Summary
该算法的目的是用序列图像伸缩和寻连续测量两个2维边缘之间的距离。该算法可应用于心脏结构生物学、血管生物学和土木工程等多种领域。
Abstract
最近描述的细胞外 nanodomain, 称为 perinexus, 已牵连到 ephaptic 耦合, 这是一个替代机制的电传导心肌细胞。目前用人工分割方法对空间进行量化是很慢的, 空间分辨率也很低。我们开发了一种算法, 使用序列图像伸缩二进制轮廓来计算两个对立的2维边缘之间的像素数。该算法在保持手动过程的重现性的同时, 需要较少的人工时间, 并且具有比手动方法更高的空间分辨率。事实上, 经验丰富的新手调查员能够用这个新算法重述以前研究的结果。该算法受人力输入的限制, 需要手动勾勒出 perinexus 和计算能力, 主要是由预先存在的寻算法所担保。然而, 该算法的高通量能力, 高的空间分辨率和再现性使它成为一个多功能和健壮的测量工具, 用于跨各种应用, 需要测量的距离在任何2维 (2D边缘.
Introduction
建立了以下算法来测量两个结构耦合的心肌细胞之间的膜间隙距离, 它们分别在一个称为 perinexus1的 nanodomain 的缝隙连接斑块的边缘处, 它具有被牵连在 ephaptic 耦合2,3,4,5。在对 perinexi 的上百个透射电镜 (TEM) 图像进行分析的过程中, 采用人工分割方法在前一项研究6中, 确定了一种更高吞吐量的采样 perinexal 宽度的方法。空间分辨率, 同时保持了以前手工分割过程的准确性, 线是绘制15毫微米间隔, 近似正交到中线, 以测量 perinexal 宽度。新算法采用一个像素厚的两条平行线的二进制轮廓, 并使用序列图像伸缩来计算两个膜之间的像素数。虽然图像伸缩在许多图像处理应用中被广泛使用, 其中包括轮廓或边缘检测7、8, 但该算法使用伸缩作为计数机制。然后使用寻算法9和 perinexal 宽度来隔离中心线, 然后沿 perinexus 长度的分辨率测量图像的分辨率。在这种情况下, 分辨率的差异是1测量每15毫微米为人工分割和1测量每0.34 毫微米与新的算法, 44 倍增加空间采样频率。此外, 这种增加的取样频率在大约1/5 的时间内完成人工分割所需。
这个算法将使用在它的当前形式测量 perinexal 宽度在常规0-150 毫微米从缝隙连接匾5 (GJ) 的边缘并且在感兴趣的指定的区域之内, perinexus 高原在30和105毫微米2之间,3,10. 取样频率的增加减少了个别 perinexus 测量与人工分割相比的可变性, 大大缩短了分析时间, 从而可以有效地处理大型数据集。然而, 这个程序并不局限于纳米 TEM 图像的心脏夹层盘。同样的方法可以用来量化血管直径, 心室射出分数, 甚至非生物现象, 如河流侵蚀或洪水。该算法适用于量化任意两个准平行边之间的距离。
Protocol
注: 需要的软件是 ImageJ (或类似的图像修改软件) 和 Matlab R2015。用户可能会遇到与其他版本的 Matlab 的兼容性问题。
1. 预处理图像
- 对于任何灰度图像, 请确保任何给定像素的最大强度值为 < 255。这通常是通过从自定义的 Matlab 程序 "ImageSub" 中的图像中减去1的值来完成的, 包括在补充文件 S1 中。
2. 概述 Perinexus
- 概述 ImageJ 或其他图像处理软件中的 perinexus。
- 确保轮廓为一个像素厚, 并设置为图像中的最高强度值 (灰度图像中的 255, 从0到 255)。
- 确定 GJ 的 pentalaminar 结构11,12, 并定义 perinexus 的开始, 作为两个对立的细胞膜双层分歧点, 如图 1A所示。从 GJ 的边缘开始 ~ 200 毫微米, 沿着第一个细胞的内膜追踪, 沿着第二个细胞的内膜返回。在 ImageJ 中, 松开钢笔以自动关闭轮廓。这种人工关闭将在以后裁剪出来。
注意: 在尽可能高的放大倍数的情况下, perinexus 的轮廓是至关重要的, 因为即使是小的错误应用, 轮廓也会在最终测量中产生几纳米的误差。
3. 设置算法和选择 Perinexus 的兴趣
注意: 寻算法要求签名、边缘、图形、节点和寻函数9与 MembraneSepDist m 文件位于同一目录中。所有文件都可以在补充文件 S1 中找到。
- 选择保存数据和数字的位置。这些当前被硬编码到 m 文件中。
注意: 程序的第一行是清除所有变量的函数, 关闭所有窗口并清除命令窗口。在运行 m 文件之前保存任何所需的变量或数字。
注意: 软件截图包含在附加文件 S2 中, 用于所有硬编码值。 - 运行程序 "MembraneSepDist"。
- 设置参数。
注意: GUI 将弹出一个渐变阈值、刻度、感兴趣区域和手动启动的默认参数。可以在 m 文件中更改默认值, 也可以为每个单独的图像更改它们。- 设置空间导数梯度阈值。
注意: 较高的值会导致在中线隔离中选择更多的点。值太高或过低 (范围约为 3.0-7.9) 可能导致计算效率低下或不精确地选择产生不精确中线隔离的中线点 (见图 2a C)。 - 以像素/刻度单位设置刻度。
- 设置感兴趣区域的空间下限和上限。
注: 根据我们实验室的约定, 所定义的感兴趣区域介于30和105毫微米之间, 从 GJ2、3、10的边缘。 - 设置自动/手动启动。在大多数情况下, 该算法准确地检测出缝隙连接端和 perinexus 开始处的起点。但是, 在某些情况下, 不规则形状的 perinexi, 用户必须手动识别起始点。将此值设置为0自动, 1 用于手动。
- 设置空间导数梯度阈值。
- 选择所需的图像。
注意: 文件选择文件夹可以在 m 文件中更改。 - 裁剪图像以选择感兴趣的 perinexus。
- 当图像出现时, 光标将自动变为十字线。通过在感兴趣的 perinexus 周围拖动框来裁剪图像 (请参见图 3)。可以通过使用角和边上的正方形来调整裁剪框, 使其更大或更小。
- 裁剪时, 请确保 perinexus 的 "打开" 端 (与 GJ 最远, 见图 3) 被裁剪, 以便两个膜轮廓达到裁剪图像的边缘。
注: 建议使图像全屏, 以更容易地看到 perinexus 的兴趣和作物适当。
- 通过双击要测量的对立边之间的光标, 选择最终裁剪。
注意: 在 perinexus 中执行双击是非常关键的。如果程序无法识别中心线, 请重新启动程序, 并确保在 perinexus 中发生单击。 - 观察最后的中线后, 所有的伸缩和侵蚀弹出的最终用户评估的程序的功效。
注意: 在程序运行时, 屏幕上会出现一个对话框, 通知用户, 在程序完成之前, Matlab 将无法处理任何其他命令。此过程需要多长时间取决于阵列 (图像) 大小和计算机处理能力。 - 如果启用了手动启动点, 请观察中心线的图像在原始解剖图像上弹出, 连同交叉发光标 (参见图 2E)。在所需起始点附近选择 perinexus 以外的点。
注意: 程序将找到最接近所选像素的中线点, 并将其用作起点。 - 记录数据。
注意: 一旦程序完成, 程序将返回一个映射中心线, 绘制 perinexal 宽度作为距离 GJ 边缘的函数。此外, 该程序将返回从 GJ 边缘到 150 nm 的平均 perinexal 宽度, 以及在 Matlab 命令行中定义的感兴趣区域内的平均值。Wp值和从 GJ 的距离存储在变量 "WpList" 中, 或者用户可以单独手动记录它们。
4. 算法故障排除
- 如果中心线未正确标识 (图 2A), 请打开图形 "Gmag", 并使用该索引标识适当的渐变阈值 (图 2C)。
- 如果未正确标识起始点, 请手动设置起始点 (参见协议 3.8)。
Representative Results
统计方法:实验组采用学生 t 检验进行比较。p 值 < 0.05 被认为是重要的, 所有的值都表示为平均值的标准偏差。
手动分割。GJ 邻 perinexus nanodomain 宽度 (Wp) 的量化通常是通过人工分割实现的。此手动分割过程演示在图 1A中, 并描述了以前的6。观察者识别 GJ 的边缘 (图 1, 红点), 测量沿 perinexus 中心的 5nm, 并测量膜在该点之间的距离。然后在10、15、30和每 15 nm 上重复该过程, 直至 150 nm。这一技术虽然有效, 但在 perinexus 的长度下, 有时间和空间下取样的限制。
来自先前研究的平均值 Wp的测量值可以从大约10到 20 nm2、3、10和 3 nm, 似乎是检测统计意义所需的平均值差异, 这远远高于每个测量的空间采样频率为 0.7 nm, 基于 interpixel 分辨率为 0.34 nm。因此, 虽然人工分割耗时, 但该方法足以测量与干预或疾病状态相关的 Wp的差异。
串行图像伸缩.为了用适当的空间分辨率快速、重现的方式测量 perinexus, 我们开发了一个基于序列图像伸缩的程序来计算两个人工跟踪膜之间的像素,图 1B 所示..
序列膨胀过程如图 4所示。当二进制图像放大 (图 4A-4D), 那膨胀然后被倒置并且增加到工作图像-原始的概要的非二进制形式 (图 4E-4H)。该过程将重复, 直到大纲完全填满 (图 4D)。此时, 最终的工作图像 (图 4H) 是一个特定像素保持不扩张的次数的计数。因此, 细胞膜的轮廓附近的值非常低, 而中心的值是最高的。通过计算每个点上的伸缩数, 可以计算出膜边缘之间的距离。下一个挑战是确定和隔离中线, 以量化 perinexal 宽度作为距离的函数 GJ, 这是通过首先应用空间导数的最终工作图像 (图 2-最后的图像,图5 A)。另一个更不规则形状的 perinexus 的例子可以在补充文件 S3 中找到。
中线标识.最终工作图像的梯度可以通过空间导数进行量化, 因为从边缘到边缘的膨胀计数值从高到低再到高 (图 5左向右)。考虑到空间导数的大小 (图 5B), 轮廓和中心线以白色箭头突出显示, 可立即识别为不连续区域。在这些位置上, 渐变方向由递增变为递减, 反之亦然。应用阈值 (图 5C) 生成中心线和轮廓的二进制图像, 并减去原始轮廓生成独立中线 (图 5D)。虽然这种隔离中心线的方法计算效率高, 但适用于空间导数的阈值在产生的中心线上产生间隙。这些间隙 (图 5D, 插入) 必须填补, 以提供准确的测量距离从 GJ 和确保 perinexus 的整体测量。首先, 中心线被放大以填充任何间隙 (图 5E), 后跟一个侵蚀 (图 5F) 和一个 "bwmorph" 函数 (操作 = ' skel ', n = inf), 以消除尽可能多的点, 同时留下一个连续中线, 从而提高瓦西特 Limprasert 开发的后续寻算法的计算效率, 并可在 MATLAB 中心9中使用。这种膨胀侵蚀函数产生了已完成的中心线, 并与最终的工作图像 (图 5G) 相结合。然而, 这个中心线通常是超过一个像素厚, 因此不是一个精确的中心线的隔离。
瓦西特 Limprasert 寻算法用于确定 perinexus 中心线。寻算法能够跟踪最高值-在这种情况下, 最接近中心的值保持不扩张, 通过沿中线的大多数迭代 (图 5G, 插入)。结果是中线的自动跟踪, 如图 6所示。通过隔离中心线, perinexal 宽度可以显示为从 GJ 末尾的距离函数, 如图 6B (顶部) 所示, 或者是指定区域的平均宽度。
内核分析.重要的是要注意的是, 数字化图像是基于方形阵列和膨胀核同样是基于平方矩阵。这意味着横跨对角线的膨胀距离大于正交。因此, 我们接下来试图确定内核是否影响了算法的结果。为了量化核特定的可变性, 分析了五种不同的内核形状: "加号" (上述分析中使用的形状)、"X"、"方框" 和 "线条", 如图 7A所述。内核在二进制图像的每个非零点上应用。图 7A的每个内核中的星代表中心, 其中白色是1的值, 而黑色是膨胀内核的0。
每个内核对单个近似水平 perinexal 图像的平均 Wp测量的影响 (图 7B, 顶部), 由经验丰富的用户量化, 是通过使用 Matlab 的 "imrotate" 命令旋转图像来确定的, 并且在10°的台阶上计算 Wp 。Wp测量值 (图 7B, 底部) 随图像方向在整流正弦时尚与一个加号形状的内核浮动。当相对直的 perinexus 垂直或水平方向时, 会发生最低值。无论是X、框还是线核, 都没有比加形内核更有优势。X和盒核产生了相同的结果, 但是在45°中, 平均 Wp的值与e 加内核不相符合。线内核无法在某些角度完全放大图像, 因为绿色跟踪中没有数据, 图像旋转少于30或超过145°。因此, 正交加膨胀核过高估计膜分离时, 扩张的 perinexus 以轴为方向对角例如在大约 45°, 和X和盒核低估了平均值 Wp当 perinexus 的长轴也在45°的时候。在此基础上, 我们开发了一个修正因子, 应用于由加形核扩张产生的数值。为了解释与图像方向相关的膜分离的高估, 这个修正因子乘以测量的宽度值, 这取决于图像的方向 (等式 1)。
如果θ < 45°
wp 校正 = cosd(θ) * wp 测量
如果θ≥45°
wp 校正 = cosd(θ) * Wp 测量 (等式 1)
在这个等式中, wp测量是由上述算法产生的原始 Wp值, θ是从水平上计算的角度, 以度为单位。θ的计算方法是将水平方向上的总变化的逆正切除以 perinexal 中心线垂直方向的总变化。上述校正接近 perinexus 的平均角度 (图 8a, 左上角), 结果在测量中, 如从水平 perinexus 获得 (图 8A, 左下)。这个等式背后的基本原理来源于一个事实, 那就是加号形状的内核 (图 7A) 实质上是两个线状的内核, 它们彼此排列正交。因此, 在45°以下 (接近水平), 伸缩发生垂直, 因此乘以角度的余弦给出正确的测量。反之, 对于45°以上的角度 (接近垂直), 伸缩会水平发生, 正弦用于确定正确的测量。在精确45°上, 正弦和余弦相等。补充文件 S4 提供了这个概念的描述。请注意, 这一修正是基于平均角度和谨慎应使用时, 分析实质性的非线性形状。这一过程在20随机选择的 perinexi 上重复进行, 修正后的测量与人工旋转和重新分析图像所获得的测量结果密切相关 (图 8A, 右)。为了确认图像方向的精确校正, 生成了两组幻像边缘 (图 8B、左) 和旋转的180°。通过三角校正, 算法在每个方向上准确地返回正确的值, 而不管空间分辨率或图像大小 (图 8B, 右)。
分析应用和重现性与方位校正.回顾以前的研究使用人工分割报告统计学上显著的平均值 Wp差异大于或等于 3 nm, 重要的是要确定是否可以使用该算法重述以前的发现使用完整的数据集。使用新的算法, 两个观察者-一个经验和一个小看与 perinexal 分析 (obs 1 和 obs 2 分别)-分析了相同的图像, 从以前的研究6 , 其中包括12名患者被诊断为心房纤颤 (AF) 在组织收集之前和29位没有预先存在的 af (无 af) 的患者。有经验的用户发现, 在心房颤动患者中, Wp明显大于无 af (21.9±2.5 和 18.4±2.0 nm, 分别为图 9A)。这些具有校正因子的值类似于以前报告的 (24.4±2.2 nm 和 20.7±2.4 nm 分别)6。重要的是, 没有经验的用户发现了相同的显著差异 (22.1±2.8 nm 和20.1±2.6 纳米, 分别) 疾病状态与自动化程序。此外, Wp值的标准偏差没有随修正因子的改变而变化, 表明 2-3 nm 的标准偏差不是算法的工件, 而是结构本身和组织处理。结果表明, 所提出的自动化方法能够综述前人研究的结果。
重要的是, perinexus 是一个最近定义的结构, 并没有达成共识的范围内膜分离的绝对价值, 毗邻 GJ2,3。由于外膜-外膜 GJ 宽度以前估计为 20 nm13, 我们试图通过测量 GJ 宽度来确定算法的有效性。两名观察者发现, 有或没有预先存在的房颤患者的间隙连接宽度 (GJW) 之间没有显著差异 (图 9B)。af 和非 af 患者的绝对 GJW 值分别为有经验的观察者和 21.0 @ 3.1 nm 和 20.0 @ 2.2 nm, 与以前报告的相似, 是 20.5 2.5 毫微米和 20.3-1.9 nm。
为了确定自动算法是否需要比人工分割更少的时间来分析数据, 经验丰富和经验不足的用户记录了量化10映像培训集所需的时间 (补充文件 S5)。表 1表明, 经验丰富和经验不足的用户分别使用相对于手动分割方法的自动算法将分析时间减少了4.7 和8.3 倍, 在空间上大约增加了43倍决议沿 perinexus。
算法故障排除。当最终中线不结束于图像边缘时, 运行该算法时发生的最常见错误。在这种情况下, 没有从空间导数映射中选择足够的点, 导致程序失败并产生错误信息, 建议用户选择较大的裁剪区域或增加空间导数阈值。在某些情况下, 绘制较大的裁剪盒可以提高程序的可靠性, 因为空间导数在图的边缘急剧变化, 这会破坏寻或边缘检测算法。
寻算法也可能无法正确识别中心线, 即使中心线到达图像的边缘, 特别是如果渐变阈值过低 (图 2A)。如果渐变阈值设置得太高, 将会有更多不必要的点加入到寻算法中 (图 2B), 从而降低了计算效率。如果用户无法确定适当的阈值, 则由程序生成并可在工作区中找到的图像阵列 "GMag" (图 2C) 可帮助用户确定阈值。沿中心线查找点, 并将阈值稍高于其索引值, 以确保选中这些点。在给定的示例中, 适当的阈值将高于 5.1 (图 2C, 插入)。
起始点也可能无法到达 perinexus 的开始位置 (图 2D)。在这种情况下, 重新运行程序并将手动启动值设置为1。在中心线被隔离后, 用户将选择 perinexus 之外的点, 并将最接近所选像素的中心线点 (图 2E, 红色正方形) 设置为起点。结果是完整的中线 (图 2F)。
图 1: 具有量化过程的 TEM 图像。手动分割过程 (A) 要求用户在估计中线时执行12个单独的膜间隙测量。自动过程 (B) 需要手动、连续地跟踪 perinexus 的轮廓。每个图像中的红色点表示 GJ 的用户标识的结尾和 perinexus 的开始。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 中线故障排除.中线识别的两种主要失效模式及其解决方案: 每个图像都用 Matlab 中的数组名称标记。如果渐变阈值过低 (A, 阈值为 0.2), 中线算法可能会失败。设置阈值过高 (B, 阈值 70) 可以降低寻算法的计算效率。可以从 GMag 数组 (C、插入) 确定适当的渐变阈值。如果中心线无法到达 perinexus (D) 的开始边缘, 则用户可以选择手动选择起始点。在 "开始点" 选项在打开的 GUI 中设置为1后, 用户然后选择 perinexus以外的点 (E)。最终的结果应该是一个中线, 准确地描述 perinexus (F) 的整体。报价单中的所有标签 (-f) 对应于 Matlab 中的变量名称。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: Perinexus 选择.要裁剪 perinexus, 请单击并按住鼠标拖动框周围 (裁剪工具是自动选择的), 如蓝色箭头所示。此框可通过使用边和角上的正方形来调整, 使其变大或更小。绿色箭头表示 perinexus 的末尾, 用户应确保其保持 "打开"。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 串行图像伸缩.二进制轮廓以一像素增量重复放大 (A D), 并添加到工作图像 (图像的非二进制形式, E H) 在每次膨胀后。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5:中心线隔离和寻。空间导数是从最终的工作图像 (A) 计算出来的, 空间导数 (B) 的大小被用来隔离轮廓和中线 (白色箭头)。用户定义的阈值标识轮廓和中线, 并减去原始轮廓生成中线 (D)。但是, 由于阈值 (D 插入) 的原因, 在中线中出现间隙。为了产生连续中线, 在隔离中线 (E) 上执行二次扩张, 其次是二次侵蚀, 以提高后续寻算法的计算效率。这个被腐蚀的图像 (F) 然后与最后的工作图像结合, 允许标识一个连续的, 单像素厚的中线 (G 插入)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 最终数据演示.该程序输出的最终轮廓上的原始 TEM 图像 (A)。线是颜色被编码的绿色为0-150 毫微米, 蓝色为用户定义的区域兴趣和红色为区域在150毫微米以后。此外, 该程序输出一个类似的颜色编码图表, 表示 wp作为一个函数的距离从开始的 perinexus 和感兴趣的区域 (B), 以及平均 Wp (在各自的图中插入)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 膨胀核形状分析.膨胀核的形状 (A): 中间的恒星代表放大的像素。白色框是受膨胀影响的像素, 在加号、X、框或线条的形状中。一个近似水平的 perinexus (b, 顶部, 红色线指示的 0°) 是顺时针旋转从0到180°的步骤, 10°和重复扩张使用不同的内核形状 (B, 底部)。加号和线状的内核产生相似的结果, 虽然线内核在某些方向上失败, 而盒形和 X 形的内核则不符合45°的相位。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 图像定位校正.为了纠正图像的方向, perinexus 的平均角度是从黑线的起始点和终点 (A、左、开始和末尾) 的位置计算出来的。y 方向 (a、左、绿线) 中的变化除以 x 方向 (a、左、红线) 的变化, 产生校正角度, θ (a、左、黄)。目标是然后改正平均 Wp价值给边缘之间的极小的距离, 好像 perinexus 已经被成像了近似地水平地 (A, 左下)。将1方程描述的校正因子应用于分析前的计算θ, 对15随机选取的图像进行人工旋转。修正后的值与旋转图像值 (R2 = 0.991、A、右) 强烈相关, 表示等式1是图像方向的有效校正因子。为了确认校正因子是适当的, 两个幽灵被产生的完全平行的边缘与已知的距离 (B, 左)。幻影1和幻影2的空间分辨率分别为2.833 个像素/毫米和71.6 个像素。如蓝色钻石和 B 中的红色方块所示, 正确的, 算法精确地计算出180度图像旋转的宽度。请单击此处查看此图的较大版本.
图 9: 算法重现性.使用图像定位校正的自动过程, 经验丰富和经验不足的观察者发现 af 和无 af 组 (A) 的显著差异 (a), 与先前的研究一致, 检测出 2.6 nm 的最小差异。此外, 两个观察者均未发现 GJW (B) 的显著差异。请单击此处查看此图的较大版本.
| 手动 | 自动 | |
| 时间-Obs 1 (s) | 205±11 | 44±14 |
| 时间-Obs 2 (s) | 248±18 | 30±5 |
| 空间分辨率 (测量/纳米) | 0.08 | 3.45 |
表 1: 手动和自动过程的比较.两个观察者需要的时间比图像更少, 以跟踪轮廓, 而不是执行10图像训练集的手工分割过程。此外, 自动过程具有较高的采样频率, 每 nm 记录3.45 个测量值, 而对于手动过程, 每 12.5 nm 的平均值为1次。训练集图像可以在补充文件 S5 中找到, 以及有经验的用户执行的轮廓和测量。
Discussion
该算法使用串行图像伸缩来计算二进制图像中两个对立2D 边缘之间的像素个数, 在这种情况下, perinexus2、3、14之间的膜间分离。然后用空间导数和寻算法隔离中心线, 其次是二次扩张和侵蚀序列, 以填补中线上的空隙, 类似于15之前所做的工作。中心线然后与最后的膨胀计数图象一起代表 perinexal 宽度作为距离的作用从边缘分离的起点, 在这种情况下 GJ 的结尾和 perinexus16的起点。
在程序开始时, GUI 中用户定义了四个主要参数:
- 渐变阈值
- 规模
- 区域利益范围
- 起始点选择方法 (自动或手动)
该算法最常见的故障机制是中心线无法到达图像边缘, 这就是如何为寻算法确定端点的方法。为了解决这一问题, 用户可以增加步骤3.3.1 中描述的梯度阈值, 这将使程序从空间导数图像中选择更多的点, 从而增加寻算法所需的计算时间。因此, 该算法需要在计算速度和中线完整性之间进行折衷。需要注意的是, 只要中心线的所有点都是从空间导数中识别出来的, 加上一个适当的起点, 空间导数阈值就不会对边缘分离测量产生影响。
图像方向似乎影响膨胀值, 因为内核扩张在90度的步骤, 这可能会引入一个错误, 如果大部分的利益区域是在一个角度45°到扩张矩阵的轴。因此, 膨胀计数不一定总是精确表示边缘之间的空间。此限制已通过三角校正因子来解决, 但如果数据集中的所有图像都在同一方向上对齐, 则可能会忽略此缺陷。此外, 应谨慎使用的解释结果, 因为这是可能的断面平面是不完全垂直的两个膜。在图 9B中, 我们使用 GJW 建议我们的 perinexus 图像是在平面上的。尽管如此, 样本大小必须足够大, 以解释图像之间的任何切片变化。此外, 我们的 perinexal 宽度测量不应被解释为反映在体内空间, 但这种方法是用来衡量平均差异的 perinexal 宽度相对于某些干预或疾病的状态。
当前算法还需要手动跟踪边缘的轮廓作为输入。需要注意的是, 只要刻度设置正确, 空间分辨率就不会对算法的测量产生影响, 如图 6中图像的不同分辨率和附加的低分辨率图像所示。文件 S6。改进算法的下一步是从轮廓生成中删除人类干预, 以及一个可以选择感兴趣区域的工具。这些功能可能会提高测量的精度并减少用户的偏差。
这种计算效率的算法提供了一个更快的方法, 需要大约1/5 的人小时, 量化的 perinexus, 没有可检测的惩罚与手工分割过程相比, 重现性。此外, 手工分割过程利用每15纳米测量 perinexal 宽度, 这可能导致在取样下, 因为 perinexus 的膜分离可能极大地改变在那15毫微米范围之内。相比之下, 自动程序的空间分辨率等于成像方式, 在这种情况下, 每纳米2.9 像素沿 perinexus 的长度, 因此提供一个更精细的解决平均 perinexal 宽度。
虽然在心脏结构生物学领域的应用前景广阔, 但该算法的使用并不局限于 TEM 图像。任何需要精确、高分辨率测量两个准平行2D 边的字段都可以利用该算法。该算法可用于跟踪从卫星图像到 brightfield 或荧光显微术的河岸侵蚀和洪水模式到血管发育的任何东西。其中一个最有前途的潜在应用是在心脏病学领域和测量心室射血分数 (EF) 与穴位的心脏超声心动图。目前, 标准技术是磁盘17的双方法, 虽然一种较新的算法, AutoEF, 目前是前沿 EF 量化方法18,19。对于磁盘的双方法, 所讨论的分庭使用修改后的辛普森方法进行手动跟踪和量化, 从而通过叠加的椭圆圆盘的总和自动计算总体积。这一方法的主要限制是, 它只能返回所需会议厅的总横截面积, 没有任何决议确定感兴趣的特定区域, 也需要大量的人力投入和专门知识。新的方法, AutoEF, 识别和轮廓的心室边缘使用2D 斑点算法, 然后计算心室横截面积。这一过程, 虽然准确和有效的测量总心室面积, 也有类似的固有限制, 仅测量总断面面积。这一主要缺陷限制了临床医生的诊断和治疗能力。相比之下, 本手稿中提出的算法可以识别中线, 并且分辨率等于成像方式的分辨率, 以精确定位感兴趣的特定区域。这一点很重要, 因为有千分尺空间分辨率的超声波扫描仪在商用20、21, 这意味着该算法可以检测到在千分尺分辨率下的局部壁运动异常。而不是厘米。虽然此应用程序需要经过实验验证, 但它是该算法最有前途的应用之一。实际上, 它可以很容易地与 AutoEF 的散斑跟踪能力或手动 planimetry 中使用的手动跟踪相结合, 以提供与传统 EF 数据并行的高分辨率信息。
作为现有算法的通用性和适用性, 开发了2D 图像。然而, 随着成像技术的不断改进, 对3和4D 量化技术的需求也在不断增加。因此, 该算法的下一个迭代是适应相同的方法, 串行扩张二进制图像, 到一个3维对象, 其中自动定义中线目前超出了当前成像程序的能力。这种算法在心脏领域仅有临床和实验上广泛应用, 包括3D 心脏超声心动图22,23, 3D 电子显微镜24,25,26、3D 磁共振成像27、28、29。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者想感谢在弗吉尼亚-马里兰兽医学院的凯西. 罗, 用于处理和染色 TEM 样品。
资金：
国立卫生研究院 R01-HL102298
国立卫生研究院 F31-HL140873-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Touchscreen Monitor | Dell | S2240T | Needs soft-tipped stylus |
| Desktop | Dell | Precision T1650 | 8GB RAM |
| Operating System | Microsoft | Windows 7 Enterprise | 64-bit OS |
| Program platform | Mathworks | Matlab R2015b | Program may be incompatible with newer/older versions of Matlab |
References
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