Summary
Formålet med denne algoritmen er kontinuerlig måle avstanden mellom to 2-dimensjonal kanter med føljetong bilde dilations og pathfinding. Denne algoritmen kan brukes på en rekke felt som cardiac strukturell biologi, vaskulære biologi og sivilingeniør.
Abstract
En nylig beskrevet ekstracellulære nanodomain, kalt perinexus, har vært innblandet i ephaptic kopling, som er en alternativ mekanisme for elektrisk ledning mellom cardiomyocytes. Det aktuelle metoden for kvantifisering denne plassen ved manuell segmentering er treg og har lav romlig oppløsning. Vi utviklet en algoritme som bruker serielle bilde dilations av en binær til å telle antall piksler mellom to motstridende 2 dimensjonale kanter. Denne algoritmen krever færre arbeidstimer og har en høyere romlig oppløsning enn den manuelle metoden samtidig bevare reproduserbarhet av den manuelle prosessen. Faktisk opplevd og nybegynner etterforskere kunne recapitulate resultatene av en tidligere studie med denne nye algoritmen. Algoritmen er begrenset av menneskelig input måtte manuelt skissere perinexus og databehandlingskraft hovedsakelig beheftet med en eksisterende pathfinding algoritme. Men gjør algoritmens høy gjennomstrømming evner, høy romlig oppløsning og reproduserbarhet det et allsidig og robust måleverktøy for bruk på tvers av en rekke applikasjoner som krever måling av avstanden mellom noen 2-dimensjonal (2D ) kanter.
Introduction
Følgende algoritme ble utviklet for å måle intermembrane avstanden mellom to strukturelt kombinert cardiomyocytes på punktet de skiller fra hverandre på kanten av en gapet krysset plakett i en nanodomain kalt perinexus1, som har vært innblandet i ephaptic kobling2,3,4,5. I prosessen med å analysere hundrevis av overføring elektronmikroskop (TEM) bilder av perinexi med en manuell segmentering metode i en tidligere studie6, ble behovet identifisert for en høyere gjennomstrømming metode som samplet perinexal bredde i høyere romlig oppløsning samtidig bevare nøyaktigheten av tidligere manuell segmentering prosessen under manuell segmentering, trekkes linjer i 15 nm intervaller, ca ortogonale senterlinje, for å måle perinexal bredde. Den nye algoritmen tar en én piksel tykk binære omrisset av to parallelle linjer og bruker serielle bilde dilations telle antall piksler mellom to membraner. Mens bildet dilations har ofte blitt brukt i en myriade av bilde prosessering programmer, bruker inkludert kontur eller kant oppdagelse7,8, denne algoritmen dilations som en telling mekanisme. Midtlinjen er isolert bruker en pathfinding algoritmen9 og perinexal bredde er deretter målt oppløsning langs perinexus lik oppløsningen til bildet. Forskjellen i oppløsning i dette tilfellet er 1 måling for hver 15 nm for manuell segmentering og 1 mål per 0,34 nm med den nye algoritmen, en 44-fold økning i romlig samplingfrekvens. Videre oppnås dette økt samplingfrekvens i ca 1/5th tiden som krevs for manuell segmentering.
Denne algoritmen brukes i sin nåværende form til å måle perinexal bredde på den konvensjonelle 0-150 nm fra kanten av gapet krysset plakk5 (GJ) samt innenfor et angitt område av interesse, hvor perinexus flyer mellom 30 og 105 nm2 , 3 , 10. økt samplingsfrekvens reduserer variasjon i individuelle perinexus målinger sammenlignet med manuell segmentering og betydelig forkorter analyse tid, slik at for effektiv behandling av store datasett. Dette programmet er imidlertid ikke begrenset til nanoskala TEM bilder av cardiac under Sommer disker. Samme tilnærming kan brukes å kvantifisere vaskulær diameter, ventrikkel utstøting brøk eller selv ikke-biologiske fenomener som elven erosjon eller flom. Denne algoritmen er egnet for kvantifisere avstanden mellom noen to kvasi parallelle kantene.
Protocol
Merk: Programvare kreves ImageJ (eller lignende bilde-endre programvare) og Matlab R2015. Brukeren kan oppstå kompatibilitetsproblemer med andre versjoner av Matlab.
1. pre-prosessering bilder
- For alle slags gråtonebilder, sikrer maksimum styrke verdien av en gitt piksel er < 255. Dette gjøres vanligvis ved å trekke verdien 1 fra bildet i det egendefinerte Matlab programmet "ImageSub.m", inkludert i ekstra filen S1.
2. disponering av Perinexus
- Skissere perinexus i ImageJ eller annen bildebehandling programvare.
- Kontroller at disposisjonen er én piksel tykk og er satt til den høyeste intensitetsverdien i et bilde (255 i et gråtonebilde fra 0 til 255).
- Identifisere GJ på sin pentalaminar strukturen11,12, og definere begynnelsen av perinexus som punktet der de to motstridende cellemembranen bilayers divergere, som vist i figur 1A. Start ~ 200 nm fra kanten av GJ, sporing langs indre membran av den første cellen og tilbake langs indre membran av den andre cellen. På ImageJ, plasserer pennen for å automatisk lukke disposisjonen. Denne kunstig lukking blir beskåret senere.
Merk: Det er avgjørende å skissere perinexus med stor forsiktighet på så høyt en forstørrelse som mulig, som selv små mis applikasjoner i disposisjonen kan resultere i flere nanometer feil i den siste målingen.
3. sette opp algoritme og velge Perinexus av interesse
Merk: Pathfinding algoritmen krever autograf, kant, graf, Node og Pathfinding funksjoner9 i samme katalog som MembraneSepDist m-filen. Alle filer kan finnes i supplerende filen S1.
- Velg lagre steder for data og tall. Dette er for tiden hardkodet i m-filen.
Merk: Den første linjen i programmet er en funksjon for å fjerne alle variabler, Lukk alle vinduer og fjerne kommandovinduet. Lagre ønsket variabler og tall før m-filen kjøres.
Merk: Programvare skjermbilder er inkludert i ekstra filen S2 for alle hardkodede verdier. - Kjør programmet "MembraneSepDist.m".
- Angi parametere.
Merk: En GUI ville popmusikk opp med standardparametere for gradient terskel, skala, område av interesse, og manuell start. Standardverdiene kan endres i m-filen, eller de kan endres for hvert enkelt bilde.- Angitt romlige avledede gradient terskel.
Merk: Høyere verdier gir mer poeng valgt midtlinjen isolert. Verdier som er for høyt eller for lavt (utenfor en rekke omtrent 3.0-7.9) kan resultere i beregningsorientert ineffektivitet eller en upresis utvalg av midtlinjen poeng gir upresise midtlinjen isolasjon (se figur 2Vekselstrøm). - Angi skalaen i piksler/enheter.
- Angi romlige nedre og øvre grensene for regionen rundt.
Merk: Ved vårt laboratorium konvensjonen, det definerte området av interesse er mellom 30 og 105 nm fra kanten av GJ2,3,10. - Angi automatisk/manuell start. I fleste tilfeller registrerer algoritmen nøyaktig utgangspunktet hvor gapet kryss endene og perinexus begynner. Men i noen tilfeller av irregularly-formet perinexi, må brukeren identifisere startpunktet manuelt. Sett denne verdien til 0 for automatisk, 1 for håndbok.
- Angitt romlige avledede gradient terskel.
- Velg ønsket bilde.
Merk: Velg filmappe kan endres i m-filen. - Beskjære bildet for å velge perinexus rundt.
- Når bildet kommer opp, endres automatisk markøren til et trådkors. Beskjære bildet ved å dra en boks rundt perinexus rundt (se Figur 3). Beskjæringsboksen kan justeres ved hjelp av rutene på hjørnene og sidene for å gjøre den større eller mindre.
- Når beskjæring, sikre at "åpne" i perinexus (lengst GJ, se fig. 3) beskjæres slik at to membran konturene kommer til kanten av det beskårede bildet.
Merk: Det anbefales å gjøre til bildet fullskjermmodus lettere se perinexus rundt og beskjære riktig.
- Velg siste avlingen ved å dobbeltklikke med curser mellom motstridende kantene skal måles.
Merk: Det er viktig at dobbeltklikket utføres i perinexus. Hvis programmet ikke klarer å identifisere en midtlinjen, starter programmet og kontroller Klikk skjer innen perinexus. - Observere siste midtlinjen etter alle dilations og erosjoner popmusikk opp en endelige brukeren evaluering av programmets effekt.
Merk: Vises det en dialogboks på skjermen mens programmet kjører for å informere brukeren at Matlab ikke kan behandle flere kommandoer til programmet er ferdig. Hvor lang tid prosessen tar, avhenger av matrisestørrelse (bilde) og datamaskinen prosessorkraft. - Hvis manuell startpunktet er aktivert, observere bildet av midtlinjen popmusikk opp over det opprinnelige anatomiske bildet, sammen med et trådkors markøren (se figur 2E). Velg et punkt utenfor perinexus nær ønsket startpunkt.
Merk: Programmet finner midtlinjen punktet nærmest det valgte piksel og bruke det som startpunktet. - Postdataene.
Merk: Når programmet er ferdig, returnerer programmet en tilordnet midtlinjen tomten av perinexal bredde som en funksjon av avstanden fra kanten av GJ. I tillegg programmet returnerer den gjennomsnittlige perinexal bredden opp til 150 nm fra kanten av GJ samt gjennomsnittlige fra innenfor definerte regionen rundt på Matlab-kommandolinjen. Wp -verdier og avstander fra GJ lagres i variabelen "WpList", eller brukeren kan manuelt registrere dem separat.
4. algoritmen feilsøking
- Hvis midtlinjen ikke er riktig identifisert (figur 2A), åpne figuren "Gmag" og bruke indeksen til å identifisere en passende gradient terskelen (figur 2C).
- Hvis startpunktet ikke er riktig identifisert, oppgi startpunktet manuelt (se protokollen 3.8).
Representative Results
Statistiske metoder: Sammenligninger ble gjort mellom eksperimentelle grupper ved hjelp av Student t-tester. En p-verdien < 0,05 anses betydelig og alle verdier er representert som gjennomsnittlig ± standardavvik.
Manuell segmentering. Kvantifisering av GJ tilstøtende perinexus nanodomain bredden (Wp) gjøres vanligvis ved manuell segmentering. Denne manuelle segmentering er demonstrert i figur 1A og ble beskrevet tidligere6. Observatøren identifiserer kanten av GJ (figur 1, rød prikk), måler 5nm langs midten av perinexus og måler avstanden mellom membranene på det tidspunktet. Prosessen er så gjentatt på 10, 15, 30 og hver 15 nm opptil 150 nm. Denne teknikken, mens effektive, har begrensninger og romlig under prøvetaking langs perinexus.
Mener Wp målinger fra tidligere studier varierer fra ca 10 til 20 nm2,3,10og 3 nm synes å være den gjennomsnittlige forskjellen for å oppdage statistisk betydning, som er godt over det romlig Nyquist-frekvensen av 0,7 nm per måling basert en interpixel oppløsning på 0,34 nm. Derfor, mens manuelle segmentering er tidkrevende, metoden er tilstrekkelig til å måle forskjeller i Wp tilknyttet en intervensjon eller sykdom tilstand.
Føljetong bilde Dilations. For å måle perinexus på en raskere, reproduserbare måte med passende romlig oppløsning, utviklet vi et program basert på seriell bilde dilations telle piksler mellom to manuelt spores membraner, som kan ses i figur 1B .
Seriell dilatasjon prosessen er illustrert i Figur 4. Som det binære bildet dilated (figur 4A-4D), at dilation er da invertert og lagt til en fungerende image - binære form av opprinnelige disposisjonen (figur 4E-4 H). Prosessen gjentas til disposisjonen er helt fylt ut (Figur 4D). Foreløpig er siste arbeider bildet (Figur 4H) summen av antall ganger en bestemt piksel har vært un dilated. Slik er verdiene nær omrisset av cellemembraner svært lav, mens verdiene i sentrum er høyest. Ved å telle antall dilations å fylle området på hvert punkt, kan avstanden mellom membran kantene beregnes. Den neste utfordringen er å identifisere og isolere midtlinjen for å kvantifisere perinexal bredde som en funksjon av avstanden fra GJ, ved første bruke en romlig derivat arbeider-arbeidsprosessen (figur 2-siste bildet og figur 5 A). Et annet eksempel på en mer irregularly-formet perinexus finnes i supplerende filen S3.
Senterlinje identifikasjon. Graderingen for det endelige arbeider bildet kan kvantifiseres av en romlig derivat, som dilatasjon telle verdiene fra kant til kant endres fra høy til lav til høy igjen (figur 5et venstre mot høyre). Vurderer bare omfanget av den romlige deriverte (figur 5B) er disposisjonen og midtlinjen merket med hvite piler, straks kan identifiseres som områder på diskontinuitet. På disse stedene endres gradient retning fra økende reduseres eller omvendt. Bruke en terskel (figur 5C) produserer en binær image midtlinjen og disposisjon, og trekke opprinnelige disposisjonen gir isolert midtlinjen (figur 5D). Mens denne metoden for å isolere midtlinjen er beregningsmessig effektivt, skaper terskelen på den romlige deriverte hull i resulterende midtlinjen. Disse hullene (figur 5D, sette) må fylles å gi en nøyaktig måling av avstand fra GJ og sikre perinexus måles i sin helhet. Først senterlinje er utvidet for å fylle i noen hull (figur 5E), etterfulgt av en erosjon (figur 5F) og en "bwmorph"-funksjon (operasjon = 'skel', n = inf) å fjerne så mange poeng som mulig samtidig som en kontinuerlig midtlinjen, og dermed øke beregningsorientert effektiviteten av en påfølgende pathfinding algoritme utviklet av Wasit Limprasert og tilgjengelig på MATLAB Central9. Utvidelse-erosjon funksjonen produserer fullført midtlinjen, som er kombinert med det endelige arbeider bildet (figur 5G). Men denne midtlinjen er ofte mer enn én piksel tykk og er derfor ikke en presis isolering av midtlinjen.
Wasit Limprasert pathfinding algoritmen brukes til å bestemme perinexus senterlinje. Pathfinding algoritmen er i stand til å spore de høyeste verdiene - i dette tilfellet verdiene nærmest midten som forble un strekte gjennom de gjentakelser langs midtlinjen (figur 5G, sett inn). Resultatet er en automatisk spor av midtlinjen, som vist i figur 6. Av aisolering midtlinjen, kan perinexal bredde presenteres som en funksjon av avstanden fra slutten av GJ, som vist i figur 6B (øverst), eller som gjennomsnittlig bredden på et angitt område av interesse.
Kjernen analyse. Det er viktig å merke seg at digitaliserte bilder er basert på torget matriser og dilatasjon kjerner er likeledes basert på kvadratiske matriser. Dette betyr at dilatasjon avstanden over en diagonal er større enn ortogonale. Derfor forsøkte vi neste å fastslå om kjernen påvirket resultatene av algoritmen. For å kvantifisere kjernen-spesifikke variasjon, fem forskjellige kjernen figurer ble analysert: "pluss" (figuren brukes i ovennevnte analysene), "X", "boksen" og "linje", som beskrevet i figur 7et. Kjernen brukes på hvert ikke-null poeng av en binære bilder. Stjernen i hver kjerne av figur 7et representerer sentrum, der hvit er verdien 1 og svart er verdien 0 for dilatasjon kjernen.
Hver kjernen påvirker mener Wp måling av en enkelt lag vannrett perinexal bilde (figur 7B, topp), kvantifisert av en erfaren bruker, ble bestemt ved å rotere bildet med Matlab "imrotate" kommando og databehandling Wp i trinn på 10 °. Wp målingsverdiene (figur 7B, nederst) variere med bilderetningen på rektifiserte sinusformet måte med et pluss formet kjernen. De laveste verdiene oppstår når en relativt likefram perinexus er orientert vertikalt eller horisontalt. Verken X, boks, eller linje kjerner gitt noen fordel over plus-formet kjernen. X og boksen kjerner produserte identiske resultater, men verdiene til bety Wp var ut av fase med the Plus kjernen av 45 °. Linje kjernen ikke fullt dilate bildet i visse vinkler som kan sees ved fravær av data i det grønne sporet for profilen dreie mindre enn 30 eller mer enn 145 °. Dermed overvurdert ortogonale pluss dilatasjon kjernen membran separasjon når strekke en perinexus med en akse orientert diagonalt for eksempel på ca 45 °, og X og boksen kjerner undervurdert betyr Wp da den lange aksen til perinexus var også på 45°. Basert på analysen, utviklet vi en korrigeringsfaktoren vareintervall generert fra utvidelsen med pluss-formet kjernen. Konto for overvurdering av membran separasjon tilknyttet bilderetningen, denne korrigeringsfaktoren multiplisert med målte breddeverdien avhengig av retningen på bildet (formel 1).
Hvis θ < 45°
Wp rettet = cosd(θ) * Wp målt
Hvis θ ≥45 °
Wp rettet = cosd(θ) * Wp målt (formel 1)
I denne likningen er Wp målt den opprinnelige Wp verdien generert av ovennevnte algoritme og θ er beregnet vinkelen fra vannrett, i grader. Θ beregnes ved å ta den inverse tangenten til samlet endring i horisontal retning delt på samlet endring i vertikal retning av perinexal senterlinje. Over korreksjon tilnærmet gjennomsnittlig vinkelen, i forhold til vannrett på perinexus (Figur 8A, øverste venstre) og resulterer i en måling som om oppnådd fra en vannrett perinexus (Figur 8A, venstre nederst). Begrunnelsen bak denne ligningen kommer fra det faktum at plus-formet kjernen (figur 7et) er i hovedsak to linje-formet kjerner arrangert ortogonalt til hverandre. Som sådan, under 45° (nærmere til vannrett), dilations oppstå vertikalt og derfor multipliseres cosinus til vinkelen gir korrekt måler. Derimot for vinkler over 45° (nærmere til loddrett), dilations oppstå vannrett og sinus brukes til å fastslå korrekt måler. På nøyaktig 45° er sinus og cosinus like. Supplerende filen S4 inneholder en skildring av dette konseptet. Merk at denne korreksjonen er basert på gjennomsnittlig vinkelen og forsiktighet bør brukes når du analyserer vesentlig ikke-lineære figurer. Denne prosessen ble gjentatt på 20 tilfeldig valgte perinexi og korrigert målingene korrelert sterkt med målinger ved manuelt rotere og re analysere bildene (Figur 8A, høyre). For å bekrefte nøyaktig korreksjon for bilderetningen, var to sett av phantom kanter generert (Figur 8B, venstre) og rotert 180 °. Med trigonometriske rettelsen tilbake algoritmen nøyaktig den riktige verdien på hver orientering, uavhengig av romlig oppløsning eller bildestørrelse (Figur 8B, høyre).
Analytisk program og reproduserbarhet med retningen korreksjon. Minner om at tidligere studier med manuell segmentering rapport statistisk signifikant mener Wp forskjeller større enn eller lik 3 nm, var det viktig å bestemme om algoritmen kan brukes til å recapitulate tidligere funn ved hjelp av en komplett dataset. Bruke den nye algoritmen, to observatører - en opplevd og en unexperienced perinexal analyse (Obs. 1 og Obs. 2, henholdsvis)-analysert de samme bildene fra en tidligere studie6 som inkludert 12 pasienter som ble diagnostisert med atrial fibrillation (AF) før vev samling og 29 pasienter som ikke har pre-eksisterende AF (No-AF). Det erfaring brukeren fant at Wp var betydelig større hos pasienter med AF enn uten AF (21.9±2.5 og 18.4±2.0 nm, henholdsvis figur 9A). Disse verdiene med korrigeringsfaktoren brukes er lik de rapporterte tidligere (24.4±2.2 nm og 20.7±2.4 nm, henholdsvis)6. Viktigere, uerfaren brukeren funnet den samme betydelig forskjellen (22.1±2.8 nm og 20.1±2.6 nm, henholdsvis) mellom sykdomstilstander med automatiserte programmet. Standardavviket for Wp verdiene endret i tillegg ikke med korrigeringsfaktoren, indikerer standardavviket for 2-3 nm ikke er en gjenstand av algoritmen men strukturen seg og vev behandling. Disse resultatene viser at den foreslåtte automatiserte metoden er dugelig av recapitulating resultatene av tidligere studier.
Viktigere, perinexus er en nylig definert struktur og ingen konsensus er nådd på rekke absolutte verdier av membran separasjon tilstøtende GJ2,3. Siden ytre-membran-til-ytre-membran GJ bredde er tidligere anslått 20 nm13, forsøkt vi å bestemme algoritmens effekt ved å måle også GJ bredde. Begge observatører fant ingen signifikant forskjell mellom gapet krysset bredder (GJW) av pasienter med eller uten eksisterende AF (figur 9B). Absolutt GJW verdier for AF og ikke-AF pasientene var 20.5 ± 2.5 nm og 20,3 ± 1,9 nm, henholdsvis for erfarne observatør og 21.0 ± 3.1 nm og 20.0 ± 2.2 nm for uerfarne observatør, ligner det har blitt rapportert tidligere.
For å fastslå om automatiske algoritmen kreves mindre tid til å analysere data enn manuell segmentering, registrert både erfarne og uerfarne brukeren tid nødvendig å kvantifisere en 10-image trening satt (ekstra fil S5). Tabell 1 viser at erfarne og uerfarne brukeren redusert analyse tid av 4,7 - og 8.3 ganger henholdsvis bruker automatiserte algoritmen i forhold til manuelle segmentering tilnærming, med en ca 43-fold økning i romlig oppløsningen langs perinexus.
Algoritmen feilsøking. Den vanligste feilen når du kjører algoritmen oppstår når siste midtlinjen ikke slutter på kanten av bildet. I slike tilfeller ble ikke nok poeng valgt fra romlige avledede kart, forårsaker mislykkes og produserer en feilmelding som anbefaler at brukeren velger en større beskjæringsområdet eller øke den romlige avledede terskelen. Tegne en større beskjæringsboksen vil forbedre påliteligheten av programmet i noen tilfeller som romlig avledede endres drastisk nær figuren, som kan forstyrre pathfinding eller edge oppdagelsen algoritmer.
Det er også mulig for pathfinding algoritmen ikke klarer å identifisere midtlinjen, selv om midtlinjen når kanten av bildet, spesielt hvis gradient terskelen er for lav (figur 2A). Hvis gradient terskelen er satt for høyt, vil det være flere unødvendige poeng innlemmet i pathfinding algoritmen (figur 2B), redusere beregningsorientert effektivitet. Hvis brukeren er ikke kan finne en passende terskel, bilde array "GMag" (figur 2C), som er generert av programmet og kan finnes i arbeidsområdet, kan hjelpe brukeren bestemme terskelen. Punkter langs midtlinjen og angi terskelen over deres indeksverdien å sikre disse punktene er valgt. I den gitte eksemplet ville en riktig terskelen være over ~5.1 (figur 2C, sett inn).
Startpunktet kan også mislykkes å nå begynnelsen av perinexus (figur 2D). I dette tilfellet å kjøre programmet og angi Manuell Start verdien 1. Når midtlinjen har vært isolert, brukeren velger et punkt utenfor på perinexus og midtlinjeovertrykk punktet nærmest for valgte piksel (figur 2E, rød firkant) angis som startpunktet. Resultatet er full midtlinjen (figur 2F).
Figur 1 : TEM bilder med kvantifisering prosesser. Manuell segmentering prosessen (A) krever at brukeren utføre 12 intermembrane enkeltmål under estimering midtlinjen. Den automatiske prosessen (B) krever manuell, kontinuerlig spor av perinexus. Den røde prikken i hvert bilde representerer brukeren-identifisert slutten av GJ og begynnelsen av perinexus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Midtlinjen feilsøking. To primære moduser for svikt for midtlinjen identifikasjon og løsninger: hvert bilde er merket med matrisenavnet i Matlab. Hvis gradient terskelen er for lav (A, terskel 0,2) midtlinjen algoritmen kan mislykkes. Angi terskelen for høy (B, terskel 70) kan redusere beregningsorientert effektiviteten av pathfinding algoritmen. En passende gradient terskelen kan bestemmes fra GMag array (C, sett inn). Hvis midtlinjen ikke kommer til begynnelsen kanten av perinexus (D), kan brukeren velge å manuelt velge startpunktet. Etter den "Start punkt" alternativet er satt til 1 i åpningen GUI, brukeren deretter velger et punkt utenfor perinexus rundt (E). Sluttresultatet skal være en midtlinjen som nøyaktig viser helheten av perinexus (F). Alle etikettene tilbud (A-F) tilsvarer variabelnavn i Matlab. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Perinexus utvalg. Beskjære perinexus, klikk og hold for å dra en boks rundt det (beskjæringsverktøyet velges automatisk) som vist ved den blå pilen. Dette kan justeres ved hjelp av rutene på sidene og i hjørnene for å gjøre den større eller mindre. Den grønne pilen representerer slutten på perinexus, som brukeren skal sikre fortsatt er "åpne". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Serial bilde dilations. Binær disposisjonen er gjentatte ganger utvidet i én piksel om gangen (A-D) og lagt til arbeider bildet (den binære formen på bildet, eh) etter hver dilatasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: midtlinjen isolasjon og pathfinding. En romlig derivat beregnes fra siste arbeider bildet (A) og omfanget av at romlig derivater (B) brukes til å isolere disposisjonen og midtlinjen (hvite piler). En brukerdefinert grense identifiserer disposisjonen og midtlinjeovertrykk og trekke opprinnelige disposisjonen gir midtlinjen (D). Tomrom vises imidlertid i midtlinjen som følge av terskelen (D - sett). For å produsere en sammenhengende midtlinjen, utføres en sekundær dilatasjon på isolerte midtlinjen (E), etterfulgt av en sekundær erosjon å effektivisere beregningsorientert en påfølgende pathfinding algoritme. Dette svekket bildet (F) er deretter kombinert med siste arbeider bildet, slik at for identifikasjon av en kontinuerlig, én piksel tykk midtlinjen (G - sett). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Siste datapresentasjonen. Programmet utganger den endelige disposisjonen over det opprinnelige TEM bildet (A). Linjen er fargekodet grønt for 0-150 nm, blå for brukerdefinerte regionen interesse og rødt for området utenfor 150 nm. I tillegg utganger programmet et tilsvarende fargekodede diagram representerer Wp som en funksjon av avstanden fra begynnelsen av perinexus og for regionen rundt (B), og den gjennomsnittlige Wp (rammemarg i respektive diagrammet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Dilatasjon kjernen form analyse. Figurer for dilatasjon kjerner (A): stjernen i midten representerer strekte bildepunktene. Hvite bokser er piksler av dilation, i form av et pluss, X, eller linjen. En ca vannrett perinexus (B, topp, med en rød linje som angir 0°) var roteres med klokken fra 0 til 180° i trinn på 10° og gjentatte ganger strekte bruker forskjellige kjernen figurene (B, bunnen). Pluss - og linje-formet kjerner gir samme resultat, selv om linjen kjernen mislykkes i visse retninger, mens boks - og X-formet kjerner er fase av 45 °. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Image retning korreksjon. Til riktig orientering bildet, gjennomsnittlig vinkelen på perinexus beregnes fra plasseringen av de start - og del - points (A, igjen, begynnelsen og slutten av svart linje). Den inverse tangenten til endringen i y-retningen (en, venstre, grønn linje) delt av endringen i x-retningen (en, venstre, rød linje) rentene korreksjon vinkelen, θ (A, venstre, gul). Målet er å deretter rette Wp gjennomsnittsverdien for å gi den minste avstanden mellom kantene, som om perinexus hadde blitt fotografert ca vannrett (A, venstre nedenfor). Anvendelsen av korrigeringsfaktoren beskrevet av Formel 1 var i forhold til manuelt rotere hvert av 15 tilfeldig valgte bilder av den beregnede θ før analyse. Korrigert verdiene sterkt korrelert med rotert bildet verdiene (R2 = 0.991, A, høyre), viser Formel 1 er en gyldig korrigeringsfaktoren for bilderetningen. For å bekrefte korrigeringsfaktoren er passende, ble to fantomer generert av perfekt-parallell kantene med en kjent distanse mellom dem (B, venstre). Phantom 1 og Phantom 2 har romlig oppløsning på 2.833 piksler / mm og 71.6 bildepunkter/tommer, henholdsvis. Som vist av blå diamanter og røde firkanter i B, høyre, beregner algoritmen nøyaktig bredden over 180 grader til bilderoteringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : Algoritmen reproduserbarhet. Bruker den automatiske prosessen med retningen bildekorrigering, både erfarne og uerfarne observatør funnet betydelige forskjeller mellom AF og ingen-AF grupper (A), samsvarer med en tidligere studie, oppdager en minimum forskjell på 2.6 nm. I tillegg verken observatør fant en betydelig forskjell i GJW (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Manuell | Automatisk | |
| Tid - Obs. 1 (s) | 205±11 | 44±14 |
| Tid - Obs. 2 (s) | 248±18 | 30±5 |
| Romlig oppløsning (mål/nm) | 0,08 | 3,45 |
Tabell 1: sammenligning av manuelle og automatiske prosesser. Begge observatører kreves mindre tid per bilde å spore disposisjonen enn å utføre manuell segmentering prosessen for et 10-image trening. I tillegg den automatiske prosessen har en høyere samplingsfrekvens, innspilling 3,45 mål per nm, sammenlignet med et gjennomsnitt på 1 mål hver 12,5 nm for manuell prosessen. Opplæring sett bildene kan finnes i supplerende filen S5, disposisjoner og målinger som utføres av en erfaren bruker.
Discussion
Algoritmen bruker serielle bilde dilations telle antall piksler mellom to motstridende 2D kanter i en binær image, som i dette tilfellet er den Inter-membran separasjonen av de perinexus2,3,14. En romlig derivater og en pathfinding algoritme brukes deretter til å isolere midtlinjen, etterfulgt av en sekundær dilatasjon og erosjon sekvens å fylle hullene i midtlinjen, ligner allerede gjort før15. Midtlinjen er deretter kombinert med siste dilatasjon-count bildet representerer perinexal bredde som en funksjon av avstanden fra begynnelsen av kanten separasjon, i dette tilfellet slutten av GJ og begynnelsen av perinexus16.
Fire primære parameterne er brukerdefinert i en GUI ved starten av programmet:
- Gradient terskel
- Skala
- Region av interesse rekkevidde
- Start punkt utvalg metoden (automatisk eller manuell)
Den vanligste mekanismen for svikt for algoritmen er svikt i midtlinjen til kanten av bildet, som er hvordan sluttpunktet bestemmes for pathfinding algoritmen. For å fikse så sak, kan brukeren øke gradient terskelen beskrevet i trinn 3.3.1, som programmet å velge flere poeng av romlige avledede bildet, som vil øke databehandling tiden pathfinding algoritmen. Derfor krever denne algoritmen et kompromiss mellom beregning hastighet og midtlinjen integritet. Det er viktig å merke seg at så lenge alle steder av midtlinjen identifiseres fra den romlige deriverte, sammen med en passende startpunkt, romlig avledede terskelen har ingen virkning på kanten separasjon målingen.
Bilderetningen synes å påvirke dilatasjon verdier, fordi kjernen dilaterer i 90 graders skritt, som kan introdusere en feil hvis flertallet av området rundt er på en vinkel 45° til aksene av dilatasjon matriser. Derfor kan dilatasjon greven ikke alltid være en nøyaktig gjengivelse av mellomrom mellom kantene. Denne begrensningen har blitt løst ved en trigonometriske korrigeringsfaktoren, men potensielt kan bli ignorert hvis alle bildene i et datasett er justert i samme retning. Videre bør forsiktighet brukes i å tolke resultatene, det er mulig at delen fly ikke er perfekt vinkelrett to membraner. I figur 9Bbruker vi GJW for å foreslå at våre perinexus bilder var i flyet. Likevel er det viktig at utvalgene være tilstrekkelig stor å ta hensyn til eventuelle snitting variasjoner mellom bilder. I tillegg bør våre perinexal bredden målinger ikke tolkes for å gjenspeile i vivo mellomrom, men denne brukes til å måle mener forskjeller i perinexal bredde i forhold til noen inngrep eller sykdom staten.
Gjeldende algoritmen krever også en manuelt spores omriss av kantene som inndata. Det er viktig å merke seg at så lenge skalaen er riktig angitt, romlig oppløsning ikke påvirker algoritmens målinger, som demonstrert av varierende vedtak av bilder i figur 6 og et ekstra lav oppløsning bilde i supplerende filen S6. Det neste trinnet i å forbedre algoritmen fjerner menneskelig inngripen fra disposisjon generasjon med et verktøy som kan velge området av interesse. Disse funksjonene vil sannsynligvis forbedre presisjonen for måling og redusere bruker bias.
Denne beregningsmessig effektiv algoritme gir en raskere metode, krever omtrent en femtedel av arbeidstimer, av kvantifisere perinexus uten synlig straff å reproduserbarhet sammenlignet med manuell segmentering prosessen. I tillegg utnytter manuell segmentering prosessen en måling hver 15 nanometer å kvantifisere perinexal bredde, som kan føre til under prøvetaking som membran separasjon av perinexus kan endres vesentlig innenfor den 15 nm. I kontrast, har automatiserte programmet en romlig oppløsning for bildebehandling modalitet, i dette tilfellet 2.9 piksler per nanometer langs perinexus, derfor gir en mer fint løst gjennomsnitt av perinexal bredde.
Selv i feltet av cardiac strukturell biologi er lovende og spennende, bruke denne algoritmen bruker ikke TEM bilder. Alle felt som krever en presis, høyoppløselige måling av to kvasi parallelle 2D kanter kan gjøre bruk av denne algoritmen. Algoritmen kan brukes til å spore alt fra elvebredden erosjon og flom mønstre fra satellittbilder vaskulær utvikling med brightfield eller fluorescerende mikroskopi. En av de mest lovende potensielle anvendelser er i kardiologi og måle ventrikkel utstøting brøkdel (EF) med point-of-care cardiac echocardiography. Foreløpig er standard teknikken metoden biplan disker17, men en nyere algoritmen, AutoEF, er nyskapende EF-kvantifisere metoden18,19. Biplan metode for disker, kammeret aktuelle spores manuelt og kvantifisert bruker en modifisert Simpsons metode, der volumet beregnes automatisk ved summering av stablet elliptiske disker. Den viktigste begrensningen med denne metoden er at det kan bare returnere totalt tverrsnitt område av ønsket kammeret, med ingen oppløsning til å identifisere bestemte områder av interesse, og krever også betydelig menneskelig input og ekspertise. Nyere metoden, AutoEF, identifiserer og skisserer kanten av ventrikkel benytter en 2D speckling algoritmen utvalgsgjennomsnittet ventrikkel tverrsnitt område. Denne prosessen, har mens presis og effektiv for å måle brutto ventrikkel området, også en lignende iboende begrensning bare måle totalt tverrsnitt. Denne ulempen begrenser klinikere diagnose og evner. Derimot algoritmen presentert i dette manuskriptet kan identifisere en midtlinjen og har en oppløsning til oppløsningen av tenkelig modalitet å finne bestemte områder av interesse. Dette er viktig fordi ultralyd skannere med mikrometer romlig oppløsning er kommersielt tilgjengelig20,21, noe som tyder på at denne algoritmen kan oppdage lokaliserte veggen motion unormalt oppløsning mikrometer i stedet for centimeter. Mens denne applikasjonen må valideres eksperimentelt, er det en av de mest umiddelbart lovende anvendelser av denne algoritmen. Faktisk det kan kombineres med speckle funksjonalitet av AutoEF eller manuell spor benyttet i manuell planimetry høyere oppløsning informere parallelt med vanlige EF data.
Så allsidig og gjeldende som gjeldende algoritmen, ble det utviklet for 2D-bilder. Men som bildeteknologi fortsette å forbedre, er det en økende etterspørsel etter 3 og 4 D kvantifisering teknologier. Den neste runden av algoritmen er derfor å tilpasse samme tilnærming, serielt strekke en binær image, en 3-dimensjonal objektet, der automatisk definere en midtlinjen er nå utover mulighetene i gjeldende bildeprogrammer. Slike en algoritme ville har bred programmer både klinisk og eksperimentelt i feltet cardiac alene, inkludert 3D cardiac echocardiograms22,23, 3D elektronmikroskop24,25, 26og 3D magnetisk resonans imaging27,28,29.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Kathy Lowe på Virginia-Maryland universitet av Veterinary medisin for behandling og flekker TEM prøver.
Finansiering:
National Institutes of Health R01-HL102298
National Institutes of Health F31-HL140873-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Touchscreen Monitor | Dell | S2240T | Needs soft-tipped stylus |
| Desktop | Dell | Precision T1650 | 8GB RAM |
| Operating System | Microsoft | Windows 7 Enterprise | 64-bit OS |
| Program platform | Mathworks | Matlab R2015b | Program may be incompatible with newer/older versions of Matlab |
References
- Rhett, J. M., Gourdie, R. G. The perinexus: a new feature of Cx43 gap junction organization. Heart Rhythm. 9 (4), 619-623 (2012).
- Veeraraghavan, R., et al. Sodium channels in the Cx43 gap junction perinexus may constitute a cardiac ephapse: an experimental and modeling study. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).
- George, S. A., et al. Extracellular sodium dependence of the conduction velocity-calcium relationship: evidence of ephaptic self-attenuation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 310 (9), 1129-1139 (2016).
- Veeraraghavan, R., et al. Potassium channels in the Cx43 gap junction perinexus modulate ephaptic coupling: an experimental and modeling study. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2016).
- Rhett, J. M., et al. Cx43 associates with Na(v)1.5 in the cardiomyocyte perinexus. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 411-422 (2012).
- Raisch, T. B., et al. Intercalated Disc Extracellular Nanodomain Expansion in Patients with Atrial Fibrillation. Frontiers in Physiology. , (2018).
- Yan, J., et al. Novel methods of automated quantification of gap junction distribution and interstitial collagen quantity from animal and human atrial tissue sections. PLoS One. 9 (8), 104357 (2014).
- Papari, G., Petkov, N. Adaptive pseudo dilation for gestalt edge grouping and contour detection. IEEE Transactions on Image Processing. 17 (10), 1950-1962 (2008).
- Limprasert, W. PathFinding. , Available from: www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34966-pathfinding (2012).
- George, S. A., et al. Extracellular sodium and potassium levels modulate cardiac conduction in mice heterozygous null for the Connexin43 gene. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).
- Revel, J. P., Karnovsky, M. J. Hexagonal array of subunits in intercellular junctions of the mouse heart and liver. Journal of Cell Biology. 33 (3), 7-12 (1967).
- Huttner, I., Boutet, M., More, R. H. Gap junctions in arterial endothelium. Journal of Cell Biology. 57 (1), 247-252 (1973).
- Makowski, L., et al. Gap junction structures. II. Analysis of the x-ray diffraction data. Journal of Cell Biology. 74 (2), 629-645 (1977).
- Entz, M., et al. Heart Rate and Extracellular Sodium and Potassium Modulation of Gap Junction Mediated Conduction in Guinea Pigs. Frontiers in Physiology. 7, 16 (2016).
- Sild, M., Chatelain, R. P., Ruthazer, E. S. Improved method for the quantification of motility in glia and other morphologically complex cells. Neural Plasticity. 2013, 853727 (2013).
- Rhett, J. M., et al. The perinexus: Sign-post on the path to a new model of cardiac conduction. Trends in Cardiovascular Medicine. , (2013).
- Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Journal of the American Society of Echocardiography. 28 (1), 1-39 (2015).
- Kawai, J., et al. Left ventricular volume and ejection fraction by the axius auto ejection fraction method: comparison with manual trace method and visual assessment of ejection fraction. Journal of Cardiology. 49 (3), 125-134 (2007).
- Frederiksen, C. A., et al. Clinical utility of semi-automated estimation of ejection fraction at the point-of-care. Heart, Lung and Vessels. 7 (3), 208-216 (2015).
- Foster, F. S., et al. A new ultrasound instrument for in vivo microimaging of mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 28 (9), 1165-1172 (2002).
- Moran, C. M., et al. A comparison of the imaging performance of high resolution ultrasound scanners for preclinical imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (3), 493-501 (2011).
- Papademetris, X., et al. Estimation of 3D left ventricular deformation from echocardiography. Medical Image Analysis. 5 (1), 17-28 (2001).
- Hosny, A., et al. Unlocking vendor-specific tags: Three-dimensional printing of echocardiographic data sets. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 155 (1), 143-145 (2018).
- Cretoiu, D., et al. Human cardiac telocytes: 3D imaging by FIB-SEM tomography. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2157-2164 (2014).
- Risi, C., et al. Ca(2+)-induced movement of tropomyosin on native cardiac thin filaments revealed by cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6782-6787 (2017).
- Dhindwal, S., et al. A cryo-EM-based model of phosphorylation- and FKBP12.6-mediated allosterism of the cardiac ryanodine receptor. Science Signaling. 10 (480), (2017).
- Reddy, V. Y., et al. Integration of cardiac magnetic resonance imaging with three-dimensional electroanatomic mapping to guide left ventricular catheter manipulation: feasibility in a porcine model of healed myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 44 (11), 2202-2213 (2004).
- van Heeswijk, R. B., et al. Three-Dimensional Self-Navigated T2 Mapping for the Detection of Acute Cellular Rejection After Orthotopic Heart Transplantation. Transplant Direct. 3 (4), 149 (2017).
- Valinoti, M., et al. 3D patient-specific models for left atrium characterization to support ablation in atrial fibrillation patients. Magnetic Resonance Imaging. 45, 51-57 (2018).
