ergebnisse erzielt werden.
    5. MECap18 Zellviabilität über die Anwendung von einem standard Trypan blau Ausgrenzung Assay28zu beurteilen. Entsorgen Sie alles Material in dem Zellviabilität unter 90 % Vorspannung eingeführt durch Proteine aus Toten oder sterbenden Zellen entlassen zu beseitigen zurückgegangen ist.
    6. Isolieren Sie Proteine aus Zelle Medium wie folgt zu oder zu konservieren Sie Medium bei-80 ° C.
  2. Protein-Isolierung (, die in einem Abzug durchgeführt werden)
    1. 80 % Volumen von konditionierten Zelle Mittel-und überstürzen sich die Proteine aus den kultivierten mECap18 Zellen freigegeben fügen Sie 20 % Volumen von gekühltem 100 % Trichloressigsäure Säure hinzu. Inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht mit dem Konstanten mischen.
    2. Nach der Inkubation pellet ausgefälltes Eiweiß durch Zentrifugieren (17 000 × g, 4 ° C für 10 min).
      Hinweis: Aufgrund der begrenzten Zahl des Proteins, die voraussichtlich in das Medium ausgeschieden werden, ist es möglich, dass die Pellets nicht leicht nach der Zentrifugierung visualisiert werden. Es ist daher zwingend notwendig, um richtig orientieren das Rohr vor der Zentrifugation und kümmern sich nicht um die werdende Pellet-Lage bei der Entnahme des Überstands stören.
    3. Den überstand verwerfen und waschen das Pellet zweimal mit gekühlten Aceton vor der erneute Zentrifugation (17 000 × g, 4 ° C für 10 min).
    4. Sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands vor jede verbleibende Aceton in einer Dampfhaube Lufttrocknung.
    5. Aufschwemmen der Protein-Pellets in einer entsprechenden Extraktionspuffer Vorbereitung Endpunktanalyse, komplettes sekretorischen Protein Profile und/oder einzelne Zielproteine zu erkennen (zB., SDS-PAGE, Immunoblotting).

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Representative Results

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen repräsentative Ergebnisse Immunfluoreszenz Lokalisierung von DNM in der Maus Caput Nebenhoden. Jede der drei DNM Isoformen untersucht Anzeigeprofile eindeutige Lokalisierung. So zeichnet sich DNM1 durch relativ bescheidenen diffuse Kennzeichnung der epididymal Zellen während der ersten Segment und Caput Nebenhoden (Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu die DNM2 Isoform wurde erstmals entdeckt in der Nähe der gegnerischen basale und apikalen Grenze der Zellen in das erste Segment vor der Supranuclear Domäne in Zellen innerhalb des angrenzenden nachgelagerten Caput-Segments positioniert wird (zB., Zone 2-5) (Abbildung 1B, C). Bemerkenswert ist, verringert jedoch die Intensität der DNM2 allmählich Kennzeichnung zwischen Zonen 2 bis 5 des Caput Nebenhoden, ein Ergebnis, das im Wesentlichen die sekretorische Aktivität dieser epididymal Segmente21 (Abbildung 1B, C) spiegelt. Dementsprechend die Supranuclear Kennzeichnung der DNM2 anschließend zeigte sich die Verteilung der Golgi-Apparat innerhalb Caput wichtigsten Zellen21entsprechen. Spermien isoliert aus der gleichen Region epididymal zeigte intensive acrosomal Kennzeichnung für DNM2 (Abbildung 1). Als Einschränkung wurde jedoch gleichwertige DNM2 Kennzeichnung nicht routinemäßig auf luminalen Spermien innerhalb unserer Gewebeschnitte erkannt. Dieses Phänomen ist eine auf mehreren aufgetreten Gelegenheiten geben bei der Anwendung verschiedener Antikörper gezielt verschiedene epididymal/Spermien Antigene und vermutlich entsteht aufgrund von Problemen Antigenpräsentation zugeordnet und/oder Maskierung in der Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten. In jedem Fall betonen solche Unterschiede die Bedeutung der Durchführung parallel immunofluorescent Kennzeichnung von isolierten Spermien neben derjenigen der epididymal Gewebe selbst. Abweichend von DNM1 und DNM2, wurde die DNM3 Isoform hauptsächlich im apikalen Bereich eine kleine Anzahl von Caput Epithelzellen (Abbildung 2B, grüne Pfeile), entdeckt die gezeigt wurden, die klare Zelle Subpopulation von Co Kennzeichnung entsprechen mit der anerkannten klar Zellmarkierung, ATP6V1B1 (Abb. 2 b, rote Pfeile). In ähnlicher Weise sind repräsentative Marker, die nachweislich geeignet zur Unterscheidung der verschiedenen epididymal epithelialen Zelltypen in Tabelle 229,30,31 zusammengefasst. , 32 , 33 , 34.

Neben der Beschreibung der Techniken für die subzelluläre Lokalisation von Proteinen, die ihren Wohnsitz innerhalb der epididymal Epithels hier berichten wir auch unsere kürzlich optimierte Protokolle für die Untersuchung von sekretorischen Proteinen gekapselt innerhalb Epididymosomes, kleine extrazelluläre Vesikel, die einen wichtigen Bestandteil der luminalen Milieu für den Unterhalt zur Reifung und Lagerung von Spermien22darstellen. Zusammen bieten Schritt 2 und Abbildung 3 eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Darstellung der die Methodik für die Isolierung von hochangereichertem Populationen von Epididymosomes aus Maus Caput epididymal Gewebe. Insbesondere sind diese Methoden jedoch leicht anwendbar für die Isolierung von anderen Populationen von Epididymosomes mehr distalen epididymal Segmente aus. Aufgrund des Potenzials für die Kontamination von diesen Beispielen beschrieben wir auch strenge Charakterisierung Protokolle, die wir routinemäßig für jedes Epididymosome Vorbereitung beschäftigen. Dazu gehören die Beurteilung der Größe und Heterogenität der Epididymosome Bevölkerungen mit hochauflösende Elektronenmikroskopie und dynamische Lichtstreuung Techniken. Im Tandem, nutzen wir auch Immunoblotting Strategien um die Anreicherung von anerkannten extrazelluläre Vesikel Marker und die entsprechenden Abwesenheit von Proteinen, die charakteristisch für mögliche Verunreinigungen zu beurteilen (i.e., Anti-Hämoglobin (HBB) als ein Marker für Blut und Anti-Arachidonate 15-Lipoxygenase (ALOX15) und Anti-IZUMO1 Antikörper als Marker der zytoplasmatischen Tropfen- und Sperma Kontamination, beziehungsweise)22. Obwohl wir festgestellt haben, dass die Verunreinigungen selten sind, wenn sie auftreten, verwerfen wir sofort die Epididymosome Vorbereitung.

Die nicht-überlappende Lokalisierung von DNM Isoformen in Caput Nebenhodens aufgefordert, eine weitere Untersuchung ihrer potenziellen Rolle bei der Regulierung der epididymal Mikroumgebung. Zu diesem Zweck war eine Zelllinie verewigt mECap18 als ein in-vitro- Modell zur epididymal Zelle sekretorischen Aktivität genutzt. Vorherigen Charakterisierung dieser Zelllinie hat gezeigt, dass es eine gemischten Zellpopulation birgt die Flecken für entweder Haupt- oder klare Zelle Marker positiv. MECap18 Zellen haben darüber hinaus auch geeignet für die Berichterstattung physiologische profile epididymal gen und Protein Meinungsäußerung unter verschiedenen in-vitro- Behandlung Therapien35bewährt. Vor dem Einsatz wurde DNM Lokalisierung in kultivierten mECap18 Zellen durch Absetzen auf Poly-L-Lysin behandelten Deckgläsern (Abbildung 5A) und unterwerfen sie Immunofluoreszenz Erkennung beurteilt. In Übereinstimmung mit dem Verteilungsmuster in Caput epididymal Gewebeschnitte aufgezeichnet, DNM1 erkannt wurde in das Zytoplasma der mECap18 Zellen, während DNM2 konzentrierte sich innerhalb der Supranuclear Domäne dieser Zellen und DNM3 sich durch diskrete zeichnete Brennpunkte der Membran Färbung innerhalb einer kleinen Subpopulation Anzahl (zB., 11 %) der mECap18 Zellen, die ATP6V1B1 waren positiv (Abb. 5 b). Diese Daten bestätigen den Nutzen der mECap18 Zelle als wertvolle Ressource für die Untersuchung der Rolle von DNM bei der Regulierung der epididymal sekretorischen/absorptive Zellaktivität.

Dementsprechend beschreibt Schritt 4 die Methodik für die Analyse der mECap18 Zelle sekretorischen Aktivität; die Techniken, die zur Bewertung der Auswirkungen einer Reihe von verschiedenen experimentellen Bedingungen allgemein zugänglich sind. In unserer Studie angewendet wir selektiven pharmakologische Interventionen, um die Aktivität von DNM1 und DNM2 vor der Visualisierung und Quantifizierung des Profils der Proteine konditionierten mittlere21aus mECap18 Zellen freigesetzt zu unterdrücken. Ein wichtiges Merkmal dieser Analyse wurde jedoch um sicherzustellen, dass mECap18 Zellen wurden gründlich gewaschen und in der Abwesenheit von FBS-Supplementierung kultiviert. Während ein solcher Schritt unerlässlich, um die Kontamination von konditionierten Medium mit FBS abgeleitet Proteine auszuschließen war, trägt es doch das damit verbundenen Risiko einer mECap18 Zelle Wachstum und/oder Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Bei der Kontrolle für diese Möglichkeit, wir festgestellt, dass die mECap18-Zellinie FBS freie Kultur und die Einführung von DNM-Inhibitoren für die Dauer der Inkubation Fenster toleriert (i.e., 12 h). In der Tat blieb Zellviabilität im Laufe dieser Zeit über 90 % in allen experimentellen repliziert. Dieser Ansatz könnte daher als eine sinnvolle Proof-of-Concept-Strategie, die Funktion des bestimmten epididymal Proteine zu identifizieren, vor der Festlegung auf Investitionen in gen-Manipulation-Strategien dienen.

Hitze induzierte Epitop Retrieval Lösung 10 Mmol/L Natriumcitrat 50 Mmol/L Tris (pH 10,5)
Zeit 3 min 3 min
6 min 6 min
9 min 9 min
12 min. 12 min.

Tabelle 1 : Allgemeine Bedingungen für die Optimierung der Wärme-induzierte Antigen-Retrieval für die Verwendung mit Paraffin-eingebetteten epididymal Abschnitte. Die Fixierung-Prozess kann problematisch sein, da verschiedene Epitope erfordern oft den Einsatz von verschiedenen Fixierung Techniken, damit erfordern, dass die Methodik für jedes Antigen optimiert ist.

Epithelzelle Typ Verteilung Marker Referenzen (PMID)
Wichtigsten Zelle Gesamte Nebenhoden AQP9 11027599, 17360690
Klar Zelle Caput, Korpus und cauda V-ATPasen, CIC-5 19448084, 12475763
Basaliom Gesamte Nebenhoden CLDN1 11159859, 21441423
Engen Zelle Erste segment V-ATPasen, CIC-5 19448084, 12475763

Tabelle 2 : Repräsentative Marker für die Erkennung von verschiedenen primären epididymal epithelialen Zelltypen geeignet.

Figure 1
Abbildung 1: räumliche Ausdruck von DNM 2 innerhalb der proximalen Maus Nebenhoden. (A) schematische Modell der Nebenhoden Darstellung die Partitionierung auf die Maus Nebenhoden in 10 Zonen physisch getrennt Septen wie Turner und Kollegen20berichtet. In diesem Modell Zone 1 entspricht das erste Segment, Zonen 2 bis 5 entsprechen den Caput Nebenhoden, Zonen 6 und 7 entsprechen den Korpus Nebenhoden und Zonen 8-10 repräsentieren die Cauda Nebenhoden. (B-C) Immunfluoreszenz-Lokalisierung von DNM2 ergab Zone-spezifische Verteilungsmuster (gekennzeichnet durch weiße Pfeilspitze und Pfeil). Die Grenze zwischen Zone 1 und 2 ist durch eine gepunktete Linie abgegrenzt oder mit gelben Pfeilen gekennzeichnet. (D) DNM2 drückt sich auch in der Peri-acrosomal Domäne von Spermien aus dem Caput Nebenhoden isoliert. Jedoch wurde keine solche Flecken routinemäßig luminalen Spermien innerhalb der entsprechenden epididymal Abschnitte festgestellt. EP, Epithelzellen; l, Lumen; Neg, Sekundärantikörper nur Kontrolle. Experimente wurden auf Material von drei Tieren repliziert und repräsentative Immunfluoreszenz Bilder präsentiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Immunfluoreszenz Nachweis von DNM 1 und DNM 3 in der Maus Caput Nebenhoden. (A) die Lokalisierung von DNM136 wurde in der Maus Caput Nebenhoden geprüft. (B) Co Lokalisierung des DNM336 und die klare Zellmarkierung, ATP6V1B137 in der Maus Caput Nebenhoden. Diese Analyse bestätigt, dass beide DNM3 (grüne Pfeile) und ATP6V1B1 (rote Pfeile) befinden sich in der klaren Zellpopulation Sub aber minimal subzellulären Überlappung anzuzeigen. EP, Epithelzellen; Int, Interstitium; l, Lumen; SP, Sperma; Neg, Sekundärantikörper nur Kontrolle. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) counterstained. Experimente wurden auf Material von drei Tieren repliziert und repräsentative Immunfluoreszenz Bilder präsentiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Isolierung Protokolle zur Bereicherung der Maus Caput Epididymosomes. Nach der Präparation ist Caput epididymal Gewebe in ein Tröpfchen der BWW-Medium eingetaucht und eingeschnitten, um den luminalen Inhalt freizugeben. Die luminalen Flüssigkeit wird dann durch eine 70 µm Membran gefiltert und die daraus resultierende Aussetzung wird zentrifugiert, um Geschwindigkeit zu erhöhen, um jede restliche zellenrückstand pellet. Das ausgeglichene Fahrwerk ist dann Spitze von einer diskontinuierlichen Dichtegradienten (Iodixanol Lösung) geladen und über Nacht Ultrazentrifugation unterzogen. Epididymosomes-Partition in Fraktionen 9-11, die gebündelt sind, über Verdünnung in PBS gewaschen und kehrte nach der Ultrazentrifuge, pellet-die Epididymosomes. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Beurteilung der Reinheit der Epididymosome. Gleiche zwölf Fraktionen wurden geborgen, nach der Ultrazentrifugation des Farbverlaufs und ein Aliquot der einzelnen vorbereitet (A) Protein und RNA Quantifizierung, (B) Größe Heterogenität Bewertung mithilfe von dynamischen Lichtstreuung und (C). Immunoblot Analyse der Epididymosome Marker Verteilung. Zusätzliche Charakterisierung Schritte enthalten (D) Dual-Kennzeichnung von Epididymosomes konzentriert auf Aldehyd/Sulfat Latex Perlen, (E) Übertragung Elektronenmikroskopie Beurteilung und (F) Immunoblot Beurteilung der Spermien (Spermien) und Erythrozyten (RBC) Kontamination mit Anti-Arachidonate 15-Lipoxygenase (ALOX15, zytoplasmatischen Tröpfchen/Sperma Kontamination) oder Anti-Hämoglobin (HBB, RBC Kontamination). Immunoblots wurden auch mit bekannten Epididymosome Cargo (26S Proteasom-ATPase regulatorische Untereinheit 7, PSMD7, Heat Shock Protein 90kDa Beta-Mitglied 1, HSP90B1; und Beta-Tubulin, TUBB) sondiert. Diese Daten wurden ursprünglich veröffentlicht in wissenschaftlichen Berichten (PMID: 27549865) und haben hier mit Genehmigung des Herausgebers, Springer Natur reproduziert worden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Immunfluoreszenz Erkennung von DNM Isoformen in den mECap18 Zellen offenbaren Verteilung Muster, dass Übereinstimmung mit denen im Caput epididymal Gewebe erkannt. (A) schematische Deckglas Vorbereitung für sterile mECap18 Zellkultur. (B) repräsentative Immunfluoreszenz Bilder von DNM Färbung offenbarten zellulären Verteilungsmuster (Pfeile und Einschub (doppelte Kennzeichnung von DNM3 und klare Zellmarkierung ATP6V1B1)), die diejenigen innerhalb epididymal Gewebeschnitte erkannt gespiegelt. Zellkerne wurden mit Propidium Jodid (PI; rot) oder DAPI (blau) counterstained. Experimente wurden auf Material von drei Tieren repliziert und repräsentative Immunfluoreszenz Bilder präsentiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Diese Studien integriert den Einsatz von Bouins festen epididymal Gewebe, das Paraffin einbetten und strukturierendes Standardprotokolle unterzogen hatte. Bouins Fixativ Lösung besteht aus einer Mischung von Formaldehyd, Pikrinsäure und Essigsäure, bei jeder Komponente mit einer spezifischen und ergänzende Funktion. So Formaldehyd reagiert mit primären Aminen Protein Querverbindungen zu bilden, Pikrinsäure langsam durchdringt das Gewebe Salze bilden und somit Koagulation von grundlegenden Proteine und umgekehrt, Essigsäure schnell durchdringt das Gewebe und verursacht die Koagulation von Nukleinsäuren. Diese kombinierten Eigenschaften haben als ein Fixiermittel der Wahl für die Erhaltung der morphologischen Detail Bouins erzeugt und seine Verwendung ist weithin in der epididymal Literatur berichtet. Bouins Lösung ist jedoch nicht ohne seine Grenzen, die die Neigung für Fixativ induzierte Fluoreszenz und Formaldehyd induzierte Vernetzung zu umfassen, die Ziel-Antigene verdecken kann.

Das Potenzial für Hintergrundfluoreszenz erfordert die Einsatz strenge Negativkontrollen, die in unseren Studien beinhalten der Auslassung des primären Antikörpers, Verzicht auf den sekundären Antikörper, und wo die Reagenzien verfügbar sind, die Verwendung von primären Antikörper preabsorbed gegen die immunisierende Peptid, aus dem sie generiert wurden. Einzelheiten zur Anwendung solcher Kontrollen sind in unserer vorherigen Studie von Dynamin DNM Ausdruck in der Maus Nebenhoden21veranschaulicht. Im Idealfall solche Ergebnisse sollten auch überprüft werden, durch die Verwendung von Gewebe tierischen Ursprungs ko, aber dieses Material ist nicht immer leicht zugänglich. In dem Bemühen um das sekundäre Problem der vernetzten oder chemisch modifizierte Ziel Antigene zu begegnen, ist es häufig notwendig, irgendeine Form von Antigen-Retrieval durchzuführen, um Epitope durch Fixierung verändert zu entlarven und dadurch zur Wiederherstellung ihres Potenzials für Antikörper Bindung. Die Methodik für den Abruf hängt von vielen Variablen, einschließlich das Ziel-Antigen, Antikörper, Gewebetyp und die Art der Fixierung. Jedoch sind die am weitesten verbreiteten Techniken die Anwendung entweder Wärme vermittelt oder proteolytische induzierte Antigen-Retrieval. Die ehemaligen Funktionen wie unsere favorisierte Ansatz durch eine höhere Erfolgsquote für die Wiederherstellung der Immunoreactivity, mit den Details der Wärme-Therapien und Retrieval-Lösungen, die nutzen wir häufig in Tabelle 1dokumentiert. Wir warnen jedoch, dass dies keine vollständige Liste ist und letztlich erfordert die Optimierung der Antigen-Retrieval für jedes Protein-Ziel/Antikörper-Kombination Vorstudien mit einer Matrix von Zeit, Temperatur und pH-Wert-Kombinationen. Weitere Überlegungen sind das Potenzial für den Abruf der Hitze zu Gewebeschäden hervorrufen und/oder verursachen artifizielle beschriften. So beziehen wir neben der Anwendung von den Negativkontrollen oben dokumentiert, auch routinemäßig Positivkontrollen mit Antikörpern, wie Anti-Golgin-97, die unterschiedliche zellulare Organellen zu erkennen.

In dem Bemühen um festzustellen, ob Proteine wie die Angehörigen der Familie DNM überflüssig, im Gegensatz zu ergänzenden Funktionen im epididymal Gewebe erfüllen, haben wir es besonders aufschlussreich, doppelte Kennzeichnung Experimente wie die gefunden in Abbildung 2 bdargestellt. Diese Strategie umfasst die fortlaufende Kennzeichnung der Gewebeschnitte mit Paare von primären Antikörper (aufgewachsen in verschiedenen Arten) folgten entsprechende Sekundärantikörper konjugierte zu verschiedenen Fluorophore. Allerdings ist eine verwirrende Funktion, die gelegentlich entsteht in dem Bemühen, diese doppelte Kennzeichnung Studien durchführen die Unvereinbarkeit der Antigen Abruf Protokolle für optimale Beschriftung mit jedem Primärantikörper benötigt. Diese Einschränkung wurde gefunden bei Co Etikettierung von DNM 2 und Golgin-97 in der Maus Caput Nebenhoden, führt uns zu aufeinander folgenden Serienschnitte (im Gegensatz zu den gleichen Abschnitt)21verwenden. Entweder dieser Ansätze sind jedoch äußerst nützlich im Zusammenhang mit der Zuschreibung Protein-Expression zu einem bestimmten Zelltyp unter denen in der pseudostratified epididymal Epithel vertreten. Mit diesem Ziel vor Augen haben wir eine Liste mit repräsentativen Zelle Art Marker und ihre gemeldeten Verteilungsmuster entlang der Länge der epididymal Röhrchen (Tabelle 2) enthalten. Wenn man Zelltyp hinausgehen und die subzelluläre Verteilung der Zielproteine erkunden will, bietet die Verwendung von doppelten Etikettierung mit anerkannten Organelle Marker, z. B. Golgin-97, deutliche Vorteile. Alternativ bleibt die Anwendung der hochauflösende Elektronenmikroskopie im Tandem mit Immunogold Kennzeichnung, die Methode der Wahl für die detaillierte Ultrastrukturforschung Lokalisierung und Validierung der Färbung Muster mittels Immunfluoreszenz21 .

Unter den Beschränkungen durch das Studium der Epididymosomes gestellt sind ihre geringe Größe und die Schwierigkeit, ausreichende Mengen für detaillierte Endpunkt Analysen, insbesondere in allgemein verwendet Labor Arten wie die Maus. Jedoch durch aufbauend auf die bahnbrechenden Studien von Sullivan und Kollegen38,39,40, konnten wir robuste Methodik zur Epididymosome Isolation von der Maus zu optimieren (siehe Schritt 2). Wir jedoch die Notwendigkeit, strenge Kontrollen zu beurteilen und physikalischen Eigenschaften des angereicherten Epididymosome Populationen41 durch die mögliche Kontamination von Spermien, zytoplasmatischen Tröpfchen und/oder Blut übertragbare exosomen (betonen (siehe Abbildung 4). Zu diesem Zweck verwenden wir routinemäßig eine Kombination aus: (i) hochauflösende Elektronenmikroskopie, die Größe und Heterogenität der Epididymosome Vorbereitung, (Ii) die Berechnung der mittleren Größe und Heterogenität (Iii) Partikelkonzentration der visualisieren die Epididymosomes auf 4 µm Aldehyd/Sulfat Latex Perlen und fluoreszierende Kennzeichnung von anerkannt exosom oberflächenmarker, einschließlich CD9 und FLOT1, und (iv) Immunoblotting des isolierten Epididymosomes mit einer Suite von Antikörpern empfohlen für experimentelle Validierung von exosomen (zB., Anti-CD9, Anti-FLOT1), sowie als Negativkontrollen entsprechenden Antigene, die Spermien (Anti-IZUMO1), Sperma zytoplasmatischen Tröpfchen (Anti-ALOX15) oder Blut (Anti-HBB)22beschränkt werden soll. Wenn diese Standards eingehalten werden, dann die Epididymosome Vorbereitungen isoliert sind leicht zugänglich für den Einsatz in downstream-Anwendungen einschließlich Co Inkubation mit Spermien und/oder Fracht Profilerstellung22,42, analysiert die sind leistungsfähige Ansätze zur Verbesserung unser Verständnis der Rolle der Epididymosomes bei der Regulierung der epididymal Sperma Reifung1.

In dieser Studie beschreiben wir die Anwendung einer Zelllinie SV40 verewigt Maus Caput epididymal epithelialen (mECap18), die wir genutzt haben, um die Beteiligung von DNM in der Regulierung der epididymal sekretorischen Aktivität21 sowie die Auswirkungen der Studie Umweltgifte auf epididymal Physiologie43. Ein wichtiges Merkmal der mECap18 Zelllinie ist, dass es eine repräsentative Bevölkerung von beiden Haupt- und klare Zellen21,35,44phänotypischen Stabilität zwischen Passagen und Features angezeigt. Im Vergleich zu primären epididymal Zellkulturen, zeigt die mECap18-Zell-Linie auch Toleranz gegenüber Kultivierung im fetalen Kälberserum freie Medium, das die Dauer und Art der experimentelle Interventionen erstreckt sich diese Zellen, ausgesetzt werden kann und auch permissive der Wiederherstellung einer höhere Menge an sekretierten Proteine aus dem konditionierten Medium. Eine Einschränkung der mECap18 Zelllinie ist jedoch, dass es wurde verewigt und kann somit reagieren unterschiedlich auf stress und / oder immunvermittelte Reize im Vergleich zu der Primärzelle Kulturen oder diese Zellen in Vivopräsentieren. Mit dieser Einschränkung im Auge empfiehlt es sich, die erzielten Ergebnisse mit mECap18 Zellen in Vivo Antworten, wann immer möglich zu vergleichen. Zusammenfassend lässt sich sagen markieren Sie die Protokolle, die wir beschreiben die Nützlichkeit dieser Zelllinie als ein Werkzeug, um die Funktionalität der Zielproteine innerhalb der Caput Nebenhoden Studium beginnen. In der Tat, in Kombination mit dem Einsatz von kommerziellen Protein-Inhibitoren und/oder Genom-editing-Tools (z. B. CRISPR-Cas9) hält die mECap18 Zelllinie erhebliches Potenzial, um die mechanistische Grundlage der epididymal Funktion zu beheben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren möchten die nationale Gesundheit und medizinische Forschung Rat von Australien Project Grant APP1103176 für die Unterstützung dieser Arbeit anerkennen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynamin 1 antibody Abcam ab108458 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 2 antibody Santa Cruz sc-6400 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 3 antibody Proteintech 14737-1-AP Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ATP6V1B1 antibody Santa Cruz sc-21206 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
CD9 antibody BD Pharmingen 553758 Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal
Flotillin-1 antibody Sigma F1180 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ALOX15 antibody Abcam ab80221 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
TUBB antibody Santa Cruz sc-5274 Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal
PSMD7 antibody Abcam ab11436 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit Alexa Fluor 488 Thermo A11008 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 488 Thermo A11055 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 594 Thermo A11058 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594 Thermo A11007 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit HRP Millipore DC03L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat HRP Millipore DC01L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Mouse HRP Santa Cruz sc-2005 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9564
propidium iodide (PI) Sigma P4170
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS-F
DMEM Thermo 11960-044
L-glutamine Thermo 25030-081
penicillin/streptomycin Thermo 15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN Sigma A8380
sodium pyruvate Thermo 11360-070
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma T4049
Paraformaldehyde (PFA) EMS 15710
Xylene VWR Chemicals 1330-20-7
Ethanol VWR Chemicals 64-17-5
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417
Sodium citrate Sigma S1804
Tris Astral 0497-5KG
Glycerol Sigma G5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane Sigma D2522
Poly-L-gysine Sigma P4832
Triton X-100 Sigma 78787
Trypan blue Sigma T6146
Trichloroacetic acid Sigma T9159
Acetone Ajax Finechem A6-2.5 L GL
Sucrose Sigma S0389
Poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
D-Glucose Ajax Finechem 783-500G
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Fluorescence microscopy Zeiss Zeiss Axio Imager A1
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER Optima Max-XP
Microcentrifuges Eppendorf 5424R
Incubator Heracell 150
Large Orbital Shaker Ratek OM7
Microwave LG MS3840SR /00
Lab pH Meter MeterLab PHM220
Liquid-repellent slide marker Daido Sangyo Mini
Coverslip Thermo 586
6 well plate CELLSTAR 657160
12 well plate CELLSTAR 665180
Slide Mikro-Glass SF41296PLMK
0.45 µm filter Millox-HV SLHV033RS
Kimwipes Dustfree Paper KIMTECH 34155
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) BECKMAN COULTER 347356
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) BECKMAN COULTER 362305
Cell strainer 70 µm Nylon FALCON 352350
Petri dish 35 × 10 mm with cams SARSTED 82.1135.500
Slide jar TRAJAN #23 319 00

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 138 Dynamin Nebenhoden Epididymosome exosom Immunfluoreszenz Protein Sekretion Sperma spermienreifung
Analyse der Epididymal Protein-Synthese und Sekretion
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Zhou, W., Sipilä, P., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion. J. Vis. Exp. (138), e58308, doi:10.3791/58308 (2018).

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