Summary
Akış Sitometresi veya diferansiyel Santrifüjü kullanarak bir iş akışı tespit etmek, ölçmek ve apoptotik vücutlarından apoptotik örneği yüksek saflıkta yalıtmak için geliştirilmiştir.
Abstract
Apoptotik organları (ApoBDs), microvesicles ve exosomes anahtar hücre dışı vezikül ailesiyle en büyük türü olan ApoBDs üyesidir. ApoBDs hücre izni hem de hücreler arası iletişim yoluyla kaçakçılığı biomolecules yardımcı olabilir teklif edildi. Kimlik ve ApoBDs yalıtım için kullanılan geleneksel yaklaşımlar genellikle doğru miktar ve düşük örnek saflık eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Burada, apoptozis indüksiyon onaylamak, ApoBD formasyonu doğrulamak ve ApoBDs için yüksek saflıkta yalıtmak için bir iş akışı açıklanmaktadır. Ayrıca anahat ve floresan aktif hücre (FACS) sıralama ve ApoBDs izole etmek için fark Santrifüjü dayalı yaklaşımlar karşılaştırın. Ayrıca, izole ApoBDs saflığı kullanarak teyit edilecek bir daha önce akış sitometresi tabanlı boyama ve analitik yöntem kurmak. Birlikte, açıklanan yaklaşım kullanılarak yapılan THP-1 monosit apoptozis ve apoptotik hücre sökme indüklenen ve doğrulanmış ve THP-1 monosit oluşturulan ApoBD 97-%99 saflık için izole edildi.
Introduction
Apoptozis, programlı hücre ölümü iyi çalışılmış bir form fizyolojik homeostazı korumak ve insan vücudu1içindeki zararlı olma olasılığı bulunan hücreleri kaldırmak için gereklidir. Apoptozis indüksiyon sonra apoptotik hücreler (ApoCells) morfolojik değişiklikler bir dizi tabi ve ApoBDs olarak adlandırdığı küçük membran bağlı veziküller sökmeye. Genel olarak, bu işlem apoptotik hücre sökme bilinir ve morfoloji2,3dayalı 3 farklı adımları ayrılabilir. Adım 1 (plazma zarı blebbing) blebs4,5olarak bilinen hücre yüzeyinde balon benzeri yapıların oluşumu ile karakterizedir. Adım 2 (apoptotik çıkıntı oluşumu) uzun membran çıkıntılar sivri6,7,8apoptopodia, boncuklu-apoptopodia ve Mikrotubul gibi oluşumu içerir. Son olarak, adım 3 (ApoBD oluşumu) parçalanma apoptotik çıkıntılar ve/veya ApoBDs6,9oluşturmak için ApoCells içerir. Önceki bulgular ApoBDs apoptotik hücre temizleme yardım ve hücreler arası iletişim arabuluculuk rolü tavsiye ettiler. Örneğin, bir ApoCell parçalanma ApoBDs içine kolayca fagositler2,10,11çevreleyen tarafından kaldırılmış olabilir küçük 'ısırık büyüklüğünde' parçalar oluşturabilir önerilmiştir. Ayrıca, ApoBDs biomolecules DNA, RNA ve proteinler, hücre-hücre iletişim12,13,14kolaylaştırmak için çevredeki hücreleri insan ticareti gibi bir dizi olabilir liman. Bu işlemlerin işlevsel olarak araştırmak için (i) doğrulama apoptosis indüksiyon ve ApoBD oluşumu, ApoBDs izolasyonu (II) ve (III) onay ApoBD saflık da dahil olmak üzere üç anahtar parametreleri onaylamak için hayati önem taşımaktadır.
Daha önce birkaç yöntem akış sitometresi ve Elektron Mikroskopisi gibi apoptozis ve ApoBDs15,16,17,18eğitim için kullanılmaktadır. Ancak, ApoBD algılama ve miktar zor veya gözden çoğu kez. Örneğin, rutin olarak kullanılan akış sitometresi tabanlı apoptosis V annexin istihdam tahlil (A5, externalized bağlar bir protein ' yemek-bana ' sinyal Fosfatidilserin (PtdSer)) ve nükleik asit leke propidium iyodür (PI)19. Ancak, bu evrensel leke bileşimini kullanarak, analiz hücre alt kümeleri (hücrelerin, ApoCells ve nekrotik hücre) örnek yalnızca üç tür vardır varsayar. Ayrıca, apoptozis için pek çok araştırmacı tarafından "altın standart" olarak kabul rağmen akış sitometresi deneyleri ve sonraki veri analizi kez FSC/SSCOrta-yüksek olaylar seçerek bir ilk gating adım adım ApoBDs dışarıda tutar. Bu nedenle, biz son zamanlarda A5 ve kime-PRO-3 kullanarak bir roman akış sitometresi tahlil geliştirdik, seçmeli olarak caspase 3/7-aktif pannexin 1 (PANX1) tarafından alınabilir başka bir nükleik leke7,20kanal. Caspase 3 kaynaklı PANX1 harekete geçirmek PtdSer pozlama apoptosis erken aşamada önce gelir gibi kime-PRO-3 differentially apoptotik ve nekrotik hücre lekeleri. Buna ek olarak, bu yaklaşım strateji çoğunluğuna bizim roman ile birlikte veri çözümlemesi sırasında tüm alınan olayları içerir ve dahil olmak üzere altı hücre/parçacık alt kümeleri sonuç olarak tanımlanır: (i) hücrelerin (FSC/SSCOrta/yüksek, A5düşük , Kime-PRO-3düşük), (II) A5- erken ApoCells (FSC/SSCOrta/yüksek, A5düşük, kime-PRO-3Ara), (III) A5+ ApoCells (FSC/SSCOrta/yüksek, A5yüksek , Kime-PRO-3Ara), (IV) nekrotik hücre veya geç ApoCells (FSC/SSCOrta/yüksek, A5yüksek, kime-PRO-3yüksek), (v) ApoBDs (FSC/SSCdüşük, A5Ara, kime-PRO-3düşük / ara) ve (vi) enkaz (FSC/SSCdüşük, A5düşük, kime-PRO-3düşük)20. Bizim yaklaşım tüm hücreler/parçacık alt kümeleri ve daha da önemlisi, ApoBDs ayrılık hücreleri ve enkaz20analiz önemini vurgular. Böylece, bu yaklaşım aynı anda apoptozis ve ApoBD oluşumu indüksiyon doğrulamak için verimli bir tekniği gösteriyor.
Geleneksel olarak, ApoBDs nereye ApoBDs hücreleri veya yoğunluğu dayalı diğer ekstraselüler veziküller ayrılabilir diferansiyel Santrifüjü yaklaşımlar çeşitli aracılığıyla izole edilmiştir. Ancak, tür Santrifüjü yöntemler genellikle düşük ApoBD saflık,-sizlik çekmek-in örnek saflık ve/veya hücre türüne özgü ApoBDs17,21,22ayrı yetersizlik onaylamak için bir miktar adım tarafından sınırlıdır. Bu nedenle, biz son zamanlarda iki yaklaşım, FACS tabanlı ve hangi Apoptozis ve örnek saflık23indüksiyon doğrulamak için bizim daha önce kurulan akış sitometresi yöntemi ile birleştiğinde yeni fark Santrifüjü temelli bir yaklaşım geliştirdik. ApoBD yalıtım FACS tabanlı yaklaşımımız ile % 99 saflık için yukarı ApoBDs zenginleştirmek ve hücre türüne özgü antikor ApoBDs karma hücre popülasyonlarının, doku örnekleri ve vücut sıvıları23izole etmek için çeşitli ile birleştiğinde. Ayrıca, bizim gözden geçirilmiş fark Santrifüjü yaklaşım ApoBDs için yalıtmak için verimli bir yöntem gösteriyor > % 90 saflık23.
Bu yazıda, apoptozis indüksiyon, doğrulamak ve algılamak ve ApoBD oluşumu ölçmek için deneysel bir işlem bizim biz ayrıntılı olarak tarif. FACS tabanlı ve fark Santrifüjü tabanlı yöntemleri kullanarak ApoBD yalıtım iş akışları da özenli ve karşılaştırıldığında. Temsilcisi veri açıklanan yöntemi gelecekteki ApoBD çalışmalar için etkili bir üstün araç sağlar gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. indüksiyon apoptozis
- Hücre örneği 300 x g 5 min için'santrifüj kapasitesi ve önceden varolan herhangi bir hücre artıkları kaldırmak için süpernatant atın.
Not: yapışık hücreleri kullanırken, hücreleri önceden tohum ve 1 fosfat tamponlu çözüm (PBS) apoptosis indüksiyon öncesinde x ile yıkayın. - Cep numarasını belirlemek ve hücreleri toplamak.
Not: tahlil sonrası yalıtım bağlı olarak en az 1 x 10 bir başlangıç hücre sayısı7 hücreleri önerilir. - Komple medya (%10 (vol/vol) fetal buzağı serum, 50 IU/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin karışımı içeren ilgili orta) 1 x 106 hücre/mL nihai bir konsantrasyon için resuspend.
- Aliquot ~ 2 x 6 iyi plaka kuyu başına 106 hücre.
- Apoptozis ikna etmek için plaka kapağı kaldırın ve hücreleri bir UV irradiator kullanarak 150 mJ/cm2 ışınlatayım. Bu yaklaşık 30-60 s almalıdır.
Not: ~0.5 x 106 hücreler 'Untreated' hücre kontrolü için korunur ışınlama önce olun.
Not: Apoptosis Ayrıca anti-Fas veya serum açlık6gibi diğer yöntemleri ile indüklenen. - 37 ° c, % 5 CO2 hücre bağlı olarak 2-8 saat için kuluçkaya.
- Bir tezgah en iyi ışık mikroskop kullanarak, blebbing, apoptopodia oluşumu ve ApoBD oluşumu gibi apoptotik türleri morfoloji varlığını doğrulamak için hücreleri görselleştirin.
Not: 40 X büyütme yeterlidir - P1000 pipet, pipet ve apoptotik örnekleri toplamak kullanma.
- 1 x PBS ile tabak yıkama ve maksimum verim sağlamak için kalan örnek ile birleştirmek.
- Toplamak ~1/10th 'Bütün apoptotik örnek' (WAS) için kontrol.
- 'Tedavi edilmezse' örnek toplamak.
- 6 dk 3000 x g de WS ve Untreated örnekleri santrifüj kapasitesi.
- 1 mL 1 x PBS resuspend ve buz üzerinde bir kenara koyun.
- ApoBD yalıtımı için her iki adım 2 veya 3 kalan apoptotik örnek ile devam ediyor.
2. ApoBD yalıtım FACS üzerinden
- 3000 x g 6 dk için tüm örnek santrifüj kapasitesi.
- Pelet aksatmadan süpernatant çoğunluğu kaldırmak.
- 1 mL 1 x A5 bağlama arabellek, A5-FITC 75 µL ve kime-PRO-3 2 µL başına 1 x 107 hücreleri içeren bir boyama çözüm resuspend.
- Örnek 10 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya.
- 1-2 mL 1 x A5 bağlama arabellek ekleyin ve örneği için fazla leke kaldırmak 6 dk 3000 x g'santrifüj kapasitesi.
Not: Karma hücre popülasyonlarının veya doku örnekleri, adım 1 x A5 bağlayıcı arabelleğe birleşimiyle hücre türüne özgü Marker boyama bir antikor gerçekleştirmek ve Santrifüjü 3000 x g 6 için de önce buz 20 dk (veya üreticinin iletişim kuralı göre) üzerinde kuluçkaya Min. - Örnek Pelet FACS arabellek 3 mL resuspend (1 x PBS, 1 x A5 bağlama arabellek, % 10 FSC, 2 mM EDTA) 1 x 107 hücre başına.
- 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla bir yuvarlak-alt, polipropilen (akış sitometresi) tüp filtre ve örnekleri buz üzerinde ve karanlıkta tut.
- FACS makinede açmak ve bir 100 µm meme kullanarak standart olarak gerçekleştirmek, damla gecikme yapmak ve istikrarlı bir akışı sağlamak.
- Örnek yüklemek ve satın alma hızını ~ 1000 olayları/s için.
- FSC, SSC, APC (kime-PRO-3) ayarlamak ve FITC (A5) gerilim ve nüfus sağlamak için FACS araziler içinde pozisyon olayları açıkça ayrılmış olabilir.
- 20.000 olayları kaydetmek.
- Gating bir strateji olduğu gibi bölüm 4 ayarlayın.
- Sıralama düzeninde son ApoBD kapısı istenen sıralama nüfus eklemek.
- Örnek alınıyor başlamak ve ~ 250 µL FACS arabellek içeren yeni bir tüpe 5,000-10,000 ApoBDs toplayarak bir test sıralamayı gerçekleştirmek.
- Bir sistem geri floş gerçekleştirmek ve yük ApoBDs sıralanır.
- Elde etmek ve test-sıralama ApoBDs kaydedin.
- FSC (y ekseni) vs A5 karşılaştırarak ApoBD saflık % ~ 99 olduğundan emin olun (x ekseni olaylar).
Not: A5 boyama biraz nedeniyle lazer beyazlatma örnekleri yeniden analiz ederken azaltmak. - Yüksek saflıkta elde sonra orijinal örnek yük ve ApoBDs için istediğiniz sayıyı elde kadar sıralama devam edin.
Not: gerekirse, ikili sıralama aynı anda ApoCells ve ApoBDs izole etmek için gerçekleştirilebilir.
Not: uzun bir süre boyunca sıralarken, koleksiyon tüp 4 ° C'de kuluçka önerilir - Sıralama işlemi tamamlandıktan sonra sonrası sıralama ApoBDs küçük bir bölümünü toplamak, tür sonrası ApoCells, Untreated ve WAS apoptosis doğrulamak ve sonrası sıralama saflık onaylamak için.
Not: test-sıralama ve sonrası sıralama saflık önemli ölçüde farklı değil olsa da, bu akış ayarları ve istikrar üzerinde temel alır.
3. ApoBD yalıtım fark Santrifüjü üzerinden
- Kalan apoptotik örneği ' 300 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.
- Hücre Pelet etkilemesini önlemek için ~ 500 µL bırakarak süpernatant, toplamak ve bir yeni 15 mL konik tüp içine ekleyin.
- Kalan 500 µL kaldırmak ve hücre Pelet resuspend 2 mL 1 x PBS (Bu 'ApoCell zenginleştirilmiş kesir' temsil eder.
- Toplanan süpernatant 3000 gde 20 dk santrifüj kapasitesi.
- Pelet için kontrol edin ve dikkatli bir şekilde (süpernatant microvesicles ve exosomes de dahil olmak üzere küçük hücre dışı veziküller içerebilir) süpernatant çıkarın.
- Pelet 1 mL 1 x PBS (Bu 'ApoBD-zenginleştirilmiş' kesir temsil eder) resuspend
- Her Viable, WS, ApoCell zenginleştirilmiş ve ApoBD zenginleştirilmiş örnekleri içinde bir yeni turda-dip, polistiren (akış sitometresi) tüp 100 µL toplamak.
- 2 x A5 bağlama arabellek, 1: 100 A5-FITC ve 1:1,000 kime-PRO-3 içeren leke 100 µL Ekle
- 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Örnekleri gating strateji apoptosis başarılı indüksiyon ve ApoBD zenginleştirilmiş kesir saflığı doğrulamak için yukarıda açıklandığı gibi kullanarak akış sitometresi tarafından analiz.
4. akış sitometresi strateji geçişi
- Arsa kime-PRO-3 (y ekseni) karşı nekrotik hücre (kime-PRO-3yüksek) tüm diğer permeabilized olmayan olaylardan (kime-PRO-3düşük/orta) ayırmak için FSC (x ekseni).
- Tüm sigara permeabilized olayları seçin ve A5 karşı SSC arsa. Nüfus 1 (P1), SSCOrta/yüksek, A5düşük/orta hücreleri ve nüfus 2 (P2), diğer bütün olayları da dahil olmak üzere iki popülasyonun kapı.
- P2, kime-PRO-3 A5 karşı komplo ve A5Orta/yüksek olaylar tüm hücre artıkları dışarıda bırakmak için seçin.
- Tüm A5 olumlu olayları seçin ve A5 karşı FSC arsa. ApoBDs (FSCdüşük) ApoCells (FSCOrta/yüksek) ayırın.
Not: ApoBDs ApoBD yalıtım FACS dayalı yaklaşım yoluyla için geçişi, son bir adım ApoBDs ve kime-PRO-3 A5 için karşılaştırma ve tüm olayları seçerek önerilir. Bu son sıralama kapısı FSC/SSC parametreleri yerine floresans kullanmasını sağlar. - Geçerli hücre analizi, P1 seçin ve iki gating stratejileri birini gerçekleştirin. Genel geçerli hücre analizi için FSC A5 karşı arsa ve bu nedenle kalan hücre artıkları kaldırma tüm FSCOrta/yüksek hücreleri seçin. Alternatif olarak, derinlemesine analiz için hücrelerin A5 ayrılabilir- kime-PRO-3 FSC karşı komplo tarafından erken ApoCells. Seçin kime-PRO-3düşük, FSCOrta/yüksek hücrelerin ve kime-PRO-3Ara, FSCOrta/yüksek A5- erken ApoCells.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada özetlenen yordamı kullanarak, THP-1 monosit apoptosis akımıdır ve ApoBDs algılanır ve bir FACS tabanlı veya bir fark Santrifüjü yaklaşım (Şekil 1) yolu ile izole. İlk olarak, apoptozis UV ışınlama tarafından indüklenen ve apoptotik türleri morfoloji, blebbing, apoptotik membran çıkıntı oluşumu ve ApoBDs6nesil de dahil olmak üzere hücreleri sergilenen zaman örnekleri, kuluçka sonra 2-3 h toplanmıştır. Kime-PRO-3 ve A5 tabanlı akış sitometresi yöntemi hücrelerin, nekrotik hücre, erken ApoCells, ApoCells, ApoBDs ve enkaz (Şekil 2) ayırarak monosit apoptozis ve ApoBD oluşumu indüksiyon onaylamak için kullanıldı. Birlikte ele alındığında, Akış Sitometresi Analizi UV tedavi ~ %20 sonuçları belirtilen ApoCells (Şekil 3).
THP-1 monosit ApoBDs zamanlar olarak WS iki yaklaşım yoluyla gelen izole. İlk olarak, örnekleri yüksek saflıkta FACS dayalı yaklaşım nerede sadece bir tek Santrifüjü adım boyama önce tüm apoptotik örnek cips için gereklidir için hazırlanmıştır ve FACS. Bu önemli ölçüde yüksek örnek saflık (örneğin, qPCR analiz için) gerekli olduğunda, ApoBDs belirli sayıda gerekli ne zaman veya ne zaman elde hücre türüne özgü ApoBDs karmaşık bir örnek üzerinden işlevsel deneyleri için uygun bir yöntemdir. Bu yöntemi kullanarak, ApoBDs % ~ 99 saflık (Şekil 4) izole edildi.
Ardından, THP-1 monosit ApoBDs, aynı zamanda bir iki adım, farklı aralıklarla yaklaşım ile izole edildi. İlk adım yalıtım hücrelerin, ApoCells ve nekrotik hücre içerir. İkinci adım, daha büyük ApoBDs ayrılması microvesicles gibi küçük hücre dışı veziküller içerir ve g. akış sitometresi x 3000 adlı pelleted mümkün değildir exosomes sonra apoptosis indüksiyon ve ApoBD örnek saflık onaylamak için yapılan ve ~ %97 içeren bir ApoBD zenginleştirilmiş örnek gösterdi ApoBDs (Şekil 4). Bu ApoBD için nispeten yüksek saflıkta yalıtmak için hızlı ve etkili bir teknik sunar ve ApoBDs içeren bir tek hücre türü örnekleri arındırıcı uygundur.
Resim 1 . ApoBD yalıtım bir FACS tabanlı veya farklı aralıklarla yaklaşım ile Şematik diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Akış sitometresi strateji geçişi. Altı hücre/parçacık alt kümeleri (hücrelerin, A5 dahil olmak üzere- erken ApoCells, A5+ ApoCells, nekrotik hücre, ApoBDs ve enkaz) tespit ve ApoBD FACS tabanlı yalıtım için seçmek için kullanılır. (a) membran permeabilised nekrotik hücre permeabilised olmayan olaylardan ayrılır. (b) A5düşük-orta, SSCdüşük-yüksek hücreler A5düşük-yüksek olaylardan ayrılır. (b.ı) derinlik analizi, kime-POR-3düşük hücrelerin kime-PRO-3Ara A5 ayrılabilir için- erken ApoCells. (b.ii) alternatif olarak, sadece ApoBD saflık hesaplanırken, hücrelerin FSCdüşük olaylardan ayrılabilir. (c) A5düşük enkaz hariç. (d) FSCOrta/yüksek ApoCells FSCdüşük ApoBDs ayrılır. (e) tüm 3 PRO A5Orta/yüksek ApoBDs sıralamak için seçilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . THP-1 monosit apoptosis doğrulanmasını. Tedavi edilmemiş veya UV ışınlanmış THP-1 monosit Akış Sitometresi Analizi gerçekleştirilen hücrelerin, A5 düzeylerini belirlemek için- erken ApoCells, A5+ ApoCells ve nekrotik hücre.
Şekil 4 . Arıtma THP-1 monosit elde edilen ApoBDs. Akış Sitometresi Analizi ApoBDs hücrelerin, ApoCells ve nekrotik hücre zenginleştirme gösterilen izole THP-1 monosit kaynaklı ApoBDs ya bir FACS tabanlı veya farklı aralıklarla dayalı yaklaşım ile gerçekleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1950'lerin başlarında açıklamasını beri apoptozis alanında belirgin, bir önde gelen araştırma alanı haline ilerlemiştir. Geniş ilgi ve geniş çabalarına rağmen apoptozis, özellikle ApoBDs, oluşumu bazı yönlerini de uygun yöntemleri eksikliği nedeniyle incelenmiştir değil. Bunlar özellikle belgili tanımlık sınırlama apoptosis ilerleme ve ApoBD oluşumu aynı anda geleneksel akış sitometresi A5/PI analiz ve ApoBD yalıtım kirleri kullanarak izleme içerir. Biz son zamanlarda metodolojik Bu eksiklikleri gidermek için yaklaşımlar geliştirdik.
Bizim yeni akış sitometresi tabanlı analitik bir yaklaşım genellikle algılanabilmesi için geleneksel analitik yöntemleri kullanarak sayılır ve20sayısal ApoBDs sağlar. Buna ek olarak, bu nedenle apoptosis ilerleme20daha iyi tarif işleme akış sitometresi yöntemi, leke kime-PRO-3, ortaya bir ek A5 kullanımı ile- erken apoptotik aşamada değiştiren. Geleneksel, ApoBD algılama dayanıyordu ağır gibi confocal mikroskobu ve histoloji, yansıma tabanlı teknikleri üzerinde ise bizim akış sitometresi yöntemi quantitate ApoBD oluşumu için bir yüksek-den geçerek yaklaşım sağlar. Görünüşte karmaşık rağmen prosedür nispeten kolaydır ve sadece temel akış sitometresi ve piyasada bulunan reaktifler gerektirir. Daha fazla mantıksal algılama ve ApoBDs kesin miktar dikte hücre gümrükleme ve immünolojik yanıt apoptotik hücre microenvironment bilgisine. Aslında, burada açıklanan akış sitometresi yöntemi organel özgü lekeleri ile kaplin tarafından biz son zamanlarda ApoBDs24hücresel İçindekiler türdeş olmayan dağıtım bildirdi. Bu bulgular ApoBDs farklı alt kümeleri kategorize edilebilir ve her ApoBD alt farklı işlevler sergileyebilirler öneririz.
Bizim son zamanlarda geliştirilen ApoBD yalıtım teknikleri de ekstraselüler veziküller alanında önemli ilerlemeler katkıda bulunacak. Geleneksel olarak, ApoBD yalıtımı için kullanılan fark Santrifüjü yöntemleri aşağı akım işlevsel testleri etkileyebilir küçük hücreler, önemli miktarda içerebilir. Ancak, değiştirilmiş fark Santrifüjü yaklaşımımız ApoBDs % 97'si namusuna yalıtmak için kullanılabilir. Yüksek saflıkta tarafından fark Santrifüjü elde edilebilir olsa da, bu tür Yöntemi karmaşık örnekleri ApoBDs yalıtmak için uygun olmayabilir. Buna ek olarak, bizim FACS tabanlı yöntemi ApoBDs % 99 saflık için zenginleştirmek ve partikül büyüklüğü, parçalı yapı ve yalnızca parçacık yoğunluğu üzerinde güvenmek yerine PtdSer pozlama da dahil olmak üzere ApoBDs benzersiz biyolojik özellikleri temel alır. Bu yaklaşım aynı zamanda eşzamanlı olarak tanımlanmasını ve yalıtılmasını hücre türüne özgü işaretleri24kullanarak farklı hücre kökenli ApoBDs potansiyeline sahiptir. 1-8 h ApoBDs gerekli miktarı bağlı olarak sürebilir bir uzun FACS yordam rağmen doğru ApoBD yalıtım ve daha sonraki aşağı akım analiz moleküler özelliklerinin doğrudan sıfat ve ApoBDs, fonksiyonel rollerinin izin vermez. Bu tür yöntemleri için ApoBD yalıtım yaklaşımlar ile akış sitometresi gibi teknikleri (burada özetlenen) hem apoptosis indüksiyon ve ApoBD zenginleştirilmiş örnek saflığı doğrulamak için birleştiğinde ki çok önemlidir. Ayrıca, bir kararsız akışı veya yanlış gerçekleştirilen bırakma gecikme düşük saflık neden olabileceğinden uygun FACS kurmak ApoBD yalıtım FACS dayalı yaklaşım yoluyla için gerekli olduğunu.
Topluca, biz apoptosis indüksiyon, ApoBD algılama ve son derece saf ApoBDs yalıtım miktarının için üstün metodolojileri belirttiğimiz. Yaklaşımımız apoptotik hücre sökme işlemi çalışma ve hastalık ayarları bu süreçte rol aydınlatmak için yeni bir araç sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bunun işe yaradığına I.K.H.P. için Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (GNT1125033 ve GNT1140187) ve Avustralya Araştırma Konseyi (DP170103790) hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | - | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | - | - | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | - | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | - | - | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | - | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | - | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | - | |
| FlowJo 8.8.6 software | - | - | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | - |
References
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
- Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
- Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
- Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
- Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
- Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
- Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
- Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
- Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
- Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
- Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
- Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
- Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
- Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
- Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
- Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
