Summary
検出、定量化およびアポトーシス サンプルから高純度にアポトーシス小体を分離する流れの cytometry または差動遠心分離を使用してワークフローを開発しました。
Abstract
アポトーシス小体 (ApoBDs) 機構の解明、エクソソーム細胞小胞族最大の型の一つである ApoBDs の主要メンバーであります。ApoBDs が細胞除去として人身売買生体分子を介して細胞間のコミュニケーションを助けることができることが提案されています。使用の識別と ApoBDs の分離従来多くの場合、正確な定量化と低いサンプル純度の欠如によって制限されます。ここでは、アポトーシスの誘導の確認、ApoBD 形成を検証および ApoBDs を高純度に分離するワークフローについて述べる。またアウトライン、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えと ApoBDs を分離に基づく差動遠心分離アプローチを比較します。使用して孤立した ApoBDs の純度を確認、さらに、以前の流れ cytometry による染色と分析法を確立します。まとめると、記述されているアプローチを使用して THP 1 単球のアポトーシスとアポトーシス細胞の分解は誘発され、検証と THP 1 球から生成された ApoBD は 97-99% の純度に分離されました。
Introduction
アポトーシス、プログラム細胞死のよく研究フォームは、生理的恒常性を維持し、人体1内で潜在的有害な細胞を除去する必要があります。アポトーシスの誘導後、アポトーシス細胞 (ApoCells) は一連の形態学的変化を受けるし、ApoBDs と呼ばれる小さな膜小胞に分解できます。全体的にみて、このプロセスはアポトーシス細胞分解として知られている、形態2,3に基づいて 3 段階に分けることができます。ステップ 1 (膜ブレブ) は、鉱物4,5として知られている細胞の表面に風船のような構造の形成によって特徴付けられます。ステップ 2 (アポトーシス突起形成) には、apoptopodia、apoptopodia ビーズと微小管結合スパイク6,7,8などの長い膜突起部の形成が含まれています。最後に、ステップ 3 (ApoBD 編成) にはアポトーシス突起および/または ApoBDs6,9を生成する ApoCells の断片化が含まれています。前の調査結果は、アポトーシス細胞のクリアランスを支援し、細胞間のコミュニケーションを仲介することで ApoBDs の役割を示唆しています。たとえば、ApoBDs に、ApoCell の断片化が小さい '' 作品を一口食2,10,11を囲むことによって簡単に削除することができますを生成可能性があります提案します。さらに、ApoBDs は、DNA、RNA および蛋白質は、細胞間コミュニケーション12,13,14を容易にする周囲の細胞に取り引きされる可能性がありますなどの生体分子のシリーズを抱く可能性があります。これらのプロセスを調べる機能的、アポトーシス誘導および ApoBD の形成の検証 (i)、ApoBDs の分離 (ii) と (iii) ApoBD 純度の確認を含む 3 つの重要なパラメーターを確認する重要です。
以前は、アポトーシスと ApoBDs15,16,17,18の勉強をフローサイトメトリーと電子顕微鏡を含むメソッドの数が使用されています。しかし、ApoBD の検出と定量、しばしば困難または見落とさ。例えば、最も日常的に使用される流れのフローサイトメトリーによるアポトーシス アッセイ アネキシン V を採用 (A5、外部結合タンパク質 'を食べる-私' 信号ホスファチジルセリン (PtdSer)) 核酸染色 propidium ヨウ化 (PI)19。しかし、この普遍的な染色の組み合わせを使用して、解析では、のみ 3 種類のサンプルで (実行可能なセル、ApoCells と壊死細胞) 細胞のサブセットがあること想定しています。さらに、cytometry 流れの試金の apoptosis のため多くの研究者によって「ゴールド スタンダード」として考慮される、しかし、以降のデータ解析はしばしば FSC/SSC中間高イベントの選択最初のゲーティング ステップを通じて ApoBDs を除外します。したがって、A5 とする PRO 3 を使用して新規流れ cytometry 試金を最近開発した、7、20チャンネルは別の核酸染色カスパーゼ 3/7 活性化パネキシン 1 (PANX1) によって選択的に取ることができます。カスパーゼ 3 による PANX1 活性化はアポトーシスの早い段階での PtdSer 露出を前に、ようにプロ 3 は特異的アポトーシスとネクローシス細胞を汚れ。このアプローチ戦略をゲートの小説と組み合わせてさらに、データ分析中に取得しているすべてのイベントが含まれています、6 セル/パーティクルのサブセットの識別結果としてを含む: (i) 実行可能なセル (FSC/SSC中級/高、A5低にプロ 3低)、(ii) A5-初期の ApoCells (FSC/SSC中級/高A5低、中間にプロ 3)、(iii) A5+ ApoCells (FSC/SSC中級/高、A5高にプロ 3 の中間)、(iv) 壊死細胞または後期 ApoCells (FSC/SSC中級/高A5高にプロ 3高)、(v) ApoBDs (FSC/SSC低、A5中間に-プロ-3低中間/)、および (vi) 破片 (FSC/SSC低A5低、低にプロ 3)20。我々 のアプローチでは、すべてのセル/パーティクルのサブセットと、もっと重要なは、細胞および破片20からの ApoBDs の分離分析の重要性を強調しています。したがって、このアプローチは、アポトーシスおよび ApoBD の形成の誘導を同時に検証する効率的な方法を示します。
伝統的に、ApoBDs は、さまざまな細胞や密度に基づく他の細胞小胞から ApoBDs を分離できるという差動遠心分離アプローチを通じて分離されています。しかし、このようなの遠心分離法はしばしば低 ApoBD 純度、定量ステップ サンプル純度および/または細胞型特異 ApoBDs17,21,22を分離することができないことを確認するための不足によって制限されます。そこで、最近 2 つのアプローチ、FACS に基づいた新しい差動遠心分離に基づくアプローチをアポトーシスとサンプルの純度のための23の誘導を検証する私たち以前に確立された流れフローサイトメトリー法と結合することができますを開発しました。FACS 手法による ApoBD 分離を最大 99% 純度 ApoBDs を豊かにすることができます、さまざまな混合細胞集団、組織サンプルと体液23から ApoBDs を分離する細胞型特異抗体と組み合わせて利用できます。さらに、我々 の改訂された差動遠心分離アプローチを示しますに ApoBDs を分離するための効率的な方法 > 90% 純度23。
本稿で我々 はアポトーシス誘導を検証し検出し、定量化の ApoBD 形成私たちの実験の詳細について説明します。FACS ベースおよび差動遠心分離ベースのメソッドを使用して ApoBD 分離ワークフローはまた詳述し、比較しました。代表的なデータ記述の方法論では、将来の ApoBD 研究の効果的な最先端のツールをデモンストレーションします。
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Protocol
1. アポトーシスの誘導
- 5 分間 300 x g でセルのサンプルを遠心し、任意の既存の細胞の残骸を削除する上澄みを廃棄します。
注: 付着性のセルを使用して、事前に細胞を播くし、アポトーシス誘導前にリン酸緩衝液 (PBS) × 1 で洗います。 - セルの数を決定し、細胞を収集します。
注: 測定後分離に応じてお勧めします少なくとも 1 x 10 の開始セル番号7セル。 - 1 x 106セル/mL の最終的な集中の完全なメディア (50 μ G/ml ストレプトマイシンの混合物、50 IU/mL ペニシリン (巻/巻) 10% 牛胎児血清を含むそれぞれの媒体) に再懸濁します。
- 分注 ~ 6 ウェル プレートのウェルあたり 10 の6セル × 2。
- アポトーシスを誘導して、板蓋を取り外して 150 mJ/cm2の紫外線照射器を使用して細胞を照射します。これは、約 30-60 秒を取る必要があります。
注: 照射前に '非導入' セル コントロール ~0.5 x 106セルが保存されることを確認します。
注: 抗 Fas または血清飢餓6など他の方法を介してアポトーシスを誘導もことができます。 - 37 ° c、5% CO2セル行に応じて、2-8 時間孵化させなさい。
- ベンチ トップ光学顕微鏡を使用して、ブレブ、apoptopodia と ApoBD 層などのアポトーシスの形態の存在を確認する細胞を可視化します。
注: 40 倍の倍率は、十分です - P1000 ピペットを使用して、ピペットし、アポトーシスのサンプルを収集します。
- 1x PBS で洗浄して最大収量を確保するため残りのサンプルと組み合わせます。
- 収集 ~1/10th '全体アポトーシス サンプル' (WAS) を制御します。
- 「未処理」サンプルを収集します。
- 6 分間 3,000 x g で WAS と非導入の両方のサンプルを遠心します。
- 1 mL の 1x PBS に再懸濁します、氷の脇します。
- ApoBD 分離、ステップ 2 または残りのアポトーシス サンプル 3 のいずれかに進みます。
2 FACS による ApoBD 分離
- 6 分間 3,000 x g で全体のサンプルを遠心します。
- ペレットを中断させることがなく上澄みの大半を削除します。
- A5-FITC の 75 μ L と 1 x 10 の7セルあたり 2 μ L に PRO 3 の 1 の x A5 結合バッファーの 1 つの mL を含む染色液で再懸濁します。
- 10 分間室温で暗闇の中でサンプルをインキュベートします。
- 1 x A5 結合バッファーの 1-2 の mL を追加し、余分な汚れを削除する 6 分間 3,000 x g でサンプルを遠心分離します。
注: 混合細胞または組織サンプルは、1 x A5 結合バッファーで細胞型-特異的マーカーの組み合わせを使用して、ステップを汚す抗体を実行し、6 3,000 × g で遠心分離前に氷上 20 分 (または製造元のプロトコルに従って) 孵化させなさい分。 - 3 mL の FACS バッファーでサンプル ペレットを再懸濁します (1 × PBS、1 x A5 結合バッファー 10 %fsc、2 ミリメートルの EDTA) 1 x 10 の7セルあたり。
- 丸底、ポリプロピレン (フローサイトメトリー) 管に 70 μ m セル ストレーナー フィルターし、暗闇の中、氷の上のサンプルを保ちます。
- FACS マシンをオンにし、100 μ m ノズルを使用して標準的なセットを実行、ドロップ遅延実行、安定したストリームを確保します。
- サンプルをロードし、集録速度を 〜 1000 イベント/秒に設定します。
- FSC、SSC、APC (に-プロ-3)、FITC (A5) 電圧を調整し、集団を明確に分離することができますように FACS プロット内のイベントの位置します。
- 20,000 イベントを記録します。
- パート 4 のようにゲート戦略を設定します。
- 並べ替えレイアウト目的の並べ替えの人口として最後の ApoBD ゲートを追加します。
- サンプルを集録を開始し、〜 250 μ L FACS バッファーを含む新しいチューブに 5,000-10,000 の ApoBDs を集めることによってテストの並べ替えを実行します。
- バック フラッシュ システムを実行し、並べ替えられた ApoBDs をロードします。
- 取得し、テストの一種 ApoBDs を記録します。
- ApoBD 純度が FSC (y 軸) vs A5 を比較することにより 〜 99% をあることを確認 (x 軸イベント)。
注: が A5 染色再レーザー漂白のためのサンプルを分析する際にわずかに減らすことができます。 - 高純度を達成すると、一度元のサンプルをロードし、ApoBDs の希望の番号を取得するまでの並べ替えを続行します。
注: 必要に応じて、デュアル並べ替え実行できます ApoCells と ApoBDs を同時に分離します。
注意: ソートは長い期間にわたって、お勧め 4 ° C でコレクションの管をインキュベート - 並べ替えが完了したら、ApoCells、非導入と WAS アポトーシスを検証し、並べ替え後の純度を確認後並べ替え並べ替え後 ApoBDs の小さな部分を収集します。
注: テストの並べ替え、並べ替え後の純度が大きく違いはありませんが、これはストリームの設定と安定性に基づいています。
3 差動遠心分離による ApoBD 分離
- 10 分間 300 x g で残りのアポトーシスのサンプルを遠心します。
- 細胞ペレットを中断することを避けるために 〜 500 μ L を残して上清を収集し、新しい 15 mL の円錐管に追加します。
- 残り 500 μ L を削除し、2 mL の 1x PBS (これは 'ApoCell 濃縮率' を表しますで細胞ペレットを再懸濁します。
- 3,000 gで 20 分間収集した上清を遠心します。
- ペレットを確認し、(小さな細胞の小胞エクソソーム機構の解明研究などを含む上清) 上清を慎重に取り外します。
- 1 mL の 1x PBS (これは 'ApoBD 濃縮' 分数を表します) でペレットを再懸濁します
- 各実行可能な ApoCell 濃縮 WAS 新しい丸底、ポリスチレン (フローサイトメトリー) チューブの ApoBD 濃縮試料 100 μ L を収集します。
- 2 x A5 結合バッファー、1: 100、A5 FITC や縮尺に PRO 3 を含む汚れの 100 μ L を追加します。
- 暗闇の中で 10 分間室温でインキュベートします。
- 成功したアポトーシス誘導と ApoBD 濃縮率の純度検証上記ゲートの戦略を使用して、フローサイトメトリーによるサンプルを分析します。
4. フローサイトメトリー戦略をゲート
- プロットに-プロ-3 (y 軸) に対して FSC (x 軸) すべての他の非グリセリン イベント (に-プロ-3低/中級) から壊死細胞 (に-プロ-3高) を分離します。
- グリセリン以外のすべてのイベントを選択し、A5 から SSC をプロットします。ゲート 1 (P1)、SSC中級/高A5低/中間細胞の人口と人口 2 (P2)、他のすべてのイベントを含む 2 つの集団。
- P2 に-プロ-3 A5 に対してプロットし、すべて細胞の残骸を除外する A5中級/高イベントを選択します。
- A5 のすべての肯定的なイベントを選択し、A5 に対して FSC をプロットします。ApoCells (FSC中級/高) から ApoBDs (FSC低) を分離します。
注: ApoBDs FACS に基づくアプローチによる ApoBD 分離のため、ゲートお勧めします最後のステップを ApoBDs に-プロ-3 A5 に比較してすべてのイベントを選択して。これにより、最終的な並べ替えゲートが FSC/SSC パラメーターではなく蛍光を使用すること。 - 生細胞分析の P1 を選択し、ゲートの 2 つの方法のいずれかを実行します。一般生菌分析 A5 に対して FSC をプロットし、従って残りの細胞の残骸の取り外し、FSC中級/高のすべてのセルを選択します。また、詳細な分析を実行可能なセルから分離できる A5-に-プロ-3 に対して FSC をプロットすることによって初期の ApoCells。FSC中級/高実行可能なセルを選択する-プロ-3低にプロ 3中間FSC中級/高A5-初期の ApoCells。
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Representative Results
ここで説明する手順を使用して、THP 1 単球のアポトーシスが誘導されたと ApoBDs が検出および FACS ベースまたは差動遠心分離アプローチ (図 1) のどちらか経由で分離されました。まず、紫外線照射によるアポトーシス誘導し、細胞アポトーシスの形態、ブレブ、アポトーシス膜突出部形成 ApoBDs6の生成などを展示したとき 2-3 時間後採取しました。プロ 3 と A5 ベースのフロー フローサイトメトリー法は、生菌、壊死細胞、初期 ApoCells、ApoCells、ApoBDs および残骸 (図 2) を分離することによって ApoBD の形成と単球のアポトーシスの誘導を確認する使用されました。フローサイトメトリー解析一緒に取られて、紫外線治療が ~ 20% の結果を示される ApoCells (図 3)。
THP 1 球 ApoBDs 当時の 2 つのアプローチを介して WAS から分離されました。まず、サンプルは高純度のみ 1 つの遠心分離のステップが汚れる前に全体のアポトーシス サンプルをペレット必要 FACS に基づくのために準備された、FACS。このメソッドは、高いサンプル純度が (たとえば、qPCR 分析) 必要な大幅場合、ApoBDs の特定の数が、必要な場合または複雑なサンプルから型固有 ApoBDs ときセルの取得機能の試金の適切なです。この方法論を使用して、ApoBDs ~ 99% 純度 (図 4) に隔離されました。
次に、THP 1 球 ApoBDs も分離された 2 段階、差動遠心分離アプローチを介して。最初のステップには、実行可能なセル、ApoCells と壊死細胞の分離が含まれています。2 番目のステップはより大きい ApoBDs の機構の解明など小さな細胞小胞からの分離、エクソソームは、g. フローサイトメトリー x 3,000 でペレットことができないがアポトーシス誘導と ApoBD サンプル純度確認を行ったと~ 97% を含む ApoBD 濃縮サンプルを示した ApoBDs (図 4)。これは ApoBD を比較的高純度に分離するための迅速かつ効果的な手法を提案する、単一の細胞型を含む試料から ApoBDs を浄化する場合に適しています。
図 1.どちらか FACS ベースまたは差動遠心分離アプローチによる ApoBD 分離の模式図.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.フローサイトメトリー戦略をゲーティングします。6 セル/パーティクルのサブセット (実行可能なセル、A5 を含む-初期 ApoCells、A5+ ApoCells、壊死細胞、ApoBDs および残骸) が識別され、FACS に基づく分離の ApoBD を選択するために使用します。(a) 膜スキンド細胞は非スキンド イベントから分離されます。(b) A5低中級SSC低高細胞は A5低高イベントから分離されます。(b.i) にプロ 3中間A5 から深さ方向分析に POR 3低実行可能なセルを分けることができますの-初期の ApoCells。(アブロ) または、単に ApoBD の純度を計算するとき、実行可能なセルを FSC低イベントから分けることができます。(c) A5低破片が除外されます。(d) FSC中級/高ApoCells は、FSC低ApoBDs から分離されます。(e) すべて A5-PRO 3中級/高ApoBDs ソートされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.THP 1 単球のアポトーシスの検証します。実行可能なセル、A5 のレベルを決定する未処理または UV 照射の THP 1 球の流れフローサイトメトリー解析を行った-初期 ApoCells、A5+ ApoCells と壊死細胞。
図 4.THP 1 の精製モノサイト ApoBDs.分離 THP 1 単球由来 ApoBDs いずれか FACS ベースまたは差動遠心分離のベースのアプローチでは、経由で実行可能な細胞、ApoCells と壊死細胞から ApoBDs の濃縮を示すに流れフローサイトメトリー解析を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
1950 年代の初期、説明文からアポトーシスのフィールドは著しく、進んでいる、著名な研究領域になります。広範な努力および広範な関心にもかかわらず特定の ApoBDs の形成におけるアポトーシスの特定の側面がよく研究されていない適切な方法論の不足のため。特にアポトーシスの進行と同時に従来のフローサイトメトリー A5/PI 解析、ApoBD 分離の不純物を使用して ApoBD 形成を追跡の制限が含まれます。これらの方法論の欠点に対処する方法を最近開発しました。
我々 の新しい流れ cytometry ベース解析的アプローチでは、ApoBDs を検出する従来の分析方法を使用して多くの場合無視され、20を定量化することができます。さらに、この変更したがってアポトーシス進行20の良い描写をレンダリング、流れ cytometry 法、染色に-プロ-3、明らかに追加の A5 を使って-初期アポトーシスの段階です。従来、ApoBD 検出が重く頼った共焦点顕微鏡と組織などのイメージ ベースの手法が私たちフローサイトメトリー法 ApoBD 形成を量的にスループットの高いアプローチを提供します。一見複雑な手順は比較的簡単、市販試薬と基本的な流れの cytometer のみ必要です。論理の検出と ApoBDs の正確な定量化、さらにアポトーシス細胞の微小環境の知識を指示細胞のクリアランスと免疫学的反応。実際には、細胞小器官に固有の汚れに記載フローサイトメトリー法を結合することによって、我々 は最近 ApoBDs24細胞内容の不均質分布を報告しています。ApoBDs は異なるサブセットに分類でき、各 ApoBD のサブセットは、さまざまな機能を示すことがありますが示唆されました。
隔離技法には、最近開発された ApoBD 細胞小胞の分野の進歩にも貢献します。従来、ApoBD の分離に使用される差動遠心分離方法は下流機能アッセイに影響を与える可能性がありますより小さい細胞のかなりの量を含めることができます。ただし、純度 97% に ApoBDs を分離するの変更された差動遠心分離アプローチを使用できます。差動遠心分離で高純度を実現できるが、このような方法に複雑なサンプルから ApoBDs を分離することが適さない場合があります。対照的に、FACS 法は 99% 純度に ApoBDs を豊かにすることができ、粒子サイズ、粒度と粒子の密度だけに頼るのではなく、PtdSer の露出を含む ApoBDs のユニークな生物学的特性に基づいています。この方法では、同時に識別し、細胞型-特異的マーカー24を使用して別の細胞起源の ApoBDs を分離する可能性もあります。正確な ApoBD の単離とその後下流解析 ApoBDs 必要なの量に応じて 1-8 h を取ることができる長い FACS プロシージャ、にもかかわらず分子特性の直接帰属と ApoBDs の機能的役割を許可するでしょう。このような手法のため、ApoBD 分離アプローチに結合されているフローサイトメトリーなどの手法で (ここで説明した)、両方のアポトーシスの誘導と ApoBD 濃縮試料の純度検証が重要です。さらに、適切な FACS を設定は、低純度で不安定なストリームまたは不適切に実行されるドロップ遅延可能性があります、FACS に基づいたアプローチによる ApoBD 分離に不可欠です。
総称して、我々 は、アポトーシス誘導、ApoBD 検出および高純度 ApoBDs の分離を定量化するための最先端の方法論を概説しました。我々 のアプローチは、アポトーシス細胞分解プロセスを研究し、病気の設定で、このプロセスの役割を明らかに新しいツールを提供可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
I.K.H.P. に国立保健医学研究評議会 (GNT1125033 ・ GNT1140187) とオーストラリアの研究評議会 (DP170103790) からの助成金によって支えられた仕事
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | - | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | - | - | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | - | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | - | - | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | - | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | - | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | - | |
| FlowJo 8.8.6 software | - | - | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | - |
References
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