Summary
Het doel van dit algoritme moet continu meet de afstand tussen twee 2-dimensionale randen met behulp van seriële afbeelding dilations en vastloper. Dit algoritme kan worden toegepast op allerlei gebieden zoals cardiale structurele biologie, vasculaire biologie en civiele techniek.
Abstract
Een onlangs beschreven extracellulaire nanodomain, aangeduid als de perinexus, heeft zijn betrokken bij ephaptic koppeling, die is een alternatief mechanisme voor elektrische geleiding tussen cardiomyocytes. De huidige methode voor de kwantificering van deze ruimte door handmatige segmentatie is traag en heeft lage ruimtelijke resolutie. We ontwikkelden een algoritme die gebruikmaakt van seriële beeld dilations van een binaire overzicht te tellen van het aantal pixels tussen twee tegengestelde 2 dimensionale randen. Dit algoritme minder manuren vereist en een hogere ruimtelijke resolutie heeft dan de handmatige methode met behoud van de reproduceerbaarheid van het handmatige proces. In feite, ervaren en beginnende onderzoekers konden de resultaten van een eerdere studie met dit nieuwe algoritme recapituleren. Het algoritme wordt beperkt door de menselijke input nodig om handmatig een overzicht van de perinexus en rekenkracht voornamelijk bezwaard met een reeds bestaande vastloper algoritme. Het algoritme van hoog-productie mogelijkheden, hoge ruimtelijke resolutie en reproduceerbaarheid maken echter het een veelzijdig en robuust meetgereedschap voor gebruik in een verscheidenheid van toepassingen waarbij de meting van de afstand tussen elke 2-dimensionale (2D ) randen.
Introduction
Het volgende algoritme werd ontwikkeld voor het meten van de intermembrane afstand tussen de twee structureel gekoppelde cardiomyocytes op het punt dat ze aan de rand van een kloof kruising plaque in een nanodomain genaamd de perinexus1, die van elkaar scheiden betrokken bij ephaptic2,3,4,5te koppelen. In het proces van het analyseren van honderden Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beelden van perinexi met behulp van een handmatige segmentatie methode in een eerdere studie6, was de noodzaak vastgesteld voor een hogere gegevensdoorvoer methode die bemonsterd perinexal breedte in hoger ruimtelijke resolutie met behoud van de nauwkeurigheid van het vorige proces van handmatige segmentatie tijdens handmatige segmentatie, lijnen worden getekend tussenpozen 15 nm, ongeveer loodrecht op de middellijn, om de breedte van de perinexal meten. Het nieuwe algoritme een dikke binaire omtrek van één pixel uit twee parallelle lijnen en seriële afbeelding dilations gebruikt om te tellen van het aantal pixels tussen de twee vliezen. Terwijl afbeelding dilations vaak in een horde van beeld processing toepassingen gebruikt zijn, met inbegrip van contour of rand detectie7,8, dit algoritme dilations gebruikt als een tellen mechanisme. De middellijn is dan vervolgens geïsoleerd met behulp van een vastloper algoritme9 en perinexal breedte is gemeten bij een resolutie over de lengte van de perinexus gelijk is aan de resolutie van de afbeelding. Het verschil in resolutie is in dit geval 1 meting per 15 nm voor handmatige segmentatie en 1 meting per 0.34 nm met de nieuwe algoritme, een 44-fold stijging van de ruimtelijke sampling-frequentie. Deze verhoogde bemonsteringsfrequentie gebeurt in ongeveer 1/5th verder, de tijd die nodig is voor handmatige segmentatie.
Dit algoritme zal worden gebruikt in zijn huidige vorm aan de breedte van de perinexal bij de conventionele 0-150 meten vanaf de rand van een kloof kruising plaque5 (GJ) alsmede binnen een bepaald gebied van belang, waar de perinexus randplateau tussen 30 en 105 nm2 nm , 3 , 10. de verhoogde controlefrequentie vermindert de variabiliteit in individuele perinexus metingen ten opzichte van handmatige segmentatie en aanzienlijk verkort analyse tijd, waardoor voor efficiënte verwerking van grote gegevenssets. Dit programma is echter niet beperkt tot de nanoschaal TEM beelden van cardiale tussenliggende schijven. Dezelfde aanpak kan worden gebruikt om het kwantificeren van vasculaire diameter, ventriculaire ejectie Fractie, of zelfs niet-biologische fenomenen zoals rivier erosie en overstromingen. Dit algoritme is geschikt voor het kwantificeren van de afstand tussen elke twee quasi-parallelle randen.
Protocol
Opmerking: Software nodig zijn ImageJ (of vergelijkbare afbeelding-aanpassen software) en Matlab R2015. De gebruiker ondervinden problemen met de compatibiliteit met andere versies van Matlab.
1. voorbewerkend beelden
- Voor elke afbeelding in grijswaarden, zorgen de waarde van de maximale intensiteit voor een bepaalde pixel is < 255. Dit wordt meestal gedaan door een waarde van 1 van de afbeelding in het aangepaste programma voor Matlab "ImageSub.m", opgenomen in de aanvullende bestand S1 af te trekken.
2. overzicht van de Perinexus
- Een overzicht van de perinexus in ImageJ of andere beeld-verwerkende software.
- Ervoor zorgen dat de omtrek één pixel dik is en is ingesteld op de hoogste intensiteitswaarde in een afbeelding (255 in een grijswaardenafbeelding van 0 tot 255).
- Identificeer de GJ door haar pentalaminar structuur11,12, en definiëren van het begin van de perinexus als het punt waar de twee tegengestelde celmembraan bilayers uiteenlopen, zoals aangegeven in Figuur 1A. Begin ~ 200 nm vanaf de rand van de GJ, langs het binnenste membraan van de eerste cel en terug langs het binnenste membraan van de tweede cel traceren. Laat de pen als automatisch wilt sluiten de omtrek in ImageJ. Deze kunstmatige sluiten zal later worden bijgesneden uit.
Opmerking: Het is cruciaal voor een overzicht van de perinexus met grote zorgvuldigheid op zo hoog een vergroting mogelijk, want zelfs kleine mis toepassingen van het overzicht leiden verschillende nanometer van fout in de laatste meting tot kunnen.
3. het opzetten van algoritme en selecteren Perinexus van belang
Opmerking: De vastloper algoritme vereist de handtekening, rand, grafiek, knooppunt en vastloper functies9 worden in dezelfde map als het MembraneSepDist m-bestand. Alle bestanden kunnen gevonden worden in aanvullende bestand S1.
- Selecteer Opslaan locaties voor gegevens en cijfers. Deze zijn momenteel hard-coded in de m-bestand.
Opmerking: De eerste regel van het programma is een functie moet duidelijk alle variabelen, sluit alle vensters en schakelt u het opdrachtvenster. Gewenste variabelen of cijfers vóór het uitvoeren van de m-bestand opslaat.
Merk op: Screenshots van de Software zijn opgenomen in aanvullende bestand S2 voor alle hard-coded waarden. - Voer het programma "MembraneSepDist.m".
- Parameters instellen.
Opmerking: Een GUI zal opduiken met standaardparameters voor de kleurovergang drempel, de schaal, de regio van belang, en handmatig starten. De standaardwaarden in de m-bestand kunnen worden gewijzigd, of ze voor elke afzonderlijke afbeelding kunnen worden gewijzigd.- Set ruimtelijke afgeleide kleurovergang drempel.
Opmerking: Hogere waarden leiden tot meer punten geselecteerd in middellijn isolatie. Waarden die te hoog of te laag (buiten een bereik van ongeveer 3.0-7,9 zijn) kunnen resulteren in computationele inefficiëntie of een onduidelijke selectie van middellijn punten oplevert van onnauwkeurige middellijn isolatie (Zie Figuur 2A-C). - Stel de schaal in pixels/schaaleenheden.
- Stel de ruimtelijke boven- en ondergrenzen voor de regio van belang.
Opmerking: Door ons laboratorium van de Conventie, de gedefinieerde regio van belang is tussen 30 en 105 nm vanaf de rand van de GJ2,3,10. - Stel automatische/handmatige start. In de meeste gevallen detecteert het algoritme nauwkeurig het beginpunt waar de kloof kruising eindigt en de perinexus begint. Echter in sommige gevallen van onregelmatig gevormde perinexi, moet de gebruiker identificeren het beginpunt handmatig. Deze waarde instelt op 0 voor automatische, 1 voor manual.
- Set ruimtelijke afgeleide kleurovergang drempel.
- Selecteer de gewenste afbeelding.
Opmerking: De map voor het selecteren van bestand kan worden gewijzigd in het m-bestand. - Gewas het beeld te selecteren van de perinexus van belang.
- Wanneer de afbeelding omhoog komt, verandert de cursor automatisch in een draadkruis. De afbeelding bijsnijden door te slepen een vak rond de perinexus van belang (Zie Figuur 3). Het uitsnijdvak kan worden aangepast met behulp van de vierkantjes op de hoeken en zijden groter of kleiner te maken.
- Wanneer bijsnijden, zorgen voor het "open" einde van de perinexus (die het verst van de GJ, Zie Figuur 3) wordt bijgesneden zodat de twee membraan contouren de rand van de bijgesneden afbeelding bereiken.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om het beeld volledig-scherm om gemakkelijker zien van de perinexus van belang en bijsnijden naar behoren.
- Selecteer de laatste oogst door erop te dubbelklikken met de cursor tussen de tegengestelde randen te meten.
Opmerking: Het is cruciaal dat het dubbelklikken worden uitgevoerd binnen de perinexus. Als het programma niet te identificeren van een middellijn, start het programma opnieuw en zorg ervoor dat de klik treedt op binnen de perinexus. - Observeer de definitieve middellijn na alle dilations en erosies pop omhoog voor een eindgebruiker evaluatie van de doeltreffendheid van het programma.
Opmerking: Een dialoogvenster verschijnt op het scherm terwijl het programma wordt uitgevoerd om te informeren van de gebruiker dat Matlab niet alle extra opdrachten verwerkt zullen totdat het programma is voltooid. Hoe lang dit proces duurt, hangt af van de matrixgrootte van de (afbeelding) en computer verwerkingskracht. - Als handmatige startpunt is ingeschakeld, observeren het imago van de middellijn opduiken over de oorspronkelijke anatomische afbeelding, samen met een cross-hair cursor (Zie Figuur 2). Selecteer een punt buiten de perinexus in de buurt van het gewenste beginpunt.
Opmerking: Het programma vindt de middellijn punt dichtst met de geselecteerde pixel en gebruik dat als het beginpunt. - Recordgegevens.
Opmerking: Zodra het programma klaar is, het programma zal terugkeren een toegewezen middellijn, perceel van perinexal breedte als een functie van de afstand vanaf de rand van de GJ. Bovendien, het programma geeft de breedte van de gemiddelde perinexal tot 150 nm vanaf de rand van de GJ, evenals het gemiddelde van binnen de gedefinieerde regio van belang op de opdrachtregel van Matlab. Wp -waarden en afstanden van de GJ worden opgeslagen in de variabele "WpList" of de gebruiker kunt handmatig vastleggen hen afzonderlijk.
4. algoritme oplossen
- Als de middellijn is niet goedgeïdentificeerde (Figuur 2),het cijfer "Gmag" open en de Index om te identificeren een juiste gradiënt drempel (Figuur 2C).
- Als het beginpunt niet behoorlijk is geïdentificeerd, het beginpunt handmatig instellen (Zie Protocol 3.8).
Representative Results
Statistische methoden: Er werden vergelijkingen gemaakt tussen experimentele groepen met behulp van de Student t-tests. Een p-waarde < 0,05 significant wordt beschouwd en alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking.
Handmatige segmentatie. De kwantificering van de GJ-aangrenzende perinexus nanodomain breedte (Wp) wordt meestal bereikt door handmatige segmentatie. Deze segmentering van de handmatige proces wordt geïllustreerd in Figuur 1A en was eerder6beschreven. De waarnemer identificeert de rand van de GJ (afbeelding 1, rode stip), maatregelen 5nm langs het centrum van de perinexus, en de afstand tussen de membranen op dat moment. Het proces wordt dan herhaald op 10, 15, 30 en elke 15 nm tot 150 nm. Deze techniek, terwijl het effectief, heeft beperkingen van tijd en ruimtelijke onder bemonstering langs de lengte van de perinexus.
Bedoel Wp metingen uit eerdere studies kunnen variëren van ongeveer 10 tot 20 nm2,-3,10, en 3 nm lijkt te zijn het gemiddelde verschil die nodig zijn voor het detecteren van statistische significantie, die ruim boven de ruimtelijke Nyquist-frequentie van 0,7 nm per meting op basis van de resolutie van een interpixel van 0,34 nm. Daarom, terwijl handmatige segmentatie tijdrovend is, de methode is voldoende om het meten van verschillen in Wp gekoppeld van de status van een interventie of ziekte.
Seriële Image Dilations. Om te meten de perinexus op een snellere, reproduceerbare wijze met passende ruimtelijke resolutie, ontwikkelden we een programma gebaseerd op seriële afbeelding dilations rekenen de pixels tussen twee handmatig getraceerd membranen, die kunnen worden gezien in Figuur 1B .
De seriële dilatatie-proces wordt geïllustreerd in Figuur 4. Als de binaire image is uitgezet (figuur 4A-4D), dat dilatatie vervolgens wordt omgekeerd en toegevoegd aan de afbeelding van een werken - de niet-binaire vorm van de oorspronkelijke omtrek (figuur 4E-4 H). Het proces wordt herhaald totdat de omtrek is volledig ingevuld (Figuur 4D). Op dit punt, is het eindbeeld werken (Figuur 4H) een telling van het aantal keren dat een bepaalde pixel door de VN verwijde gebleven. Als zodanig, zijn de waarden in de buurt van de omtrek van de celmembranen erg laag, terwijl de waarden in het midden hoogste zijn. Door het tellen van het aantal dilations te vullen van het gebied op elk punt, kan de afstand tussen de randen van het membraan worden berekend. De volgende uitdaging is het identificeren en isoleren van de middellijn om te kwantificeren perinexal breedte als een functie van de afstand van de GJ, die wordt gedaan door een ruimtelijke afgeleide eerste op het eindbeeld van de werken te passen (Figuur 2-laatste afbeelding en Figuur 5 A). Een tweede voorbeeld van een meer onregelmatig gevormde perinexus kan worden gevonden in aanvullende bestand S3.
Identificatie van de middellijn. Het verloop van het uiteindelijke beeld van de werken kan worden gekwantificeerd door een ruimtelijke derivaat, als graaf van de dilatatie waarden van rand tot rand van hoog naar laag naar hoog opnieuw wijzigen (Figuur 5A van links naar rechts). Gezien alleen de omvang van de ruimtelijke afgeleide (Figuur 5B) zijn het overzicht en de middellijn, gemarkeerd met witte pijlen als gebieden van discontinuïteit onmiddellijk herkenbaar. Op deze locaties verandert de kleurovergang richting van vergroten om te minderen of vice versa. Toepassing van een drempel (Figuur 5C) produceert een binaire beeld van de middellijn en omtrek, en af te trekken van de oorspronkelijke omtrek levert de geïsoleerde middellijn (Figuur 5D). Hoewel deze methode van isoleren de middellijn computationeel efficiënt is, maakt de drempel die is toegepast op de ruimtelijke afgeleide hiaten in de resulterende middellijn. Deze lacunes (Figuur 5D, insert) moeten worden gevuld om een nauwkeurige meting van de afstand van de GJ en om ervoor te zorgen dat de perinexus wordt gemeten in zijn geheel. Eerst, de middellijn is uitgezet om te vullen in eventuele leemten (Figuur 5E), gevolgd door een erosie (Figuur 5F) en een "bwmorph"-functie (operatie = 'skel', n = inf) te elimineren zo veel punten als mogelijk terwijl een continu middellijn, waardoor de computationele efficiëntie van een latere vastloper algoritme ontwikkeld door Wasit Limprasert en beschikbaar op centrale MATLAB9. Deze functie dilatatie-erosie produceert de voltooide middellijn, die wordt gecombineerd met het eindbeeld werken (Figuur 5G). Echter, deze middenlijnoverlappingen is vaak meer dan één pixel dik en is daarom niet een nauwkeurige isolatie van de middellijn.
De Wasit Limprasert vastloper algoritme wordt gebruikt om te bepalen van de middellijn van de perinexus. De vastloper algoritme vermag de hoogste waarden - in dit geval de waarden die zich het dichtst bij het centrum die bleef un-verwijde via de meest iteraties langs de middellijn (Figuur 5G, insert) bijhouden. Het resultaat is een automatische spoor van de middellijn, zoals aangegeven in Figuur 6. Door het isoleren van de middellijn, kan perinexal breedte worden gepresenteerd als een functie van de afstand vanaf het einde van de GJ, zoals aangegeven in Figuur 6B (boven), of als de gemiddelde breedte van een bepaald gebied van belang.
Kernel analyse. Het is belangrijk op te merken dat de gedigitaliseerde afbeeldingen zijn op basis van vierkante matrices en dilatatie kernels zijn eveneens gebaseerd op vierkante matrices. Dit betekent dat dilatatie afstand over een diagonaal groter dan orthogonale is. Daarom wilden we volgende bepalen of de kernel beïnvloed de resultaten van het algoritme. Om te kwantificeren kernel-specifieke variabiliteit, vijf verschillende kernel vormen werden geanalyseerd: "Plus" (de vorm die wordt gebruikt in de bovenstaande analyses), "X", "vak" en "Line", zoals beschreven in Figuur 7A. De kernel wordt toegepast op elke niet-nulzijnde punt in een binaire afbeelding. De ster in elke kernel van Figuur 7A vertegenwoordigt het centrum, waar de witte is een waarde van 1, en zwart is een waarde van 0 voor de dilatatie-kernel.
Elke kernel van invloed op de gemiddelde Wp meting van een enkel ongeveer horizontale perinexal beeld (Figuur 7B, bovenaan), gekwantificeerd door een ervaren gebruiker, werd bepaald door het roteren van de afbeelding met Matlab van "imrotate" commando en Computing Wp in stappen van 10 °. De Wp meetwaarden (Figuur 7B, bodem) schommelen met de afdrukstand van de afbeelding in een gerectificeerde sinusvormige mode met een Plus vormige kernel. De laagste waarden voorkomen wanneer een relatief rechte perinexus georiënteerde verticaal of horizontaal. De X, vak, noch lijn kernels verstrekt een voordeel ten opzichte van de plus-vormige kernel. De X - en vak kernels identieke resultaten opgeleverd, maar de waarden van betekenen Wp waren uit fase met the Plus kernel door 45 °. De lijn -kernel niet volledig het verwijden van de afbeelding in een bepaalde hoek zoals kan worden gezien door het ontbreken van gegevens in het groene spoor voor afbeeldingen gedraaid van minder dan 30 of meer dan 145 °. Dus, de orthogonale Plus dilatatie kernel overschat membraan scheiding als een perinexus met een as leerstoornissen diagonaal bijvoorbeeld bij ongeveer 45 georiënteerde °, en de X - en vak kernels gemiddelde Wonderschat p toen de lengteas van de perinexus ook bij 45°. Op basis van deze analyse, ontwikkelden we een correctiefactor toegepast op de waarden die zijn gegenereerd op basis van leerstoornissen met de plus-vormige kernel. Ter verantwoording voor de overschatting van de membraan scheiding die is gekoppeld aan de afdrukstand van de afbeelding, deze correctiefactor vermenigvuldigd met de breedtewaarde van de gemeten afhankelijk van de afdrukstand van de afbeelding (vergelijking 1).
Als θ < 45°
Wp gecorrigeerd cosd(θ) = * Wp gemeten
Als θ ≥45 °
Wp gecorrigeerd cosd(θ) = * Wp gemeten (vergelijking 1)
In deze vergelijking is Wp gemeten de oorspronkelijke Wp waarde gegenereerd door het bovenstaande algoritme en θ de berekende hoek van horizontaal, in graden. Θ wordt berekend door het nemen van de inverse tangens van de totale verandering in horizontale richting gedeeld door de totale verandering van de verticale richting van de middellijn van de perinexal. De bovenstaande correctie benadert de gemiddelde hoek, ten opzichte van horizontaal, van de perinexus (Figuur 8A, links-boven) en resulteert in een meting alsof verkregen van een horizontale perinexus (Figuur 8A, links beneden). De grondgedachte achter deze vergelijking komt van het feit dat de plus-vormige kernel (Figuur 7A) in wezen twee lijn-vormige kernels gerangschikt orthogonaal met elkaar zijn verbonden is. Als zodanig onder 45° (dichter bij horizontale), de dilations verticaal optreden en daarom te vermenigvuldigen met de cosinus van de hoek geeft de correcte meting. Daarentegen voor hoeken boven 45° (dichter bij verticale), dilations optreden horizontaal en de sinus is gebruikt om te bepalen van de correcte meting. Precies 45 ° zijn de sinus en cosinus gelijk. Aanvullende bestand S4 bevat een afbeelding van dit concept. Merk op dat deze correctie is gebaseerd op de gemiddelde hoek en voorzichtigheid moet worden gebruikt bij de analyse van wezenlijk niet-lineaire vormen. Dit proces werd herhaald op 20 willekeurig geselecteerde perinexi en de gecorrigeerde metingen sterk gecorreleerd met metingen verkregen door handmatig draaien en opnieuw het analyseren van de beelden (Figuur 8A, rechts). Om te bevestigen de nauwkeurige correctie voor afdrukstand, waren twee sets van phantom randen gegenereerde (Figuur 8B, links) en 180 ° gedraaid. Met de trigonometrische correctie keerde het algoritme nauwkeurig de juiste waarde op elke geaardheid, ongeacht de ruimtelijke resolutie of de grootte van de afbeelding (Figuur 8B, rechts).
Analytische toepassing en reproduceerbaarheid met oriëntatie correctie. Eraan herinnerend dat eerdere studies met behulp van handmatige segmentatie verslag statistisch significant bedoel Wp verschillen groter is dan of gelijk aan 3 nm, was het belangrijk om te bepalen of het algoritme kan worden gebruikt voor recapituleren eerdere bevindingen met behulp van een volledige dataset. Met behulp van de nieuwe algoritme, twee waarnemers - ervaren en onervaren met perinexal analyse (Obs. 1en Obs. 2, respectievelijk)-dezelfde afbeeldingen van een eerdere studie6 die opgenomen van 12 patiënten die werden gediagnosticeerd met atriale geanalyseerd fibrillatie (AF) voorafgaand aan weefsel collectie en 29 patiënten die geen bestaande AF (No-AF). De ervaren gebruiker gevonden dat Wp was aanzienlijk breder in patiënten met AF dan zonder AF (21.9±2.5 en 18.4±2.0 nm, respectievelijk, Figuur 9A). Deze waarden met de correctiefactor toegepast zijn vergelijkbaar met die gemeld eerder (24.4±2.2 nm en 20.7±2.4 nm, respectievelijk)6. Nog belangrijker is, de onervaren gebruiker hetzelfde significant verschil gevonden (22.1±2.8 nm en 20.1±2.6 nm, respectievelijk) tussen ziekte staten met de geautomatiseerde programma. Bovendien, veranderde de standaarddeviatie van de waarden Wp niet met de correctiefactor, die aangeeft dat de standaarddeviatie van 2-3 nm is niet een artefact van het algoritme, maar de structuur zelf en verwerking van het weefsel. Deze resultaten tonen aan dat de voorgestelde geautomatiseerde methode staat de resultaten van eerdere studies Recapitulerend is.
Nog belangrijker is, de perinexus is een recent gedefinieerde structuur en geen consensus heeft bereikt zijn op het bereik van absolute waarden van membraan scheiding grenzend aan de GJ2,3. Aangezien-membraan-naar-buitenste-buitenmembraan GJ breedte is eerder geraamd op 20 nm13, wij gestreefd naar het bepalen van het algoritme werkzaamheid door GJ breedte ook te meten. Beide waarnemers vond geen significant verschil tussen gap junction breedtes (GSW) van patiënten met of zonder vooraf bestaande AF (Figuur 9B). Absolute GSW waarden voor AF- en niet-AF patiënten waren 20.5 ± 2,5 nm en 20.3 ± 1.9 nm, respectievelijk voor de ervaren waarnemer en 21.0 ± 3.1 nm en 20,0 ± 2.2 nm voor de onervaren waarnemer, vergelijkbaar met wat eerder is gemeld.
Om te bepalen of de geautomatiseerde algoritme vereist minder tijd om gegevens dan handmatig segmentatie te analyseren, zowel de ervaren en onervaren gebruiker opgenomen de tijd die nodig is te kwantificeren van een training van 10-afbeelding instellen (aanvullende bestand S5). Tabel 1 toont aan dat de ervaren en onervaren gebruiker analyse tijd door 4,7 daalde- en 8.3 keer respectievelijk het gebruik van de geautomatiseerde algorithm ten opzichte van de handmatige segmentatie benadering, met ongeveer 43-fold toename van ruimtelijke resolutie langs de perinexus.
Algoritme oplossen. De meest voorkomende fout bij het uitvoeren van het algoritme treedt op wanneer de laatste middellijn niet aan de rand van de afbeelding eindigt. In dergelijke gevallen werden niet genoeg punten geselecteerd uit de ruimtelijke afgeleide kaart, waardoor het programma te mislukken en een foutbericht weergegeven, waarbij de gebruiker selecteren een grotere snijgebied of verhoging van de ruimtelijke afgeleide drempel produceren. Tekenen van een grotere uitsnijdvak zal verbeteren de betrouwbaarheid van het programma in sommige gevallen als de ruimtelijke afgeleide verandert drastisch in de buurt van de randen van de figuur, die de vastloper of rand detectie-algoritmen kunnen verstoren.
Het is ook mogelijk voor de vastloper algoritme te mislukken voor een correcte identificatie de middellijn, zelfs als de middellijn bereikt de rand van het beeld, met name als de kleurovergang drempel is te laag(Figuur 2). Als de kleurovergang drempel is te hoog ingesteld, zal er meer overbodige punten opgenomen in de vastloper algoritme (Figuur 2,B), afnemende computationele efficiëntie. Als de gebruiker niet in staat om te bepalen van een passende drempel, de afbeelding array is "GMag" (Figuur 2C), die wordt gegenereerd door het programma en kan worden gevonden in de werkruimte kunt helpen de gebruiker bepalen de drempel. Het vinden van punten langs de middellijn en stel de drempel iets boven hun indexwaarde om ervoor te zorgen dat deze punten worden geselecteerd. In het gegeven voorbeeld zou een passende drempel boven ~5.1 (Figuur 2C, insert).
Het beginpunt kan ook mislukken tot het begin van de perinexus (Figuur 2D). In dit geval opnieuw uitvoeren van het programma en de Handleiding Start waarde ingesteld op 1. Nadat de middellijn geïsoleerd is, de gebruiker selecteert een punt buiten de perinexus en de middellijn punt dat zich het dichtst bij de geselecteerde pixel (Figuur 2E, Rode plein) zal worden ingesteld als het beginpunt. Het resultaat is de volledige middellijn (Figuur 2F).
Figuur 1 : TEM beelden met kwantificering processen. De segmentering van de handmatige proces (A) moet de gebruiker metingen uit te voeren 12 individuele intermembrane terwijl het schatten van de middellijn. Het automatische proces (B) vereist een handmatige, continue spoor van de omtrek van de perinexus. De rode stip in elke afbeelding vertegenwoordigt het eind gebruiker-aangeduid van de GJ en het begin van de perinexus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Oplossen van problemen met middellijn. Twee primaire wijzen van mislukking voor de identificatie van de middellijn en hun oplossingen: elke afbeelding is geëtiketteerd met de naam van de matrix in Matlab. De kleurovergang drempel is te laag (A, drempel 0.2) de middellijn algoritme kan mislukken. Instellen van de drempel te hoog (B, drempel 70) de computationele efficiëntie van het algoritme van de vastloper kan verminderen. Een juiste gradiënt drempel kan worden bepaald uit de matrix van GMag (C, invoegen). Als de middellijn niet tot de rand van het begin van de perinexus (D), kan de gebruiker kiezen om handmatig selecteren het beginpunt. Na de "Start Point" optie is ingesteld op 1 in de opening GUI, de gebruiker en selecteert dan een punt buiten de perinexus van belang (E). Het eindresultaat moet een middellijn die nauwkeurig het geheel van de perinexus (F verbeeldt). Alle etiketten in citaten (A-F) komen overeen met de namen van de variabelen in Matlab. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Perinexus selectie. Bijsnijden van de perinexus, click-and-hold te Sleep een vak rond het (het gereedschap Uitsnijden is automatisch geselecteerd) zoals aangegeven door de blauwe pijl. Dit vak kan worden aangepast met behulp van de vierkantjes aan de zijkanten en hoeken groter of kleiner te maken. De groene pijl geeft het einde van de perinexus, zodat de gebruiker blijft "open." Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Seriële afbeelding dilations. De binaire omtrek is herhaaldelijk uitgezet in stappen van één pixel (A-D) en toegevoegd aan het beeld van de werken (de niet-binaire vorm van het beeld, de E-H) na elke dilatatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: middellijn isolatie en vastloper. Een ruimtelijke derivaat is berekend op basis van het uiteindelijke beeld van de werken (A) en de omvang van die ruimtelijke afgeleide (B) wordt gebruikt voor het isoleren van de omtrek en de middellijn (witte pijlen). Een door de gebruiker gedefinieerde drempel identificeert de omtrek en middellijn en aftrekken van de oorspronkelijke omtrek levert de middellijn (D). Echter de hiaten in de middellijn ten gevolge van de drempel (D - invoegen). Om een continue middellijn, wordt een secundaire dilatatie uitgevoerd op de geïsoleerde middellijn (E), gevolgd door een secundaire erosie de computationele efficiëntie van een latere vastloper algoritme te verhogen. Deze geërodeerde afbeelding (F) wordt dan gecombineerd met het eindbeeld van werken, waardoor voor de identificatie van een continue, one-pixel-dikke middellijn (G - invoegen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Laatste gegevenspresentatie. Het programma uitgangen de definitieve omtrek op de top van de oorspronkelijke afbeelding TEM (A). De lijn is kleurcode groen voor 0-150 nm, blauw voor de gebruiker gedefinieerde regio van belang en rood voor het gebied dan 150 nm. Bovendien is het programma uitgangen een evenzo gekleurde grafiek vertegenwoordigen Wp als een functie van de afstand vanaf het begin van de perinexus en voor de regio van belang (B), evenals de gemiddelde Wp (inzet in de respectieve grafiek). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Dilatatie kernel vorm analyse. Shapes voor dilatatie kernels (A): de ster in het midden vertegenwoordigt de verwijde pixels. Witte dozen zijn pixels die zijn beïnvloed door de dilatatie, in de vorm van een plus, X, vak of lijn. Een ongeveer horizontale perinexus (B, boven, met een rode streep geeft 0°) was met de klok mee gedraaid van 0 tot 180° in stappen van 10° en herhaaldelijk verwijde met behulp van de shapes van de verschillende kernel (B, bodem). Plus - en lijn-vormige kernels vergelijkbare resultaten opleveren, hoewel de regel kernel op bepaalde richtsnoeren, mislukt terwijl de vak - en X-vormige kernels uit fase van 45 °. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : Image oriëntatie correctie. Om juiste voor de oriëntatie van het beeld, de gemiddelde hoek van de perinexus is berekend op basis van de standpunten van de begin - en einde - points (A, verliet begin en einde van de zwarte lijn). De inverse tangens van de verandering in de y-richting (A, links, groene lijn) gedeeld door de wijziging in de x-richting (A, links, rode lijn) opbrengsten de correctie hoek, θ (A, links, geel). Het doel is om corrigeer vervolgens de gemiddelde Wp -waarde geven de minimale afstand tussen de randen, alsof de perinexus had ongeveer horizontaal is beeld (A, links hieronder). De toepassing van de correctiefactor beschreven door vergelijking 1 was ten opzichte van handmatig draaien elk van de 15 willekeurig geselecteerde beelden door de berekende θ vóór de analyse. De gecorrigeerde waarden sterk gecorreleerd met de gedraaid-image waarden (R2 = 0.991, A, rechts), die vergelijking 1 aangeeft is een geldige correctiefactor voor afdrukstand van afbeelding. Om te bevestigen dat de correctiefactor is geschikt, werden twee spoken gegenereerd van perfect-parallel randen met een bekende afstand tussen hen (B, links). Phantom 1 en Phantom 2 hebben een ruimtelijke resolutie van 2.833 pixels / mm. en 71.6 pixels/in., respectievelijk. Zoals door de blauwe diamanten en rode vierkantjes in B, recht, berekent het algoritme nauwkeurig u hun breedte over Beeldrotatie 180 graden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9 : Algoritme reproduceerbaarheid. Met behulp van het automatische proces met image oriëntatie correctie, zowel ervaren en onervaren waarnemer vonden significante verschillen tussen AF- en No-AF groepen (A), consistent met een eerdere studie, opsporen van een minimum verschil van 2.6 nm. Bovendien, noch waarnemer gevonden een significant verschil in GSW (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Handmatig | Automatisch | |
| Tijd - Obs. 1 (s) | 205±11 | 44±14 |
| Tijd - Obs. 2 (s) | 248±18 | 30±5 |
| Ruimtelijke resolutie (metingen/nm) | 0.08 | 3.45 |
Tabel 1: vergelijking van handmatige en automatische processen. Beide waarnemers vereist minder tijd per beeld om te traceren van de omtrek dan uitvoeren om de segmentering van de handmatige proces voor een 10-image opleiding ingesteld. Bovendien, het automatische proces heeft een hogere bemonsteringsfrequentie, opname van 3,45 metingen per nm, in vergelijking met een gemiddelde van 1 meting elke 12,5 nm voor het handmatige proces. De opleiding set beelden kunnen worden gevonden in aanvullende bestand S5, samen met contouren en metingen zoals uitgevoerd door een ervaren gebruiker.
Discussion
Het algoritme gebruikt seriële afbeelding dilations om te tellen het aantal pixels tussen twee tegengestelde 2D randen in een binaire afbeelding, die in dit geval de scheiding tussen membraan van de perinexus2,3,14 is. Een ruimtelijke derivaat en een vastloper algoritme worden vervolgens gebruikt om te isoleren van de middellijn, gevolgd door een secundaire dilatatie en erosie reeks om hiaten in de middellijn, vergelijkbaar met wat er is gedaan vóór15te vullen. De middenlijn wordt dan gecombineerd met de afbeelding van de dilatatie-uiteindelijk te vertegenwoordigen perinexal breedte als een functie van de afstand vanaf het begin van de scheiding van de rand, in dit geval het einde van de GJ en het begin van de perinexus16.
Vier primaire parameters zijn gebruiker gedefinieerde in een GUI aan het begin van het programma:
- Kleurovergang drempel
- Schaal
- Regio van belang bereik
- Start punt selectiemethode (automatisch of handmatig)
De meest voorkomende mechanisme voor de mislukking van het algoritme is het falen van de middellijn tot de rand van het beeld, dat is hoe het eindpunt voor de vastloper algoritme wordt bepaald. Dergelijke een om kwestie te bevestigen, kan de gebruiker de kleurovergang drempel beschreven in stap 3.3.1, waardoor het programma te selecteren meer punten uit het ruimtelijke afgeleide beeld, waardoor de rekentijd die nodig zijn door de vastloper algoritme zal verhogen. Dit algoritme vereist daarom een compromis tussen snelheid en middenlijn integriteit van de berekening. Het is belangrijk op te merken dat zo lang als alle punten van de middellijn van de ruimtelijke afgeleide, samen met een passende beginpunt, worden geïdentificeerd de ruimtelijke afgeleide drempel geen effect op de rand scheiding meting hebben zal.
Afdrukstand van afbeelding verschijnt bij dilatatie waarden, omdat de kernel in stappen van 90 graden, die een fout voeren verwijdt kunnen als de meerderheid van de regio van belang onder een hoek van 45° met de assen van dilatatie matrices is. Daarom mogelijk de dilatatie telling altijd niet een accurate weergave van de ruimte tussen de randen. Deze beperking door een trigonometrische correctiefactor aan de orde heeft gesteld, maar kan mogelijk worden genegeerd als alle afbeeldingen in een dataset worden uitgelijnd op de dezelfde afdrukstand. Bovendien, voorzichtigheid moet worden gebruikt bij de interpretatie van de resultaten, zoals het is mogelijk dat de sectie vliegtuigen niet perfect loodrecht op de twee membranen zijn. In Figuur 9Bgebruiken we GSW om te suggereren dat de beelden van onze perinexus in-plane werden. Toch is het absoluut noodzakelijk dat steekproefgrootten voldoende groot om vectorafbeeldingsbestanden variaties tussen beelden voor hun rekening zijn. Bovendien, moeten onze perinexal breedte metingen niet worden geïnterpreteerd om te reflecteren in vivo ruimten, maar deze aanpak wordt gebruikt voor het meten van de gemiddelde verschillen in perinexal breedte ten opzichte van sommige interventie of ziekte staat.
De huidige algoritme vereist ook een handmatig getraceerd schets van de randen als input. Het is belangrijk op te merken dat, zolang de schaal correct is ingesteld, ruimtelijke resolutie geen invloed op het algoritme van de metingen heeft, zoals blijkt uit de verschillende resoluties van afbeeldingen in Figuur 6 en een extra met een lage resolutie afbeelding in aanvullende bestand S6. De volgende stap in de verbetering van het algoritme is het verwijderen van menselijke tussenkomst van overzicht generatie samen met een hulpmiddel dat het interessegebied kunt selecteren. Deze functies zou waarschijnlijk verbeteren van de precisie van de meting en beperken gebruiker bias.
Dit computationeel efficiënt algoritme biedt een snellere methode, waarbij ongeveer een vijfde de manuren, kwantificeren van de perinexus met geen detecteerbare sanctie reproduceerbaarheid in vergelijking met de segmentering van de handmatige proces. Bovendien, de segmentering van de handmatige proces maakt gebruik van een meting elke 15 nanometer om te kwantificeren perinexal breedte, die leiden kan tot onder de bemonstering als de scheiding van de membraan van de perinexus aanzienlijk binnen dat 15 nm-bereik veranderen kunt. In tegenstelling, heeft het geautomatiseerde programma een ruimtelijke resolutie gelijk aan die van de beeldvorming modaliteit, in dit geval 2.9 pixels per nanometer langs de lengte van de perinexus, daarom leveren een meer fijn opgelost gemiddelde breedte van de perinexal.
Terwijl de toepassingen op het gebied van cardiale structurele biologie veelbelovend en spannend zijn, zijn van dit algoritme gebruikt niet beperkt tot TEM beelden. Elk veld waarvoor een nauwkeurige, high-resolution meting van twee quasi-parallelle 2D randen kunt maken gebruik van dit algoritme. Het algoritme kan worden gebruikt voor het bijhouden van om het even wat van de rivieroever erosie en overstromingen patronen uit satellietbeelden aan vasculaire ontwikkeling met helderveld of fluorescent microscopie. Een van de meest beloftevolle potentiële toepassingen is op het gebied van cardiologie en het meten van ventriculaire ejectie fractie (EF) met point-of-care cardiale echocardiografie. Op dit moment is de standaard techniek de methode met dubbeldekker van schijven17, hoewel een nieuwere algoritme, AutoEF, momenteel de snijkant EF-kwantificeren methode18,19 is. Voor de methode van de dubbeldekker van schijven, de zaal in kwestie is handmatig getraceerd en gekwantificeerd aan de hand van een gemodificeerde Simpson's methode, waarbij totale volume wordt automatisch berekend door de sommatie van gestapelde elliptische schijven. De belangrijkste beperking met deze methode is dat het alleen de totale oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de gewenste kamer, met geen enkele resolutie te identificeren specifieke regio's van belang, terugkeren en ook aanzienlijke menselijke inbreng en expertise kan vereist. De nieuwere methode, AutoEF, identificeert en schetst de rand van het ventrikel met behulp van een 2D speckling algoritme en dan berekent de ventriculaire oppervlakte van de dwarsdoorsnede. Dit proces, heeft terwijl nauwkeurig en efficiënt voor het meten van bruto ventriculaire gebied, ook een soortgelijke inherente beperking van alleen meten van de totale oppervlakte van de dwarsdoorsnede. Dit primaire nadeel beperkt clinici diagnose en de behandeling mogelijkheden. In tegenstelling, het algoritme gepresenteerd in dit manuscript herkent een middellijn en heeft een resolutie gelijk aan de resolutie van de beeldvorming modaliteit te lokaliseren specifieke regio's van belang. Dit is belangrijk omdat echografie scanners met micrometer ruimtelijke resolutie verkrijgbare20,21 zijn, hetgeen impliceert dat dit algoritme gelokaliseerde muur beweging afwijkingen op de resolutie van micrometers detecteren kon in plaats van centimeters. Hoewel deze toepassing experimenteel worden gevalideerd moet, is het een van de meest onmiddellijk veelbelovende toepassingen van dit algoritme. In feite, het kan gemakkelijk worden gecombineerd met de spikkel tracking mogelijkheden van AutoEF of de handmatige sporen gebruikt in handmatige platte grond om hogere resolutie informatie parallel met conventionele EF gegevens te verstrekken.
Zo veelzijdig en die van toepassing zijn als de huidige algoritme is, het werd ontwikkeld voor 2D-afbeeldingen. Zoals beeldtechnologieën verder te verbeteren, is er echter een toenemende vraag naar 3 en 4 D kwantificering technologieën. Daarom is de volgende iteratie van het algoritme te passen dezelfde aanpak, serieel leerstoornissen een binaire beeld, een 3-dimensionaal object, waar automatisch definiëren een middellijn momenteel buiten de mogelijkheden van de huidige beeldbewerkingsprogramma's is. Een dergelijk algoritme zou hebben brede toepassingen zowel klinisch en experimenteel in het cardiale veld alleen, met inbegrip van 3D cardiale echocardiograms22,23, 3D elektronenmicroscopie24,25, 26en 3D magnetische resonantie imaging27,28,29.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Kathy Lowe op de Virginia-Maryland College voor diergeneeskunde voor het verwerken en kleuring TEM monsters.
Financiering:
National Institutes of Health R01-HL102298
Nationale instituten van gezondheid F31-HL140873-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Touchscreen Monitor | Dell | S2240T | Needs soft-tipped stylus |
| Desktop | Dell | Precision T1650 | 8GB RAM |
| Operating System | Microsoft | Windows 7 Enterprise | 64-bit OS |
| Program platform | Mathworks | Matlab R2015b | Program may be incompatible with newer/older versions of Matlab |
References
- Rhett, J. M., Gourdie, R. G. The perinexus: a new feature of Cx43 gap junction organization. Heart Rhythm. 9 (4), 619-623 (2012).
- Veeraraghavan, R., et al. Sodium channels in the Cx43 gap junction perinexus may constitute a cardiac ephapse: an experimental and modeling study. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).
- George, S. A., et al. Extracellular sodium dependence of the conduction velocity-calcium relationship: evidence of ephaptic self-attenuation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 310 (9), 1129-1139 (2016).
- Veeraraghavan, R., et al. Potassium channels in the Cx43 gap junction perinexus modulate ephaptic coupling: an experimental and modeling study. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2016).
- Rhett, J. M., et al. Cx43 associates with Na(v)1.5 in the cardiomyocyte perinexus. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 411-422 (2012).
- Raisch, T. B., et al. Intercalated Disc Extracellular Nanodomain Expansion in Patients with Atrial Fibrillation. Frontiers in Physiology. , (2018).
- Yan, J., et al. Novel methods of automated quantification of gap junction distribution and interstitial collagen quantity from animal and human atrial tissue sections. PLoS One. 9 (8), 104357 (2014).
- Papari, G., Petkov, N. Adaptive pseudo dilation for gestalt edge grouping and contour detection. IEEE Transactions on Image Processing. 17 (10), 1950-1962 (2008).
- Limprasert, W. PathFinding. , Available from: www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34966-pathfinding (2012).
- George, S. A., et al. Extracellular sodium and potassium levels modulate cardiac conduction in mice heterozygous null for the Connexin43 gene. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).
- Revel, J. P., Karnovsky, M. J. Hexagonal array of subunits in intercellular junctions of the mouse heart and liver. Journal of Cell Biology. 33 (3), 7-12 (1967).
- Huttner, I., Boutet, M., More, R. H.
- Makowski, L., et al. Gap junction structures. II. Analysis of the x-ray diffraction data. Journal of Cell Biology. 74 (2), 629-645 (1977).
- Entz, M., et al. Heart Rate and Extracellular Sodium and Potassium Modulation of Gap Junction Mediated Conduction in Guinea Pigs. Frontiers in Physiology. 7, 16 (2016).
- Sild, M., Chatelain, R. P., Ruthazer, E. S. Improved method for the quantification of motility in glia and other morphologically complex cells. Neural Plasticity. 2013, 853727 (2013).
- Rhett, J. M., et al. The perinexus: Sign-post on the path to a new model of cardiac conduction. Trends in Cardiovascular Medicine. , (2013).
- Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Journal of the American Society of Echocardiography. 28 (1), 1-39 (2015).
- Kawai, J., et al. Left ventricular volume and ejection fraction by the axius auto ejection fraction method: comparison with manual trace method and visual assessment of ejection fraction. Journal of Cardiology. 49 (3), 125-134 (2007).
- Frederiksen, C. A., et al. Clinical utility of semi-automated estimation of ejection fraction at the point-of-care. Heart, Lung and Vessels. 7 (3), 208-216 (2015).
- Foster, F. S., et al. A new ultrasound instrument for in vivo microimaging of mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 28 (9), 1165-1172 (2002).
- Moran, C. M., et al. A comparison of the imaging performance of high resolution ultrasound scanners for preclinical imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (3), 493-501 (2011).
- Papademetris, X., et al. Estimation of 3D left ventricular deformation from echocardiography. Medical Image Analysis. 5 (1), 17-28 (2001).
- Hosny, A., et al. Unlocking vendor-specific tags: Three-dimensional printing of echocardiographic data sets. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 155 (1), 143-145 (2018).
- Cretoiu, D., et al. Human cardiac telocytes: 3D imaging by FIB-SEM tomography. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2157-2164 (2014).
- Risi, C., et al. Ca(2+)-induced movement of tropomyosin on native cardiac thin filaments revealed by cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6782-6787 (2017).
- Dhindwal, S., et al. A cryo-EM-based model of phosphorylation- and FKBP12.6-mediated allosterism of the cardiac ryanodine receptor. Science Signaling. 10 (480), (2017).
- Reddy, V. Y., et al. Integration of cardiac magnetic resonance imaging with three-dimensional electroanatomic mapping to guide left ventricular catheter manipulation: feasibility in a porcine model of healed myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 44 (11), 2202-2213 (2004).
- van Heeswijk, R. B., et al. Three-Dimensional Self-Navigated T2 Mapping for the Detection of Acute Cellular Rejection After Orthotopic Heart Transplantation. Transplant Direct. 3 (4), 149 (2017).
- Valinoti, M., et al. 3D patient-specific models for left atrium characterization to support ablation in atrial fibrillation patients. Magnetic Resonance Imaging. 45, 51-57 (2018).
