Summary
Syftet med denna algoritm är att kontinuerligt mäta avståndet mellan två 2-dimensionella kanter använder seriell bild utspädningar och pathfinding. Denna algoritm kan tillämpas på olika områden såsom hjärt strukturbiologi, vaskulär biologi och anläggningsverksamhet.
Abstract
En nyligen beskrivna extracellulära nanodomain, kallas perinexus, har varit inblandad i ephaptic koppling, som är en alternativ mekanism för elektrisk överledning mellan hjärtmuskelcellerna. Den nuvarande metoden för att kvantifiera detta utrymme genom manuell segmentering är långsam och har låg spatial upplösning. Vi utvecklade en algoritm som använder seriell bild utspädningar av ett binärt disposition för att räkna antalet pixlar mellan två motsatta 2 dimensionell kanter. Denna algoritm kräver färre mantimmar och har en högre spatial upplösning än den manuella metoden samtidigt som den manuella processen reproducerbarhet. I själva verket, erfarna och nybörjare utredare kunde sammanfatta resultaten av en tidigare studie med denna nya algoritm. Algoritmen är begränsad av den mänskliga indata som behövs till manuell disposition i perinexus och beräkningskraft främst översköljas av en redan existerande pathfinding-algoritm. Dock gör algoritmens hög genomströmning kapacitet, hög rumslig upplösning och reproducerbarhet det en mångsidig och robust mätverktyg för användning i en mängd olika tillämpningar som kräver mätning av avståndet mellan någon 2-dimensionell (2D ) kanter.
Introduction
Följande algoritm har utvecklats för att mäta intermembrane avståndet mellan två strukturellt kopplade hjärtmuskelcellerna vid den punkt som de separata från varandra vid kanten av en gap junction plack i en nanodomain som kallas perinexus-1, som har varit inblandade i ephaptic koppling2,3,4,5. Håller på att analysera hundratals överföring elektronmikroskopi (TEM) bilder av perinexi med en manuell segmentering metod i en tidigare studie6, identifierades behovet för en högre genomströmning metod som provtas perinexal bredd i högre rumslig upplösning samtidigt bevara riktigheten av den tidigare manuella segmentering processen under manuell segmentering, linjer dras mellanrum 15 nm, ungefärligt ortogonal mot mittlinjen, för att mäta perinexal bredd. Den nya algoritmen tar en en bildpunkt tjock binära skissera av två parallella linjer och använder seriell bild utspädningar för att räkna antalet pixlar mellan de två membran. Medan bilden utspädningar har vanligen använts i en myriad av bild bearbetning applikationer, använder inklusive kontur eller edge detection7,8, denna algoritm utspädningar som en räknande mekanism. Mittlinjen är isolerade med en pathfinding algoritm9 och perinexal bredd mäts sedan med upplösning längs längden av perinexus motsvarar upplösningen på bilden. Skillnaden i upplösning i detta fall är 1 mätning per 15 nm för manuell segmentering och 1 mätning per 0,34 nm med den nya algoritmen, en 44-fold ökning av rumsliga samplingsfrekvens. Dessutom sker detta ökad samplingsfrekvens i ungefär 1/5th den tid som behövs för manuell segmentering.
Denna algoritm används i dess nuvarande form för att mäta perinexal bredd på den konventionella 0-150 nm från kanten av en gap junction plack5 (GJ) samt inom ett specificerat område av intresse, där perinexus platåer mellan 30 och 105 nm2 , 3 , 10. ökad samplingsfrekvensen minskar variabiliteten i enskilda perinexus mätningar jämfört med manuell segmentering och kraftigt förkortar analys tid, vilket möjliggör effektiv hantering av stora datamängder. Detta program är dock inte begränsad till nanoskala TEM bilder av hjärt ortodoxas diskar. Samma tillvägagångssätt kan användas för att kvantifiera vaskulär diameter, ejektionsfraktion eller ens icke-biologiska fenomen som floden erosion eller översvämningar. Denna algoritm är lämpligt för kvantifiering av avståndet mellan två nästan parallella kanter.
Protocol
Obs: Programvaran krävs ImageJ (eller liknande bild-ändra programvara) och Matlab R2015. Användaren kan uppstå kompatibilitetsproblem med andra versioner av Matlab.
1. förbehandling bilder
- För alla gråskalebilder, säkerställa maximal intensitetsvärdet från en given bildpunkt är < 255. Detta görs vanligtvis genom att subtrahera värdet 1 från bilden i det anpassade Matlab programmet ”ImageSub.m”, ingår i kompletterande fil S1.
2. disposition av Perinexus
- Beskriva perinexus i ImageJ eller andra bildbehandling programvara.
- Säkerställa att skissera en pixel tjock och är inställd på intensitetsvärdet högsta i en bild (255 i en gråskalebild från 0 till 255).
- Identifiera GJ genom dess pentalaminar struktur11,12, och definiera början av perinexus som den punkt där de två motsatta cellmembranet lipidmonolager avvika, som visas i figur 1A. BEGIN ~ 200 nm från kanten av den GJ, spåra längs det inre membranet av den första cellen och tillbaka längs det inre membranet av den andra cellen. I ImageJ, släppa pennan för att automatiskt stänga dispositionen. Denna konstgjorda avslutande beskärs senare.
Obs: Det är viktigt att beskriva perinexus med stor omsorg vid så hög förstoring som möjligt, eftersom även små mis applikationer av dispositionen kan resultera i flera nanometer för fel i den slutliga mätningen.
3. ställa in algoritm och välja Perinexus av intresse
Obs: Den pathfinding algoritmen kräver autograf, Edge, Graf, nod och Pathfinding funktioner9 att vara i samma katalog som den MembraneSepDist m-fil. Alla filer kan hittas i kompletterande fil S1.
- Välj Spara platser för data och diagram. Detta är för närvarande hårdkodade i m-filen.
Obs: Den första raden i programmet är en funktion för att rensa alla variabler, Stäng alla fönster och rensa kommandofönstret. Spara alla önskade variabler eller siffror innan du kör m-filen.
Obs: Programvaran skärmdumpar ingår i kompletterande fil S2 för alla hårdkodade värden. - Kör programmet ”MembraneSepDist.m”.
- Ställa in parametrar.
Obs: En GUI kommer att dyka upp med standardparametrar för gradient tröskel, skala, regionen av intresse och manuell start. Standardvärdena kan ändras i m-filen, eller de kan ändras för varje enskild bild.- Inställd rumsliga härledda gradient tröskel.
Notera: Högre värden resultera i fler punkter markerade mittlinjen isolerat. Värden som är för högt eller för lågt (utanför en rad cirka 3,0-7,9) kan resultera i computational ineffektivitet eller en oprecis urval av mittlinjen punkter ger oprecisa mittlinjen isolering (se figur 2A-C). - Ange skala i pixlar/skala enheter.
- Ange de rumsliga lägsta och övre gränserna för regionen av intresse.
Obs: Våra laboratoriets konventionen, regionen definierad av intresse är mellan 30 och 105 nm från kanten av GJ2,3,10. - Ange automatisk/manuell start. I flesta fall upptäcker algoritmen korrekt utgångspunkt var det gap junction slutar och perinexus börjar. Dock i vissa fall av oregelbundet formade perinexi, måste användaren identifiera startpunkten manuellt. Ange värdet 0 för automatisk, 1 för manuella.
- Inställd rumsliga härledda gradient tröskel.
- Välj önskad bild.
Obs: Mappen Välj kan ändras i m-filen. - Beskära bilden för att välja perinexus av intresse.
- När bilden kommer upp, ändras markören automatiskt till ett hårkors. Beskär bilden genom att dra en ruta runt perinexus av intresse (se figur 3). Beskärningsrutan kan justeras med hjälp av kvadraterna på i hörnen och på sidorna gör den större eller mindre.
- Vid beskärning, säkerställa den ”öppna” änden av perinexus (längst bort från GJ, se figur 3) är beskuren så att två membran konturerna når kanten av den beskurna bilden.
Obs: Det rekommenderas att göra bilden full-skärm att lättare se perinexus av intresse och beskära på lämpligt sätt.
- Välj den slutliga skörden genom att dubbelklicka med markören mellan motsatta kanter skall mätas.
Obs: Det är viktigt att dubbelklicka utföras inuti perinexus. Om programmet inte identifierar en mittlinje, starta om programmet och se till att klicka uppstår inom perinexus. - Observera sista mittlinjen efter alla utspädningar och erosioner pop upp för en slutanvändaren bedömning av programmets effektivitet.
Obs: En dialogruta visas på skärmen medan programmet är igång för att informera användaren att Matlab kommer att inte behandla någon ytterligare kommandon tills programmet har avslutats. Hur lång tid detta tar beror på array (bild) storlek och dator processorkraft. - Om manuell startpunkt är aktiverad, Observera bilden av mittlinjen dyka upp över den ursprungliga anatomiska bilden, tillsammans med ett hårkors markören (se figur 2E). Välj en punkt utanför perinexus nära önskad startpunkt.
Obs: Programmet kommer att hitta mittlinjen punkten närmast den valda pixel och använda den som startpunkt. - Registrera data.
Obs: När programmet är klar, programmet kommer tillbaka en mappad mittlinjen, tomt på perinexal bredd som en funktion av avståndet från kanten av GJ. Dessutom, programmet kommer att returnera genomsnittliga perinexal bredd upp till 150 nm från kanten av GJ samt genomsnittliga från inom regionen definierad av intresse på Matlab kommandoraden. Wp värden och avstånd från GJ lagras i variabeln ”WpList” eller användaren kan manuellt registrera dem separat.
4. algoritm felsökning
- Om mittlinjen inte är korrekt identifierade (figur 2A), öppna siffran ”Gmag” och använder Index för att identifiera en lämplig lutning tröskel (figur 2C).
- Om startpunkten inte identifieras korrekt, ange startpunkten manuellt (se protokollet 3.8).
Representative Results
Statistiska metoder: Jämförelser gjordes mellan experimentella grupper med Student's t-test. Ett p-värde < 0,05 anses betydande och alla värden representeras som medelvärde ± standardavvikelse.
Manuell segmentering. Kvantifiering av GJ-intilliggande perinexus nanodomain bredd (Wp) sker vanligtvis genom manuell segmentering. Denna manuella segmentering process demonstreras i figur 1A och var tidigare beskrivna6. Observatören identifierar kanten av GJ (figur 1, röd prick), mäter 5nm längs mitten av perinexus och mäter avståndet mellan membranen på den punkten. Processen upprepas sedan på 10, 15, 30 och var 15 nm upp till 150 nm. Denna teknik, medan effektiv, har begränsningar i tid och rumsliga under provtagning längs längden av perinexus.
Menar Wp mätningar från tidigare studier kan variera från cirka 10 till 20 nm2,3,10, och 3 nm verkar vara den genomsnittliga skillnaden som behövs för att upptäcka statistisk signifikans, vilket är långt över den rumsliga Nyquist frekvens av 0,7 nm per mätning baserat en interpixel upplösning på 0,34 nm. Därför, medan manuell segmentering är tidskrävande, metoden är tillräcklig för att mäta skillnader i Wp är associerad med en intervention eller sjukdom stat.
Seriell bild utspädningar. För att mäta perinexus på ett snabbare och reproducerbart sätt med lämpliga rumslig upplösning, utvecklat vi ett program baserat på seriell bild utspädningar att räkna pixlar mellan två manuellt-spåras membran, som kan ses i figur 1B .
Seriell dilatation processen illustreras i figur 4. Som binära bilden är vidgade (figur 4A-4D), att dilatation sedan är inverterad och lagt till en fungerande bild - icke-binär form av den ursprungliga dispositionen (figur 4E-4 H). Processen upprepas tills dispositionen är helt fyllt i (figur 4D). Vid denna punkt, är den slutliga arbetande bilden (figur 4H) en sammanräkning av antalet gånger en viss pixel har förblivit un-dilaterad. Som sådan, är värdena nära konturerna av cellmembranen mycket låg, medan värdena på center är högsta. Genom att räkna antalet utspädningar att fylla området på varje punkt, kan avståndet mellan membran kanterna beräknas. Nästa utmaning är att identifiera och isolera mittlinjen för att kvantifiera perinexal bredd som en funktion av avståndet från det GJ, vilket görs genom att första tillämpa en rumslig derivat på den slutliga arbetande bilden (figur 2-sista bilden och figur 5 A). Ett andra exempel på ett mer oregelbundet formade perinexus kan hittas i kompletterande fil S3.
Mittlinjen identifiering. Lutningen av den slutliga arbetande bilden kan kvantifieras med ett rumsliga derivat, som dilatation greve värdena från kant till kant ändras från hög till låg till hög igen (figur 5A vänster till höger). Med tanke på endast omfattningen av det rumsliga derivatet (figur 5B) är den disposition och mittlinjen, markeras med vita pilar, omedelbart identifierbar som områden av diskontinuitet. På dessa platser ändras gradient riktningen från öka till minska eller vice versa. Tillämpar en tröskel (bild 5C) producerar en binär bild av mittlinjen och disposition, och subtrahera den ursprungliga dispositionen ger isolerade mittlinjen (figur 5D). Även denna metod att isolera mittlinjen är beräkningsmässigt effektiv, skapar det tröskelvärde som tillämpas på den rumsliga derivatan luckor i resulterande mittlinjen. Dessa luckor (figur 5D, infoga) måste fyllas att ge en exakt mätning av avståndet från GJ och se till att perinexus mäts i sin helhet. Först, mittlinjen är vidgade för att fylla i eventuella luckor (figur 5E), följt av en erosion (figur 5F) och en ”bwmorph”-funktion (operation = 'skel', n = inf) att eliminera så många poäng som möjligt samtidigt som den lämnar en fortlöpande mittlinjen, därmed öka computational effektiviteten i en efterföljande pathfinding algoritm utvecklad av Wasit Limprasert och finns tillgänglig på MATLAB centrala9. Denna utvidgning-erosion funktion producerar färdiga mittlinjen, som kombineras med den slutliga arbetande bilden (figur 5G). Men denna mittlinjen är ofta mer än en pixel tjock och är därför inte en exakt isolering av mittlinjen.
Den Wasit Limprasert pathfinding algoritmen används för att bestämma perinexus mittlinjen. Pathfinding algoritmen är kunna spåra de högsta värdena - i detta fall värdena som är närmast centrum som återstod un-vidgade genom mest iterationer längs mittlinjen (figur 5G, infoga). Resultatet är en automatisk spår av mittlinjen, som visas i figur 6. Genom att isolera mittlinjen, kan perinexal bredd presenteras som en funktion av avståndet från slutet av GJ, som visas i figur 6B (överst), eller som den genomsnittliga bredden på ett specificerat område av intresse.
Kernel analys. Det är viktigt att notera att digitaliserade bilder är baserade på kvadratiska matriser och dilatation kärnor är jämväl baserat på torget matriser. Detta innebär att dilatation avståndet över en diagonal är större än ortogonala. Därför försökte vi nästa avgöra om kärnan påverkas resultaten av algoritmen. För att kvantifiera kernel-specifika variabilitet, fem olika kernel former analyserades: ”Plus” (den form som används i ovanstående analyser), ”X”, ”Box” och ”Line”, som beskrivs i figur 7A. Kärnan tillämpas på varje icke-noll punkt i en binär bild. Stjärnan i varje kärna av figur 7A representerar stadens, där vitt är värdet 1, och svart är värdet 0 för dilatation kärnan.
Varje kärnans inflytande på genomsnittliga Wp mätning av en enda ungefär horisontell perinexal bild (figur 7B, överst), kvantifieras av en erfaren användare, bestämdes genom att rotera bilden med Matlab: s ”imrotate” kommando och Computing Wp i steg om 10 °. Mätvärdena Wp (figur 7B, botten) fluktuera med bildens orientering i en renad sinusformad mode med en Plus formade kärna. De lägsta värdena uppstå när en relativt rak perinexus är orienterad vertikalt eller horisontellt. Varken X, Box, eller linje kärnorna tillhandahålls någon fördel jämfört med plus-formade kärnan. X och Box kärnorna producerade identiska resultat, men värden menar Wp var ur fas med the Plus kernel av 45 °. Kärnan linje misslyckades att fullt vidga bilden vid vissa vinklar som kan ses av avsaknad av data i gröna spårningen för bilder som roteras på mindre än 30 eller mer än 145 °. Således, ortogonala Plus dilatation kärnan överskattade membran separation när dilating en perinexus med en axel orienterade diagonalt till exempel på cirka 45 °, och X och Box kärnorna underskattat betyder Wp när den långa axeln av perinexus var också på 45°. Baserat på denna analys, utvecklat vi en korrektionsfaktor som tillämpas på de värden som genererats från dilating med plus-formade kärnan. Att ta hänsyn till överskattningen av membran separation är associerad med orientering, denna korrektionsfaktor multiplicerat med värdet uppmätt bredd beroende på orienteringen av bilden (ekvation 1).
Om θ < 45°
Wp korrigerad = cosd(θ) * Wp mätt
Om θ ≥45 °
Wp korrigerad = cosd(θ) * Wp mätt (ekvation 1)
I denna ekvation är Wp mätt den ursprungliga Wp -värde som genereras av ovanstående algoritm och θ är beräknade vinkeln från horisontellt, i grader. Θ beräknas genom att ta Inverterad tangens för den totala förändringen i horisontell riktning dividerad med den totala förändringen i vertikal riktning av perinexal mittlinjen. Ovan korrigeringen approximerar den genomsnittliga vinkeln, i förhållande till horisontellt, av perinexus (figur 8A, vänster-top) och resulterar i en mätning som om erhålls från en horisontell perinexus (figur 8A, vänster-botten). Logiken bakom denna ekvation kommer från det faktum att plus-formade kärnan (figur 7A) är i huvudsak två line-formade kärnor ordnade ortogonalt till varandra. Som sådan, under 45° (närmare horisontella), utspädningar uppstå vertikalt och därför multipliceras med cosinus för vinkeln ger riktig mätning. Omvänt, för vinklar över 45° (närmare vertikala), utspädningar ske horisontellt och sinus används för att bestämma korrekt mätning. Vid just 45° är den sinus och cosinus lika. Kompletterande fil S4 ger en skildring av detta koncept. Observera att denna korrigering är baserad på den genomsnittliga vinkeln och försiktighet bör iakttas när man analyserar väsentligen icke-linjära former. Denna process upprepades på 20 slumpmässigt utvalda perinexi och korrigerade mätningarna korrelerade starkt med mätningar erhållna genom manuellt roterande och åter analysera bilderna (figur 8A, höger). För att bekräfta korrekt korrigering för bildorientering, var två uppsättningar av phantom kanter genererade (figur 8B, vänster) och vridas 180 °. Med trigonometriska korrigeringen återvände algoritmen exakt rätt värde på varje orientering, oavsett rumslig upplösning och Bildstorlek (figur 8B, höger).
Analytisk ansökan och reproducerbarhet med orientering korrigering. Som erinrar om att tidigare studier använder manuell segmentering rapport statistiskt signifikant menar Wp skillnader större än eller lika med 3 nm, var det viktigt att bestämma om att algoritmen kunde användas att sammanfatta tidigare fynd med hjälp av en komplett datamängd. Med hjälp av den nya algoritmen, två observatörer - en erfaren och en oerfaren med perinexal analys (Obs. 1 och Obs. 2, respektive)-analyseras samma bilder från en tidigare studie6 som ingår 12 patienter som diagnostiserades med förmaksflimmer förmaksflimmer (AF) före vävnad insamling och 29 patienter som inte hade redan existerande AF (nr-AF). Den erfarna användaren fann att Wp var betydligt större hos patienter med AF än utan AF (21.9±2.5 och 18.4±2.0 nm, respektive figur 9A). Dessa värden med korrektionsfaktorn tillämpas är liknande till de rapporterade tidigare (24.4±2.2 nm och 20.7±2.4 nm, respektive)6. Ännu viktigare, den oerfarna användaren hittade samma betydande skillnad (22.1±2.8 nm och 20.1±2.6 nm, respektive) mellan sjukdomstillstånd med automatiserade program. Standardavvikelsen för Wp värdena förändrades dessutom inte med korrektionsfaktorn, anger standardavvikelsen för 2-3 nm inte är en artefakt av algoritmen men struktur själv och vävnad behandling. Dessa resultat visar att den föreslagna automatiserade metoden är kapabel att går igenom resultaten av tidigare studier.
Ännu viktigare, perinexus är en nyligen definierade struktur och ingen enighet har nåtts om utbudet av absoluta värden av membran separation angränsande till GJ2,3. Eftersom yttre-membran-till-yttre-membran GJ bredd har tidigare uppskattats till 20 nm13, försökte vi fastställa algoritmens effekt genom att även mäta GJ bredd. Båda observatörerna fann ingen signifikant skillnad mellan gap junction bredder (GJW) av patienter med eller utan befintlig AF (figur 9B). Absolut GJW värden för AF och icke-AF patienter var 20,5 ± 2,5 nm och 20,3 ± 1,9 nm, respektive för erfarna observatören och 21,0 ± 3.1 nm och 20,0 ± 2,2 nm för oerfarna observatören, liknar vad har rapporterats tidigare.
För att avgöra huruvida den automatisera algoritmen krävs mindre tid att analysera data än manuell segmentering, registreras både erfarna och oerfarna användaren tiden behövs att kvantifiera en 10-image träning inställd (kompletterande fil S5). Tabell 1 visar att erfarna och oerfarna användaren minskade analys tid av 4,7 - och 8.3 - faldigt respektive med automatiserad algoritm i förhållande till den manuella segmentering strategin, med ungefärligt 43-fold ökning av rumsliga upplösning längs perinexus.
Algoritm för felsökning. Det vanligaste felet när du kör algoritmen som uppstår när slutliga mittlinjen inte slutar vid kanten av bilden. I sådana fall valdes inte tillräckligt med Poäng från rumsliga härledda karta, orsakar programmet misslyckas och producera ett felmeddelande som råd till användaren att välja en större beskärningsområdet eller öka rumsliga härledda tröskelvärdet. Rita en större beskärningsrutan kommer att förbättra tillförlitligheten hos programmet i vissa fall när rumsliga härledda ändras drastiskt nära kanterna på den siffran, som kan störa de pathfinding eller edge detekteringsalgoritmer.
Det är också möjligt för pathfinding algoritmen att misslyckas att korrekt identifiera mittlinjen, även om mittlinjen når kanten av bilden, särskilt om lutning tröskelvärdet är för lågt (figur 2A). Om övertoning tröskelvärdet är för högt inställd, kommer det att finnas fler onödiga punkter införlivas den pathfinding algoritmen (figur 2B), minskar computational effektivitet. Om användaren är inte att bestämma en lämplig tröskel, arrayen bilden ”GMag” (figur 2C), som genereras av programmet och kan hittas i arbetsytan kan hjälp användaren bestämma tröskelvärdet. Hitta punkter längs mittlinjen och ange tröskelvärde något över deras Index-värde för att säkerställa dessa punkter väljs. I det givna exemplet vore en lämplig tröskel ovanför ~5.1 (figur 2C, infoga).
Startpunkten kan också misslyckas att nå i början av perinexus (figur 2D). I det här fallet kör programmet igen och värdet Manuell Start till 1. Efter mittlinjen har isolerats, användaren väljer en punkt utanför perinexus och den mittlinje punkten närmast den valda pixeln (figur 2E, Röda torget) ställs som startpunkt. Resultatet är full mittlinjen (figur 2F).
Figur 1 : TEM bilder med kvantifiering processer. Manuell segmentering processen (A) kräver att användaren utför 12 individuella intermembrane mätningar samtidigt uppskatta mittlinjen. Den automatiska processen (B) kräver en manuell, kontinuerlig spårning av konturerna av perinexus. Den röda punkten i varje bild representerar användare identifierade slutet av GJ och början av perinexus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Mittlinjen felsökning. Två primära lägen av misslyckande för mittlinjen identifiering och deras lösningar: varje bild är märkt med namnet array i Matlab. Om tröskelvärdet lutning är för låg (A, tröskel 0,2) mittlinjen algoritmen kan misslyckas. Ställa in tröskelvärdet för hög (B, tröskel 70) kan minska computational effektiviteten av pathfinding algoritmen. En lämplig lutning tröskel kan bestämmas från GMag array (C, infoga). Om mittlinjen misslyckas att nå början kanten av perinexus (D), kan användaren opt för att manuellt välja startpunkten. Efter den ”börja peka” alternativet har angetts till 1 i öppningen GUI, användaren sedan väljer en punkt utanför perinexus av intresse (E). Slutresultatet bör vara en mittlinje som korrekt skildrar helheten av perinexus (F). Alla etiketter i offerter (A-F) motsvarar variabelnamn i Matlab. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Perinexus urval. Att beskära perinexus, klicka-och-håll att dra en ruta runt det (beskärningsverktyget väljs automatiskt) som framgår av den blå pilen. Denna box kan justeras med hjälp av kvadraterna på sidorna och hörnen gör den större eller mindre. Den gröna pilen visar slutet av den perinexus, som användaren ska säkerställa förblir ”öppna”. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Seriell bild utspädningar. Binärt dispositionen är upprepade gånger vidgade en bildpunkt i taget (A-D) och lagt till arbetande bilden (icke-binär form av bilden, E-H) efter varje dilatation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: mittlinjen isolering och pathfinding. En rumslig derivat beräknas från den slutliga arbetande bilden (A) och omfattningen av denna rumsliga derivat (B) används för att isolera disposition och mittlinjen (vita pilar). En användardefinierad tröskel identifierar dispositionen och mittlinjen och subtrahera den ursprungliga dispositionen ger mittlinjen (D). Men luckor visas i mittlinjen till följd av tröskeln (D - infoga). För att producera en fortlöpande mittlinjen, utförs en sekundär dilatation på isolerade mittlinjen (E), följt av en sekundär erosion att öka computational effektiviteten i en efterföljande pathfinding algoritm. Denna eroderad bild (F) kombineras sedan med den slutliga arbetande bilden, möjliggör identifiering av en kontinuerlig, ett pixel tjockt mittlinjen (G - Infoga). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Sista datapresentation. Programmet utgångar slutliga dispositionen ovanpå den ursprungliga TEM bilden (A). Linjen är färgkodade grön för 0-150 nm, blå för användardefinierade regionen intresse och röd för området bortom 150 nm. Dessutom, utgångar programmet ett likaså färgkodade diagram som representerar Wp som en funktion av avståndet från början av perinexus och för regionen av intresse (B), samt den genomsnittliga Wp (infälld i respektive diagram). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Dilatation kernel form analys. Former för dilatation kärnor (A): stjärnan i mitten representerar de vidgade pixlarna. Vita boxar är pixlar påverkas av dilatation, i form av ett plus, X, box eller linje. Ett ungefärligt horisontella perinexus (B, topp, med en röd linje som visar 0°) var roteras medurs från 0 till 180° i steg om 10° och upprepade gånger vidgade använder olika kernel formerna (B, botten). Plus - och linje-formade kärnor ger liknande resultat, även om kärnan linje misslyckas på vissa riktlinjer, medan box - och X-formade kärnorna är ur fas av 45 °. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Bild orientering korrigering. Till rätta för inriktningen av bilden, genomsnittliga vinkeln på perinexus beräknas från positioner i de start - och end - points (A, vänster, början och slutet av svart linje). Inverterad tangens för ändringen i y-riktning (en, vänster, grön linje) dividerat med förändringen i x-riktning (en, vänster, röd linje) avkastningarna korrigering vinkeln, θ (en, vänster, gul). Målet är att korrigera genomsnittliga Wp -värde för att ge det minsta avståndet mellan kanterna, som om perinexus hade varit avbildas ungefär horisontellt (en, vänster nedan). Tillämpningen av korrektionsfaktorn beskrivs av ekvation 1 jämfördes manuellt Rotera alla 15 slumpmässigt utvalda bilder av den beräkna θ före analys. De korrigera värdena starkt korrelerade med roteras-image värden (R2 = 0.991, A, höger), som anger ekvation 1 är en giltig korrektionsfaktor för bildorientering. För att bekräfta korrektionsfaktorn är lämpligt, genererades två fantomer av perfekt parallella kanter med en känd sträcka mellan dem (B, vänster). Fantomen 1 och Phantom 2 har rumsliga upplösningar 2.833 bildpunkter / mm. och 71,6 pixlar/tum, respektive. Som framgår av den blå diamanter och röda fyrkanter i B, höger, beräknar algoritmen korrekt deras bredder över 180 grader av bildrotation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 : Algoritm reproducerbarhet. Både erfarna och oerfarna observatör med den automatiska processen med orientering bildkorrigering, och fann signifikanta skillnader mellan AF och nr-AF grupperna (A), överensstämmer med en tidigare studie, upptäcka en minsta skillnad på 2,6 nm. Dessutom varken observatör fann en signifikant skillnad i GJW (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Handbok | Automatiska | |
| Tid - Obs. 1 (s) | 205±11 | 44±14 |
| Tid - Obs. 2 (s) | 248±18 | 30±5 |
| Rumslig upplösning (mätningar/nm) | 0,08 | 3,45 |
Tabell 1: jämförelse av manuella och automatiska processer. Både observatörer krävs mindre tid per bild att spåra konturerna än för att utföra manuell segmentering processen för en 10-image utbildning. Dessutom den automatiska processen har en högre samplingsfrekvens, inspelning 3,45 mätningar per nm, jämfört med ett genomsnitt på 1 mätning varje 12,5 nm för den manuella processen. Träning inställd bilder kan hittas i kompletterande fil S5, tillsammans med konturer och mätningar som utförs av en erfaren användare.
Discussion
Algoritmen använder seriell bild utspädningar för att räkna antalet pixlar mellan två motsatta 2D kanter i en binär bild, som i detta fall är mellan membran avskiljandet av perinexus2,3,14. En rumslig derivat och en pathfinding algoritm används sedan för att isolera mittlinjen, följt av en sekundär dilatation och erosion sekvens att fylla luckorna i mittlinjen, liknar vad har gjorts innan15. Mittlinjen kombineras sedan med slutliga dilatation-räkna bilden representera perinexal bredd som en funktion av avståndet från början av kanten separation, i detta fall slutet av GJ och början av perinexus16.
Fyra primära parametrar är användardefinierade i en GUI i början av programmet:
- Gradient tröskel
- Skala
- Intresse utbud regionen
- Start punkt urvalsmetod (automatisk eller manuell)
Den vanligaste mekanismen av misslyckande för algoritmen är mittlinjen misslyckande att nå kanten av bilden, vilket är hur slutpunkten bestäms den pathfinding-algoritmen. För att åtgärda en sådan fråga, kan användaren öka lutningen tröskelvärdet beskrivs i steg 3.3.1, som kommer att orsaka att välja fler punkter ur den rumsliga härledda bild, vilket ökar beräkningstiden krävs av pathfinding algoritmen. Denna algoritm kräver därför en kompromiss mellan uträkningen hastighet och mittlinjen integritet. Det är viktigt att notera att så länge alla punkter i mittlinjen identifieras från rumsliga derivatan, tillsammans med en lämplig startpunkt, rumsliga härledda tröskelvärdet får ingen effekt på kanten separation mätning.
Bildriktning verkar påverka dilatation värden, eftersom kärnan vidgar i 90 graders steg, som kan införa ett fel om majoriteten av regionen av intresse är i vinkel 45° mot axlarna för dilatation matriser. Antalet dilatation kanske därför inte alltid en korrekt representation av utrymmet mellan kanterna. Denna begränsning har behandlats av en trigonometriska korrektionsfaktor, men kunde potentiellt ignoreras om alla bilder i en datamängd är inriktade på samma orientering. Dessutom bör försiktighet användas vid tolkningen av resultaten, eftersom det är möjligt att avsnitt plan inte är helt vinkelrät mot två membran. I figur 9Banvänder vi GJW som tyder på att våra perinexus bilder var i-plan. Ändå är det absolut nödvändigt att urvalsstorlekarna vara tillräckligt stora för snittning variationer mellan bilderna. Våra perinexal bredd mätningar bör dessutom inte tolkas för att återspegla i vivo utrymmen, men detta tillvägagångssätt används för att mäta genomsnittliga skillnader i perinexal bredd i förhållande till vissa ingripande eller sjukdom tillstånd.
Den nuvarande algoritmen kräver också ett manuellt spåra konturerna av kanterna som indata. Det är viktigt att notera att så länge skalan är korrekt inställd, rumslig upplösning har ingen effekt på algoritmens mätningar, vilket framgår av de olika resolutionerna av bilder i figur 6 och en ytterligare lågupplöst bild i kompletterande fil S6. Nästa steg i att förbättra algoritmen är att ta bort mänskligt ingripande från disposition generation tillsammans med ett verktyg som kan välja området av intresse. Dessa funktioner skulle sannolikt förbättra precisionen i mätningen och minska användaren bias.
Detta beräkningsmässigt effektiv algoritm ger en snabbare metod, som kräver cirka en femtedel av mantimmar, att kvantifiera perinexus utan påvisbara påföljd att reproducerbarhet jämfört med manuell segmentering processen. Dessutom manuell segmentering processen använder tredjeparts en mätning varje 15 nanometer för att kvantifiera perinexal bredd, vilket kan leda till under provtagning som membran separation av perinexus kan förändras avsevärt inom 15 nm intervallet. Automatiska programmet har däremot en rumslig upplösning som är lika med bildgivande modalitet, i detta fall 2.9 pixlar per nanometer längs längden av den perinexus, därför att leverera ett mer fint löst genomsnitt av perinexal bredd.
Medan tillämpningarna i fältet av hjärt strukturbiologi är lovande och spännande, är denna algoritm använder inte begränsade till TEM bilder. Alla fält som kräver en exakt, högupplösta mätning av två nästan parallella 2D kanter kan göra användning av denna algoritm. Algoritmen kan användas för att spåra allt från riverbank erosion och översvämning mönster från satellitbilder till kärlbildningsprocessen med brightfield eller fluorescerande mikroskopi. En av de mest lovande användningsmöjligheterna är inom kardiologi och mäta ejektionsfraktion (EF) med point-of-care hjärt ekokardiografi. För närvarande är standardteknik biplan metoden för diskar17, men en nyare algoritm, AutoEF, är för närvarande framkant EF-kvantifiera metod18,19. Biplan metod för diskar, kammaren i fråga spåras manuellt och kvantifieras med en modifierad Simpsons metod, whereby totala volym beräknas automatiskt av summeringen av staplade elliptiska diskar. Den största begränsningen med denna metod är att det kan bara returnera den total tvärsnittsarean på önskad avdelningen, med ingen lösning att identifiera specifika områden av intresse, och kräver också betydande mänskliga input och expertis. Den nya metoden, AutoEF, identifierar och beskriver kanten av ventrikeln med en 2D fläckar algoritm och sedan beräknar ventrikulära tvärsnittsarea. Denna process, har medan exakt och effektiv för att mäta brutto ventrikulära område, också en liknande inneboende begränsning att endast mäta total tvärsnittsarea. Denna primära nackdel begränsar kliniker diagnostik och behandling förmågor. Däremot den algoritm som presenteras i detta manuskript kan identifiera en mittlinjen och har en upplösning som motsvarar upplösningen av bildgivande modalitet att peka ut specifika regioner av intresse. Detta är viktigt eftersom ultraljud skannrar med mikrometer rumslig upplösning är kommersiellt tillgängliga20,21, vilket innebär att denna algoritm kunde upptäcka lokaliserade vägg rörelse avvikelser med upplösning av mikrometrar i stället för centimeter. Medan denna ansökan måste verifieras experimentellt, är det en av de mest lovande tillämpningarna av denna algoritm. I själva verket det kan enkelt kombineras med speckle spårning kapacitet av AutoEF eller manuell tracesna utnyttjas i manuell PLANIMETRI att ge högre upplösning information parallellt med konventionella EF data.
Så mångsidig och tillämpligt eftersom den nuvarande algoritmen är, den utvecklades för 2D-bilder. Dock avbildningstekniker fortsätter att förbättra, finns det en ökande efterfrågan på 3- och 4 D kvantifiering teknik. Nästa iteration av algoritmen är därför att anpassa samma tillvägagångssätt, seriellt dilating en binär bild, till en 3-dimensionella objekt, där automatiskt definiera en mittlinjen är för närvarande utöver funktionerna i nuvarande bildbehandlingsprogram. En sådan algoritm skulle ha brett program både kliniskt och experimentellt i fältet hjärt ensam, inklusive 3D hjärt ekokardiogram22,23, 3D elektronmikroskopi24,25, 26och 3D magnetisk resonanstomografi27,28,29.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Kathy Lowe på Virginia-Maryland College av Veterinary Medicin för beredning och färgning TEM prover.
Finansiering:
National Institutes of Health R01-HL102298
National Institutes of Health F31-HL140873-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Touchscreen Monitor | Dell | S2240T | Needs soft-tipped stylus |
| Desktop | Dell | Precision T1650 | 8GB RAM |
| Operating System | Microsoft | Windows 7 Enterprise | 64-bit OS |
| Program platform | Mathworks | Matlab R2015b | Program may be incompatible with newer/older versions of Matlab |
References
- Rhett, J. M., Gourdie, R. G. The perinexus: a new feature of Cx43 gap junction organization. Heart Rhythm. 9 (4), 619-623 (2012).
- Veeraraghavan, R., et al. Sodium channels in the Cx43 gap junction perinexus may constitute a cardiac ephapse: an experimental and modeling study. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).
- George, S. A., et al. Extracellular sodium dependence of the conduction velocity-calcium relationship: evidence of ephaptic self-attenuation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 310 (9), 1129-1139 (2016).
- Veeraraghavan, R., et al. Potassium channels in the Cx43 gap junction perinexus modulate ephaptic coupling: an experimental and modeling study. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2016).
- Rhett, J. M., et al. Cx43 associates with Na(v)1.5 in the cardiomyocyte perinexus. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 411-422 (2012).
- Raisch, T. B., et al. Intercalated Disc Extracellular Nanodomain Expansion in Patients with Atrial Fibrillation. Frontiers in Physiology. , (2018).
- Yan, J., et al. Novel methods of automated quantification of gap junction distribution and interstitial collagen quantity from animal and human atrial tissue sections. PLoS One. 9 (8), 104357 (2014).
- Papari, G., Petkov, N. Adaptive pseudo dilation for gestalt edge grouping and contour detection. IEEE Transactions on Image Processing. 17 (10), 1950-1962 (2008).
- Limprasert, W. PathFinding. , Available from: www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34966-pathfinding (2012).
- George, S. A., et al. Extracellular sodium and potassium levels modulate cardiac conduction in mice heterozygous null for the Connexin43 gene. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).
- Revel, J. P., Karnovsky, M. J. Hexagonal array of subunits in intercellular junctions of the mouse heart and liver. Journal of Cell Biology. 33 (3), 7-12 (1967).
- Huttner, I., Boutet, M., More, R. H.
- Makowski, L., et al. Gap junction structures. II. Analysis of the x-ray diffraction data. Journal of Cell Biology. 74 (2), 629-645 (1977).
- Entz, M., et al. Heart Rate and Extracellular Sodium and Potassium Modulation of Gap Junction Mediated Conduction in Guinea Pigs. Frontiers in Physiology. 7, 16 (2016).
- Sild, M., Chatelain, R. P., Ruthazer, E. S. Improved method for the quantification of motility in glia and other morphologically complex cells. Neural Plasticity. 2013, 853727 (2013).
- Rhett, J. M., et al. The perinexus: Sign-post on the path to a new model of cardiac conduction. Trends in Cardiovascular Medicine. , (2013).
- Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Journal of the American Society of Echocardiography. 28 (1), 1-39 (2015).
- Kawai, J., et al. Left ventricular volume and ejection fraction by the axius auto ejection fraction method: comparison with manual trace method and visual assessment of ejection fraction. Journal of Cardiology. 49 (3), 125-134 (2007).
- Frederiksen, C. A., et al. Clinical utility of semi-automated estimation of ejection fraction at the point-of-care. Heart, Lung and Vessels. 7 (3), 208-216 (2015).
- Foster, F. S., et al. A new ultrasound instrument for in vivo microimaging of mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 28 (9), 1165-1172 (2002).
- Moran, C. M., et al. A comparison of the imaging performance of high resolution ultrasound scanners for preclinical imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (3), 493-501 (2011).
- Papademetris, X., et al. Estimation of 3D left ventricular deformation from echocardiography. Medical Image Analysis. 5 (1), 17-28 (2001).
- Hosny, A., et al. Unlocking vendor-specific tags: Three-dimensional printing of echocardiographic data sets. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 155 (1), 143-145 (2018).
- Cretoiu, D., et al. Human cardiac telocytes: 3D imaging by FIB-SEM tomography. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2157-2164 (2014).
- Risi, C., et al. Ca(2+)-induced movement of tropomyosin on native cardiac thin filaments revealed by cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6782-6787 (2017).
- Dhindwal, S., et al. A cryo-EM-based model of phosphorylation- and FKBP12.6-mediated allosterism of the cardiac ryanodine receptor. Science Signaling. 10 (480), (2017).
- Reddy, V. Y., et al. Integration of cardiac magnetic resonance imaging with three-dimensional electroanatomic mapping to guide left ventricular catheter manipulation: feasibility in a porcine model of healed myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 44 (11), 2202-2213 (2004).
- van Heeswijk, R. B., et al. Three-Dimensional Self-Navigated T2 Mapping for the Detection of Acute Cellular Rejection After Orthotopic Heart Transplantation. Transplant Direct. 3 (4), 149 (2017).
- Valinoti, M., et al. 3D patient-specific models for left atrium characterization to support ablation in atrial fibrillation patients. Magnetic Resonance Imaging. 45, 51-57 (2018).
