Summary
교류 cytometry 또는 차등 원심 분리를 사용 하 여 워크플로 검색, 계량 및 apoptotic 시체는 apoptotic 샘플 고 순도 분리 개발 된다.
Abstract
Apoptotic 시체 (ApoBDs), microvesicles 및 exosomes ApoBDs 가장 큰 종류 중 하나 되 고 함께 세포 외 기 가족의 주요 회원입니다. 그것은 ApoBDs 밀매 생체 세포 통신으로 셀 정리 도움이 될 수 있습니다 제안 되었습니다. 식별 및 ApoBDs의 격리에 사용 하는 기존의 접근은 종종 정확한 정량화 및 낮은 샘플 순도의 부족에 의해 제한 됩니다. 여기, 우리는 apoptosis 유도 확인 하 고, ApoBD 형성, 검증 순도를 ApoBDs를 분리 하는 워크플로 설명 합니다. 우리 또한 약술 하 고 형광 활성화 된 세포 (FACS) 정렬 및 ApoBDs을 기반으로 하는 차등 원심 분리 접근 비교 것입니다. 또한, 고립 된 ApoBDs의 순도 확인 될 것 이다 사용 하는 이전 교류 cytometry 기반 얼룩이 지 고 분석 방법 확립. 기술된 접근을 사용 하 여 함께 찍은 THP 1 monocyte apoptosis와 apoptotic 세포 분해 했다 유도 검증, 그리고 THP 1 monocytes에서 생성 된 ApoBD 97-99%의 순수성에 고립 되었다.
Introduction
Apoptosis, 프로그램 된 세포 죽음의 잘 공부 형태를 생리 적 항상성 유지 하 고 인체1내에서 잠재적으로 유해한 세포를 제거 해야 합니다. Apoptosis 유도 후 apoptotic 세포 (ApoCells) 일련의 형태학 적 변화를 받아야 하 고 ApoBDs 되 나 작은 막 도약 vesicles로 분해 수 있습니다. 전반적으로,이 과정 apoptotic 세포 분해로 알려져 있으며 형태2,3에 따라 3 가지 단계로 나눌 수 있습니다. 단계 1 (플라즈마 멤브레인 blebbing) 풍선 모양의 구조 blebs4,5로 알려진 세포 표면에 형성 특징 이다. 단계 2 (apoptotic 돌출 형성) apoptopodia, 파란색 apoptopodia 및 microtubule 스파이크6,,78등 긴 막 돌출의 형성을 포함합니다. 마지막으로, 3 단계 (ApoBD 형성) apoptotic 돌출 ApoBDs6,9를 생성 하는 ApoCells의 파편을 포함 한다. 이전 연구 결과 apoptotic 세포 클리어런스를 방 조 하 고 세포 통신을 중재에 ApoBDs의 역할을 제안 했다. 예를 들어 ApoBDs에는 ApoCell의 분열 식 세포2,10,11을 둘러싼에 의해 쉽게 제거 될 수 있는 작은 ' 입 크기 ' 조각 생성 수는 제안 합니다. 또한, ApoBDs DNA, RNA 및 단백질, 셀 통신12,,1314를 촉진 하기 위하여 주변 셀에는 인신 매매 수 등 생체의 일련을 항구 수 있습니다. 기능적으로이 프로세스를 조사, apoptosis 유도 및 ApoBD 형성의 유효성 검사 (i), (ii) ApoBDs, 절연 및 (iii) ApoBD 순수성의 확인을 포함 하 여 세 가지 주요 매개 변수를 확인 하는 생명 이다.
이전에, cytometry 등 전자 현미경 검사 법 방법의 수 ApoBDs15,16,,1718apoptosis를 공부 하 고 사용 되었습니다. 그러나, ApoBD 검출 및 정량화는 종종 어려운 또는 간과. 가장 일상적으로 사용 되는 흐름 cytometry 기반 apoptosis 고용 annexin V를 시험 하는 예를 들어, (A5, 단백질은 외부화는 ' 먹고-나 ' 신호 phosphatidylserine (PtdSer))과 핵 산 얼룩 propidium 요오드 화물 (PI)19. 그러나,이 범용 얼룩 조합을 사용 하 여 분석 가정 샘플에서 셀 하위 (가능한 셀, ApoCells 및 회 저 성 세포)의 3 종류가 있습니다. 또한, 비록 apoptosis에 대 한 많은 연구자에 의해 "금 표준"으로 간주, cytometry 분석 실험 및 후속 데이터 분석은 종종 FSC/SSC중간-높 은 이벤트를 선택 하는 초기 제어 단계를 통해 ApoBDs을 제외. 따라서, 우리는 최근에 a 5와 TO-프로-3를 사용 하 여 새로운 흐름 cytometry 분석 결과 개발, caspase 3/7-활성화 pannexin 1 (PANX1)에 의해 선택적으로 촬영 될 수 있는 또 다른 핵 얼룩 채널7,20. Caspase 3 유도 PANX1 활성화 apoptosis의 초기 단계에서 PtdSer 노출 앞로 TO-프로-3 차동 apoptotic 및 회 저 성 세포를 얼룩. 또한, 전략 게이팅 우리의 소설과 결합 된이 접근 데이터 분석 중 모든 획득된 이벤트를 포함 하 고 그 결과, 6 셀/입자 하위 집합 식별 됩니다, 포함 하 여: (i) 가능한 셀 (FSC/SSC중간/높은, A5낮은 , TO-프로-3낮은), (ii) A5- 초기 ApoCells (FSC/SSC중간/높은, A5낮은,중간에-프로-3), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSC중간/높은, A5높은 ,중간에-프로-3), (iv) 회 저 성 세포 또는 늦은 ApoCells (FSC/SSC중간/높은 A5높은,높은TO-프로-3), (v) ApoBDs (FSC/SSC낮은, A5중간, TO-프로-3낮은 중간 /), 그리고 (vi) 파편 (FSC/SSC낮은,낮은A5, TO-프로-3낮은)20. 우리의 접근 방식은 모든 셀/입자 하위 집합 및, 더 중요 한 것은, 세포와 파편20에서 ApoBDs의 분리 분석의 중요성을 강조 한다. 따라서,이 방법은 apoptosis와 ApoBD 형성의 유도 동시에 확인 하는 효율적인 기법을 보여 줍니다.
전통적으로, ApoBDs는 ApoBDs 셀 또는 밀도에 따라 다른 세포 외 소포에서 분리 될 수 있다 그것에 의하여 차별 원심 분리 방식의 다양 한 격리 되었습니다. 그러나, 이러한 원심 분리 방법은 종종 낮은 ApoBD 순수성, 샘플 순도 및 셀 형식 관련 ApoBDs17,,2122분리를 확인 정량화 단계의 부족에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리 최근 두 가지 방법, FACS 기반 및 새로운 차등 원심 분리-기반 접근 apoptosis와 샘플 순도23의 유도 확인 하기 위해 우리의 이전 설립된 흐름 cytometry 방법으로 결합 될 수 있는 개발. FACS 기반 접근을 통해 ApoBD 절연 99% 순도, 최대 ApoBDs을 풍요롭게 수 있습니다 하 고 혼합된 셀 인구, 조직 샘플 및 체액23에서 ApoBDs을 셀 유형 특정 항 체의 다양 한 결합 될 수 있다. 또한, 우리의 개정된 차등 원심 분리 방식을 보여줍니다 ApoBDs를 분리 하는 효율적인 방법 > 90% 순도23.
이 종이, 우리가 자세히 설명 apoptosis 유도, 유효성을 검사 하 고 검색 하 고 ApoBD 형성 계량 우리의 실험 절차. FACS 기반 및 차등 원심 기반 방법을 사용 하 여 ApoBD 절연 워크플로 또한 정교 하 고 비교. 대표적인 데이터 설명된 방법론 미래 ApoBD 연구에 대 한 효과적인 첨단 도구를 제공 합니다 보여줍니다.
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Protocol
1입니다. Apoptosis 유도
- 5 분 및 모든 기존의 세포 파편을 제거 하려면 삭제 상쾌한 300 x g에서 원심 분리기 셀 샘플.
참고: 부착 셀을 사용 하는 경우 사전에 셀 씨 고 apoptosis 유도 전에 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS) x 1 씻어. - 휴대폰 번호를 확인 하 고 세포를 수집 합니다.
참고: 분석 결과 후 절연에 따라 좋습니다 적어도 1 x 10의 시작 셀 번호7 셀을. - 1 x 106 셀/mL의 최종 농도 대 한 완전 한 미디어 (10% (vol/vol) 태아 송아지 혈 청, 50 IU/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스 혼합물을 포함 하는 각 매체)에서 resuspend.
- Aliquot ~ 106 셀 6 잘 플레이트의 당 x 2.
- Apoptosis를 유도 하는 접시 뚜껑을 제거 하 고 150 mJ/cm2 UV irradiator를 사용 하 여 셀을 비추는. 이 약 30-60 s를 취해야 한다.
참고: 이전에 방사선,6 셀 ~0.5 x 10 'Untreated' 셀 컨트롤에 대 한 유지 됩니다 확인 합니다.
참고: Apoptosis 또한 안티 Fas 또는 혈 청 기아6등 다른 방법을 통해 유도 될 수 있다. - 37 ° C, 5% CO2 셀 라인에 따라 2-8 시간 동안에 품 어.
- 벤치 가기 가벼운 현미경을 사용 하 여, 시각화 apoptotic 형태학, blebbing, apoptopodia 형성, ApoBD 형성 등의 존재를 확인 하는 세포.
참고: 40 X 확대는 충분 한 - P1000 피 펫을 사용 하 여, 플라스틱 및 apoptotic 샘플을 수집 합니다.
- 1 x PBS 가진 접시를 세척 하 고 나머지 샘플 최대 수확량을 위해 결합.
- 수집 ~1/10th '전체 Apoptotic 샘플' (WAS)를 제어 합니다.
- '치료' 샘플을 수집 합니다.
- 3000 x g 6 분에 WAS 및 Untreated 샘플 원심
- 1 x PBS의 1 mL에 resuspend 하 고 얼음에 따로.
- ApoBD 절연, 어느 2 또는 3 단계 나머지 apoptotic 샘플 계속.
2. ApoBD FACS 통해 격리
- 3000 x g 6 분에 전체 샘플 원심
- 펠 릿을 중단 하지 않고는 상쾌한의 대부분을 제거 합니다.
- 1 x A5 바인딩 버퍼, A5 FITC의 75 µ L 당 1 x 107 셀에-프로-3의 2 µ L의 1 mL를 포함 하는 얼룩 솔루션에서 resuspend.
- 10 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 샘플을 품 어.
- 1 x A5 바인딩 버퍼의 1-2 mL을 추가 하 고 원심 3000 x g 6 분 초과 얼룩 제거에서 샘플.
참고: 혼합된 셀 인구 또는 조직 샘플에 대 한 수행 단계 1 x A5 바인딩 버퍼에 셀 유형 전용 표식의 조합을 사용 하 여 얼룩이 지는 항 체와 3000 x g 6에서 원심 분리 하기 전에 (또는 제조 업체의 프로토콜에 의하여) 20 분 동안 얼음에 품 어 분입니다. - FACS 버퍼의 3 ml에서 샘플 펠 릿 resuspend (1x PBS, 1 x A5 바인딩 버퍼, 10 %FSC, 2 mM EDTA) 1 x 107 셀 당.
- 라운드-하단, 폴 리 프로필 렌 (cytometry) 튜브로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터 및 샘플 얼음에, 어둠 속에서 계속.
- FACS 기계와 100 µ m 노즐을 사용 하 여 표준 설치를 수행, 드롭 지연 수행을 켜고 안정적인 흐름을 보장 합니다.
- 샘플을 로드 하 고 ~ 1000 이벤트/s 수집 속도 설정 합니다.
- FSC, SSC, APC (TO-프로-3) 조정 하 고 (A5) FITC 전압 및 인구를 보장 하기 위해 FACS 플롯 내의 위치 이벤트 명확 하 게 분리 될 수 있다.
- 20000 이벤트를 기록 합니다.
- 제 4 부로 제어 전략을 설정 합니다.
- 정렬 레이아웃에서 원하는 정렬 인구로 최종 ApoBD 게이트를 추가.
- 샘플 수집 시작 되 고 ~ 250 µ L FACS 버퍼를 포함 하는 새로운 관으로 5000-10000 ApoBDs를 수집 하 여 테스트 정렬을 수행.
- 뒤 시스템을 수행 하 고 정렬된 ApoBDs을 로드 합니다.
- 취득 및 테스트-정렬 ApoBDs을 기록.
- ApoBD 순도 FSC (y 축) 대 a 5를 비교 하 여 ~ 99% 인지 확인 (x 축 이벤트).
참고: 다시 레이저 표백으로 인해 샘플을 분석 하는 경우에 약간 줄일 수 있습니다 A5 얼룩. - 고 순도 달성 되 면 원래 샘플을 로드 하 고 정렬 ApoBDs의 원하는 숫자를 얻을 때까지 계속.
참고: 필요한 경우 듀얼 정렬을 수행할 수 있습니다 동시에 ApoCells 및 ApoBDs를 분리.
참고: 시간의 긴 기간 동안 정렬할 때 좋습니다 잠복기 4 ° c.에 컬렉션 튜브 - 정렬이 완료 되 면 정렬 후 ApoBDs의 작은 부분을 수집, ApoCells, Untreated, 및 WAS apoptosis의 유효성을 검사 하 여 정렬 후 순도 확인 후 정렬.
참고: 테스트 정렬 및 정렬 후 순도 크게 차이가 안 한다, 비록이 스트림 설정 및 안정성에 기반입니다.
3. ApoBD 절연 차등 원심 분리를 통해
- 10 분에 대 한 300 x g에서 나머지 apoptotic 샘플 원심
- ~ 500 µ L 셀 펠 렛을 방해 하지 않으려면 떠나 상쾌한 수집 하 고 새로운 15 mL 원뿔 튜브로 추가.
- 나머지 500 µ L을 제거 하 고 (이 'ApoCell 농축 비율'을 나타냅니다 1 x PBS의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
- 3000 g에서 20 분에 대 한 수집된 상쾌한 원심
- 펠 릿에 대 한 확인 하 고 조심 스럽게 제거 상쾌한 (는 상쾌한 microvesicles 및 exosomes를 포함 하 여 작은 세포 외 소포를 포함할 수 있습니다).
- 1 x PBS (이 대표는 ' ApoBD-농축 ' 분수)의 1 mL에 펠 릿 resuspend
- 각 실용적, WAS, ApoCell-농축, 및 새로운 라운드-하단, 폴리스 티 렌 (cytometry) 튜브 샘플 ApoBD 농축의 100 µ L를 수집 합니다.
- 2 x A5 바인딩 버퍼, 1: 100 A5-FITC, 및 1:1,000에-프로-3를 포함 하는 얼룩의 100 µ L를 추가
- 어둠 속에서 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
- Cytometry, apoptosis의 성공적인 유도 및 ApoBD 농축 분수의 순도 확인 하기 위해 위에서 설명한 제어 전략을 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.
4. Cytometry 전략 게이팅
- 플롯을-프로-3 (y 축) FSC (x 축) 모든 다른 비-permeabilized 이벤트 (TO-프로-3낮은/중간)에서 괴 사 성 세포 (TO-프로-3높은) 분리에 대 한.
- 모든 비 permeabilized 이벤트를 선택 하 고 a 5에 대 한 SSC 플롯. 두 개의 인구 인구 1 (P1), SSC중간/높은,낮은/중간 셀 A5 및 인구 2 (P2), 다른 모든 이벤트를 포함 하 여 게이트.
- P2에서 TO-프로-3 a 5에 대 한 플롯 하 고 A5중간/높 은 이벤트 모든 세포 파편을 제외를 선택 합니다.
- 모든 A5 긍정적인 이벤트를 선택 하 고 a 5에 대 한 FSC 플롯. ApoCells (FSC중간/높은)에서 ApoBDs (FSC낮은)을 구분 합니다.
참고: ApoBDs FACS 기반 접근을 통해 ApoBD 절연을 위한 게이팅, 좋습니다 마지막 단계를 ApoBDs를 선택 하 고 비교를-프로-3 a 5에 모든 이벤트를 선택 하 여. 이렇게 마지막 정렬 게이트 형광 보다는 FSC/SSC 매개 변수를 사용 하면. - 실행 가능한 세포 분석에 대 한 P1을 선택 하 고 두 가지 제어 전략 중 하나를 수행 합니다. 일반 실행 가능한 세포 분석, a 5에 대 한 FSC 플롯 고 따라서 나머지 세포 파편을 제거 하는 모든 FSC중간/높 은 셀을 선택 합니다. 또는, 심층 분석에 대 한 실행 가능한 세포 분리 될 수 있다 a 5에서- 에-프로-3 금감위에 대 한 플롯에 의해 초기 ApoCells. 선택에-프로-3낮은, FSC중간/높은 실행 가능한 세포와 TO-프로-3중간, FSC중간/높 은 A5- 초기 ApoCells.
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Representative Results
여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, THP 1 monocyte apoptosis 유도 되었다 그리고 ApoBDs 탐지 되 고 고립 FACS 기반 또는 차등 원심 분리 방식 (그림 1)를 통해. 첫째, apoptosis UV 방사선에 의해 유도 되었다 및 샘플 셀 apoptotic 형태학, blebbing, apoptotic 막 돌출 형성 및 ApoBDs6의 세대를 포함 하 여 전시 하는 때 외피의 2-3 h 후 수집 된. TO-프로-3와 A5 기반 흐름 cytometry 방법은 monocyte apoptosis와 ApoBD 형성의 유도 가능한 셀, 회 저 성 세포, 초기 ApoCells, ApoCells, ApoBDs 및 파편 (그림 2)을 분리 하 여 확인을 위해 사용 되었다. 함께 찍은, 교류 cytometry 분석 ~ 20%의 자외선 치료 결과 표시 ApoCells (그림 3).
THP 1 monocyte ApoBDs은 다음 두 가지 방법을 통해 WAS에서 격리. 첫째, 샘플 순도 FACS 기반 접근만 단일 원심 분리 단계는 얼룩이 지기 전에 전체 apoptotic 샘플 작은 필요가 대 한 준비 및 FACS. 이 메서드는 기능 분석에 대 한 적절 한 때 크게 높은 샘플 순도 (예: 정량 분석), ApoBDs 특정 수는 필요, 또는 필요한 경우 복잡 한 샘플에서 형식별 ApoBDs 셀 인수. 이 방법론을 사용 하 여, ApoBDs ~ 99% 순도 (그림 4)를 격리 했다.
다음, THP 1 monocyte ApoBDs는 또한 2 단계, 차등 원심 분리 방식을 통해 격리. 첫 번째 단계는 가능한 셀, ApoCells 및 회 저 성 세포의 포함 되어 있습니다. 두 번째 단계는 microvesicles 같은 작은 세포 외 소포에서 더 큰 ApoBDs의 분리 및 exosomes, g. cytometry x 3000에서 수송과 될 수 없습니다 다음 apoptosis 유도 및 ApoBD 샘플 순도 확인을 수행 하 고 시연 ~ 97%를 포함 하는 ApoBD 농축 샘플 ApoBDs (그림 4). 이 상대적으로 높은 순도에 ApoBD를 격리 하기 위해 신속 하 고 효과적인 기술을 선물 이며 적절 한 단일 셀 형식을 포함 하는 샘플에서 ApoBDs를 정화 하는 때.
그림 1 . 어느 FACS 기반 또는 차등 원심 분리 방식을 통해 ApoBD 절연의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . Flow cytometry 전략 게이팅. 6 셀/입자 하위 집합 (가능한 셀, a 5를 포함 하 여- 초기 ApoCells, A5+ ApoCells, ApoBDs, 회 저 성 세포, 파편) 식별 및 FACS 기반 격리에 대 한 ApoBD를 선택 하는 데 사용 했다. (a) 막 permeabilised 회 저 성 세포 비 permeabilised 이벤트에서 분리 됩니다. (b) A5낮은 중급, SSC낮은 높 은 셀 A5로우가 이벤트에서 분리 됩니다. (b.i) 깊이 분석, TO-포-3낮은 실행 가능한 세포를-프로-3중간 A5에서 분리 될 수 있다에 대 한- 초기 ApoCells. (b.ii) 또는 단순히 ApoBD 순도 계산, 실행 가능한 세포에서에서 분리 수 있습니다 FSC낮은 이벤트. (c) A5낮은 파편 제외 됩니다. (d) FSC중간/높 은 ApoCells FSC낮은 ApoBDs에서 분리 된다. (e) 모든 A5-프로 3중간/높 은 ApoBDs 정렬 선택 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . THP 1 monocyte apoptosis의 유효성 검사. 치료 또는 UV 방사선 THP 1 monocytes의 흐름 cytometry 분석 가능한 셀 a 5의 수준을 결정 하 수행 했다- 초기 ApoCells, A5+ ApoCells, 회 저 성 세포.
그림 4 . THP-1 정화 monocyte 파생 ApoBDs. 교류 cytometry 분석 격리 THP 1 monocyte 파생 된 ApoBDs 중 FACS 기반 또는 차등 원심 기반 접근을 통해 가능한 셀, ApoCells 및 회 저 성 세포에서 ApoBDs의 농축을 보여주는에서 수행 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이후 1950 년대에 있는 그것의 초기 설명, apoptosis의 분야 전진 했다 현저 하 게, 저명한 연구 분야를 되 고. 광범위 한 관심과 광범위 한 노력에도 불구 하 고 apoptosis, 특히 ApoBDs의 대형에에서의 하지 되었습니다 잘 공부 적절 한 방법론의 부족. 특히 추적 apoptosis 진행과 동시에 전통적인 cytometry A5/PI 분석 및 ApoBD 격리의 불순물을 사용 하 여 ApoBD 형성에 제한이 포함 됩니다. 최근 접근 방법론 이러한 단점을 해결 하기 위해 개발 했습니다.
우리의 새로운 흐름 cytometry 기반 분석 접근 ApoBDs를, 전통적인 분석 방법을 사용 하 여 감지 종종 무시 하 고20을 측정할 수 있습니다. 또한,이 흐름 cytometry 얼룩에-프로-3, 밝혀 추가 a 5의 사용 방법,- 초기 apoptotic 단계, 따라서 apoptosis 진행20의 더 나은 묘사를 렌더링을 수정 합니다. 전통적으로, ApoBD 검출에 의존 해야 무 겁 게 이미지 기반 기술이 confocal 현미경 조직학, 우리의 교류 cytometry 방법을 quantitate ApoBD 형성 하는 높은 처리량 접근 방식을 제공 하는 반면. 비록 겉보기 복잡 한 절차는 상대적으로 쉽게 하며만 상용 시 약 및 기본 흐름 cytometer. 논리 검색 및 ApoBDs의 정확한 정량화는 더 지시 세포 클리어런스 및 면역학 응답 apoptotic 세포 microenvironment의 지식을. 사실, 여기 설명 된 교류 cytometry 방법을 세포 기관이 특정 얼룩 커플링, 여 우리 최근 세포 내용 ApoBDs24의 이기종 배포를 보고 있다. 이러한 연구 결과 ApoBDs 서로 다른 하위 집합으로 분류 될 수 있다 각 ApoBD 하위 집합 다른 기능을 전시 수 있습니다 것이 좋습니다.
우리의 최근에 개발한 ApoBD 격리 기법 또한 extracellular 소포 분야에 발전에 기여할 것입니다. 전통적으로, ApoBD 절연에 사용 되는 차등 원심 분리 방법 다운스트림 기능 분석 실험에 영향을 미칠 수 있습니다 작은 세포의 상당한 금액을 포함할 수 있습니다. 그러나, 우리의 수정된 차등 원심 분리 접근 97% 순도 ApoBDs을 사용할 수 있습니다. 고 순도 차등 원심 분리에 의해 달성 될 수 있다, 비록 그러한 방법 복잡 한 샘플에서 ApoBDs를 분리 하는 데 적합 하지 않을 수 있습니다. 반면, 우리의 FACS 기반 99% 순도, ApoBDs을 풍요롭게 수 메서드와 ApoBDs 입자 크기, 입자 밀도에 전적으로 의존 하는 대신 PtdSer 노출, 단위 등의 독특한 생물 학적 특성에 따라. 이 접근은 또한 동시에 식별 하 고 격리 셀 형식 관련 마커24를 사용 하 여 다른 세포 유래의 ApoBDs 가능성이 있다. ApoBDs 필요한 수량에 따라 1-8 h 걸릴 수 있는 긴 FACS 절차에도 불구 하 고 ApoBDs의 기능적인 역할 및 분자 특성의 속성을 직접 정확한 ApoBD 절연 및 후속 다운스트림 분석 허용할 것입니다. 이러한 방법론에 대 한 것 ApoBD 격리 접근 결합 된다 cytometry 같은 기술로 (여기에 설명 된)으로 모두 apoptosis 유도 및 ApoBD 농축 샘플의 순도 확인 하기 위해 중요 하다. 또한, 설정 하는 적절 한 FACS 불안정 스트림 또는 잘못 수행된 드롭 지연 낮은 순도 발생할 수 있으므로 FACS 기반 접근 방식을 통해 ApoBD 격리에 대 한 필수적입니다.
샨 다, 우리 apoptosis 유도, ApoBD 감지 및 매우 순수한 ApoBDs의 절연 측정을 위한 최첨단 방법론을 설명 했습니다. 우리의 접근은 apoptotic 세포 분해 과정을 연구 하 고 질병 설정에서이 과정의 역할을 명료 하 게 하는 새로운 도구를 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
일이 I.K.H.P. 국가 건강 및 의료 연구 위원회 (GNT1125033 및 GNT1140187) 및 호주 연구 협의회 (DP170103790)에서 교부 금에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | - | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | - | - | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | - | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | - | - | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | - | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | - | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | - | |
| FlowJo 8.8.6 software | - | - | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | - |
References
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