Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Gjenkjennings- og isolering av apoptotisk organer til høy renhet

doi: 10.3791/58317 Published: August 12, 2018

Summary

En arbeidsflyt ved hjelp av flyt cytometri eller differensial sentrifugering er utviklet for å oppdage, kvantifisere og isolere apoptotisk organer fra en apoptotisk prøve å høy renhetsgrad.

Abstract

Apoptotisk organer (ApoBDs), microvesicles og exosomes er de viktigste medlemmene av ekstracellulære vesicle familien ApoBDs er en av de største type. Det har blitt foreslått at ApoBDs kan hjelpe celle klaring samt intercellulære kommunikasjon gjennom menneskehandel biomolecules. Konvensjonelle tilnærminger brukt for identifisering og isolering av ApoBDs er ofte begrenset av mangel på nøyaktig kvantifisering og lav eksempel renhet. Her beskriver vi en arbeidsflyt for å bekrefte induksjon av apoptose, validere ApoBD formasjon og isolere ApoBDs til høy renhetsgrad. Vi vil også disponere og sammenligne fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) og differensial sentrifugering basert tilnærminger til å isolere ApoBDs. Videre renheten av isolerte ApoBDs vil bli bekreftet ved hjelp av en tidligere etablere flyt cytometri-basert flekker og analysemetode. Tatt sammen med beskrevet tilnærming, THP-1 monocytt apoptose og apoptotisk celle demontering ble indusert og godkjent, og ApoBD generert fra THP-1 monocytter var isolert til renhet av 97-99%.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Apoptose, en godt studert form for programmert celledød, er nødvendig for å opprettholde fysiologiske homeostase og fjerne skadelige celler i den menneskelige kropp1. Etter induksjon av apoptose, kan apoptotisk celler (ApoCells) gjennomgå en rekke morfologiske endringene og Demonter til små membran-bundet blemmer kalt ApoBDs. Total, denne prosessen kalles apoptotisk celle demontering og kan deles inn i 3 forskjellige trinn basert på morfologi2,3. Trinn 1 (plasma membran blebbing) er preget av dannelsen av ballong-lignende strukturer på celleoverflaten kalles blebs4,5. Trinn 2 (apoptotisk protrusion formasjon) inkluderer dannelsen av lang membran utstikkende deler som apoptopodia, beaded apoptopodia og microtubule toppene6,7,8. Til slutt, trinn 3 (ApoBD formasjon) inneholder fragmentering av utstikkende deler som apoptotisk eller ApoCells til å generere ApoBDs6,9. Tidligere funn har foreslått en rolle i ApoBDs hjelpe apoptotisk celle klarering og formidling intercellulære kommunikasjon. For eksempel er det foreslått at fragmentering av en ApoCell til ApoBDs kan generere små bite-sized biter som lett kan fjernes ved omgir phagocytes2,10,11. Videre kan ApoBDs havn en rekke biomolecules som DNA, RNA og proteiner, som kan være smugles til omkringliggende celler å lette celle-celle kommunikasjon12,13,14. Funksjonelt undersøke disse prosessene, er det viktig å bekrefte tre nøkkelparametere inkludert (i) validering av apoptose induksjon og ApoBD formasjon, (ii) isolering av ApoBDs, og (iii) bekreftelse av ApoBD renhet.

En rekke metoder inkludert flowcytometri og elektronmikroskop har tidligere blitt brukt apoptose og ApoBDs15,16,17,18. Men er ApoBD påvisning og måling ofte vanskelig eller oversett. For eksempel rutinemessig brukes flyt cytometri-baserte apoptose analysen sysselsetter annexin V (A5, et protein som binder de externalized ' spise-meg ' signal fosfatidylserin (PtdSer)) og nukleinsyre flekken propidium iodide (PI)19. Imidlertid bruker denne universelle flekken kombinasjonen, forutsetter analyse at det finnes tre typer celle undergrupper (levedyktig cellene, ApoCells og nekrose) i utvalget. Videre om betraktet som "en gull-standard" av mange forskere for apoptose, flowcytometri søk og påfølgende analyse utelukker ofte ApoBDs gjennom et første gating trinn å velge FSC/SSCMiddels høy hendelser. Derfor har vi nylig utviklet en roman flyt cytometri analysen A5 og til-PRO-3, en annen kan flekken som kan selektivt tas av caspase 3/7-aktivert pannexin 1 (PANX1) kanaler7,20. Som caspase 3-indusert PANX1 aktivisering foran PtdSer eksponering på et tidlig stadium av apoptose, flekker til-PRO-3 ulikt apoptotisk og nekrose celler. I tillegg denne tilnærmingen kombinert med vår romanen gating strategi omfatter alle ervervet hendelser under dataanalyse og resultatet seks cellen/partikkel delsett er identifisert, inkludert: (i) levedyktige cellers (FSC/SSCMiddels/høy, A5lav , Til-PRO-3lav), (ii) A5- tidlig ApoCells (FSC/SSCMiddels/høy, A5lav, til-PRO-3Middels), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCMiddels/høy, A5høy , Til-PRO-3Middels), (iv) nekrotisk celler eller sen ApoCells (FSC/SSCMiddels/høy, A5høy, til-PRO-3høy), (v) ApoBDs (FSC/SSClav, A5mellomliggende, til-PRO-3lav / mellomliggende), og (vi) rusk (FSC/SSClav, A5lav, til-PRO-3lav)20. Vår tilnærming understreker viktigheten av å analysere alle celler/partikkel delsett og, enda viktigere, separasjon av ApoBDs fra celler og rusk20. Derfor viser denne tilnærmingen en effektiv teknikk for å validere induksjon av apoptose og ApoBD formasjon samtidig.

ApoBDs har tradisjonelt vært isolert gjennom en rekke differensial sentrifugering tilnærminger der ApoBDs kan skilles fra celler eller andre ekstracellulære blemmer basert på tetthet. Men er slike sentrifugering metoder ofte begrenset av lave ApoBD renhet, mangel på en kvantifisering steg å bekrefte eksempel renhet, og/eller manglende evne til å skille celle type-spesifikk ApoBDs17,21,22. Derfor har vi nylig utviklet to tilnærminger, en FACS-basert og en ny differensial sentrifugering tilnærming som kan kombineres med våre tidligere etablert flyt cytometri metode for å validere induksjon av apoptose og prøve renhet23. ApoBD isolasjon via våre FACS tilnærming kan berike ApoBDs opp til 99% renhet og kan kombineres med en rekke celle type-spesifikk antistoffene isolere ApoBDs fra blandet celle populasjoner, vevsprøver og kroppsvæsker23. Videre vår reviderte differensial sentrifugering tilnærming demonstrerer en effektiv metode for å isolere ApoBDs til > 90% renhet23.

I dette papiret beskrive vi i detalj vår eksperimentelle prosedyren validere apoptose induksjon, og for å oppdage og kvantifisere ApoBD formasjon. ApoBD isolasjon arbeidsflyter med FACS-basert og differensiell sentrifugering-baserte metoder er også utarbeidet og sammenlignet. Representant dataene viser at beskrevet metodikken gir et effektivt banebrytende verktøy for fremtidig ApoBD studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. induksjon av apoptose

  1. Sentrifuger celle utvalg på 300 x g for 5 min og Forkast nedbryting å fjerne eventuelle eksisterende celle rusk.
    Merk: Når du bruker tilhenger celler, frø celler på forhånd og vask med 1 x fosfat-bufret løsning (PBS) før apoptose induksjon.
  2. Bestemme celle nummer og samle celler.
    Merk: Avhengig av analysen etter isolasjon, vi anbefaler celle startnummeret på minst 1 x 107 celler.
  3. Resuspend i komplett medier (respektive medium som inneholder 10% (vol/vol) fetal kalv serum, 50 IU/mL penicillin, 50 µg/mL streptomycin blanding) for en siste konsentrasjon av 1 x 106 celler/mL.
  4. Aliquot ~ 2 x 106 celler per brønn av en 6 godt plate.
  5. For å indusere apoptose, Fjern plate lokket og irradiate cellene på 150 mJ/cm2 bruke en UV-irradiator. Dette tar omtrent 30-60 s.
    Merk: Før bestråling, kontroller at ~0.5 x 106 celler beholdes for kontrollen 'Untreated' celle.
    Merk: Apoptose kan også bli satt via andre metoder som anti-Fas eller serum sult6.
  6. Inkuber ved 37° C, 5% CO2 på 2-8 timer, avhengig av den cellen linjen.
  7. Bruker en benk toppen lys mikroskop, visualisere celler for å bekrefte tilstedeværelse av apoptotisk morphologies, som blebbing, apoptopodia formasjon og ApoBD formasjon.
    Merk: 40 X forstørrelse er tilstrekkelig
  8. Bruker en P1000 pipette, Pipetter og samle apoptotisk prøver.
  9. Vaske platen med 1 x PBS og kombinere med gjenværende prøve å sikre maksimal avkastning.
  10. Samle ~1/10th for "hele apoptotisk prøven' (WAS) kontroll.
  11. Samle 'Ubehandlet' prøven.
  12. Sentrifuge både ble og Untreated eksempler på 3000 x g for 6 min.
  13. Resuspend i 1 mL 1 x PBS og avsatt på is.
  14. ApoBD isolasjon, fortsette å enten trinn 2 eller 3 med gjenværende apoptotisk prøven.

2. ApoBD isolasjon via FACS

  1. Sentrifuge hele prøven 3000 x g for 6 min.
  2. Fjerne fleste nedbryting av uten å forstyrre pellet.
  3. Resuspend i en flekker løsning som inneholder 1 mL 1 x A5 binding buffer, 75 µL av A5-FITC, og 2 µL av til-PRO-3 per 1 x 107 celler.
  4. Inkuber utvalg i mørket ved romtemperatur for 10 min.
  5. Legg til 1-2 mL 1 x A5 binding buffer og sentrifuge eksempel på 3000 x g for 6 min fjerner overflødig stain.
    Merk: Blandet celle populasjoner eller vevsprøver, utføre et antistoff flekker hjelp av en kombinasjon av celle type-spesifikk markører 1 x A5 binding buffer og ruge på is for 20 min (eller etter produsentens protokollen) før sentrifugering 3000 x g for 6 min.
  6. Resuspend prøven pellet i 3 mL FACS buffer (1 x PBS, 1 x A5 binding buffer, 10% FSC, 2 mM EDTA) per 1 x 107 celler.
  7. Filtrere gjennom en 70 µm celle sil i en runde bunn, polypropylen (flowcytometri) rør og holde prøvene på is og i mørket.
  8. Slå på FACS maskinen og utføre standard sett opp med en 100 µm dyse, utføre slipp forsinkelsen, og sikre en stabil strøm.
  9. Last prøven og angi oppkjøpet hastighet ~ 1000 hendelser/s.
  10. Justere FSC, SSC, APC (til-PRO-3) og FITC (A5) spenninger og plasser hendelser innenfor FACS tomter for å sikre bestander klart kan skilles.
  11. Registrer 20.000 hendelser.
  12. Definere en gating strategi i del 4.
  13. Legge til det endelige ApoBD gate som ønsket sortering befolkningen i oppsettet for sortering.
  14. Begynne å anskaffe utvalget og utføre en test sortering ved å samle 5000-10.000 ApoBDs inn i et nytt rør som inneholder ~ 250 µL FACS buffer.
  15. Systemet tilbake flush og laste sorterte ApoBDs.
  16. Kjøpe og registrere test-Sorter ApoBDs.
  17. Kontroller at ApoBD renhet er ~ 99% ved å sammenligne FSC (y-aksen) vs A5 (x-aksen hendelser).
    Merk: A5 flekker kan redusere litt ved å analysere prøver på grunn av laser bleking.
  18. Når høy renhetsgrad er oppnådd, laste opprinnelige prøven og fortsette sortering til ønsket antall ApoBDs er oppnådd.
    Merk: Eventuelt dobbelt sortering kan utføres for å isolere samtidig ApoCells og ApoBDs.
    Merk: Når sortering over en lang periode, vi anbefaler rugende samling røret på 4 ° C.
  19. Når sortering er fullført, samle en liten del av post form ApoBDs, sortere etter ApoCells Untreated og var å validere apoptose og bekrefte etter Sorter renhet.
    Merk: Selv om test-Sorter og etter Sorter renhet ikke bør avviker vesentlig, dette er basert på stream innstillinger og stabilitet.

3. ApoBD isolasjon via differensial sentrifugering

  1. Sentrifuge gjenværende apoptotisk prøven på 300 x g i 10 min.
  2. Samle nedbryting, forlater ~ 500 µL for å unngå å forstyrre celle pellets, og legge inn en ny 15 mL konisk tube.
  3. Fjerne de gjenværende 500 µL og resuspend celle pellet i 2 mL 1 x PBS (Dette representerer 'ApoCell-beriket brøken'.
  4. Sentrifuge samlet nedbryting for 20 min 3000 g.
  5. Sjekk for pellets og fjern forsiktig nedbryting (nedbryting kan inneholde små ekstracellulære blemmer inkludert microvesicles og exosomes).
  6. Resuspend pellet i 1 mL 1 x PBS (Dette representerer "ApoBD-beriket" delen)
  7. Samle 100 µL av hver levedyktig, var, ApoCell-beriket, og ApoBD-beriket prøver i en ny runde-bunn, polystyren (flowcytometri) rør.
  8. Legge til 100 µL av flekken inneholder 2 x A5-binding buffer, 1: 100 A5-FITC og 1:1,000 til-PRO-3
  9. Inkuber ved romtemperatur for 10 min i mørket.
  10. Analysere prøver av flowcytometri, ved hjelp av gating strategien som beskrevet ovenfor til å validere vellykket induksjon av apoptose og renhet av ApoBD-beriket brøken.

4. flowcytometri Gating strategi

  1. Plot til-PRO-3 (y-aksen) mot FSC (x-aksen) skille nekrotisk celler (til-PRO-3høy) fra alle andre ikke-permeabilized hendelser (til-PRO-3lav/middels).
  2. Velg alle ikke-permeabilized hendelser og plotte SSC mot A5. Gate to bestander inkludert befolkningen 1 (P1), SSCMiddels/høy, A5lav/middels celler og befolkningen 2 (P2), alle andre hendelser.
  3. Fra P2, plot til-PRO-3 mot A5 og velg A5Middels/høy hendelser å utelate alle celle rusk.
  4. Velg alle A5 positive hendelser og plotte FSC mot A5. Skille ApoBDs (FSClav) fra ApoCells (FSCMiddels/høy).
    Merk: Når gating ApoBDs ApoBD isolering via den FACS tilnærmingen, anbefaler vi en siste trinnet for ved å velge ApoBDs og sammenligne til-PRO-3 til A5 og velge alle hendelser. Dette sikrer at det endelige sortering gate bruker fluorescens fremfor FSC/SSC parametere.
  5. For levedyktig celle analyse, Velg P1 og utfør én av to gating strategier. De generelle levedyktig celle analyse, plot FSC mot A5 og velge alle FSCMiddels/høy celler, derfor fjerne gjenværende celle rusk. Eventuelt for detaljert analyse, levedyktige cellers kan skilles fra A5- tidlig ApoCells ved å plotte til-PRO-3 mot FSC. Velg til-PRO-3lav, FSCMiddels/høy levedyktige cellers og til-PRO-3Middels, FSCMiddels/høy A5- tidlig ApoCells.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bruker du fremgangsmåten her, THP-1 monocytt apoptose ble indusert og ApoBDs ble oppdaget og isolerte enten via en FACS-basert eller en differensiell sentrifugering tilnærming (figur 1). Først apoptose ble indusert ved UV bestråling og trykkprøver ble innsamlet etter 2-3 h med inkubering når celler utstilt apoptotisk morphologies, inkludert blebbing, apoptotisk membran protrusion formasjon og generering av ApoBDs6. TIL-PRO-3 og A5-baserte cytometri metode ble brukt til å bekrefte induksjon av monocyte apoptose og ApoBD formasjon ved å skille levedyktige cellers nekrotisk celler, tidlig ApoCells, ApoCells, ApoBDs og rusk (figur 2). Samlet flyt cytometri analyse indikerte at UV-behandling gir ~ 20% ApoCells (Figur 3).

THP-1 monocytt ApoBDs var så isolert fra ble via disse metodene. Først prøver var forberedt en høy renhetsgrad FACS tilnærming der bare et enkelt sentrifugering skritt må pellets hele apoptotisk prøven før farging og FACS. Denne metoden er egnet for funksjonell analyser når betydelig høy eksempel renhet er nødvendig (for eksempel for qPCR analyse), når et bestemt antall ApoBDs er nødvendig eller da anskaffe celle type-spesifikk ApoBDs fra et omfattende utvalg. Med denne metoden, ble ApoBDs isolert til ~ 99% renhet (Figur 4).

Deretter THP-1 monocytt ApoBDs var også isolert via en totrinns, differensial sentrifugering tilnærming. Første skritt omfatter isolering av levedyktig cellene, ApoCells og nekrose. Det andre trinnet inkluderer separasjon av større ApoBDs fra små ekstracellulære blemmer som microvesicles og exosomes, som ikke kan være pelleted på 3000 x g. flowcytometri ble deretter utført for å bekrefte apoptose induksjon og ApoBD utvalg renhet og vist en ApoBD-beriket prøve ~ 97 prosent ApoBDs (Figur 4). Dette gir en rask og effektiv teknikk for å isolere ApoBD til relativt høy renhet er egnet når rensing ApoBDs fra prøver som inneholder en enkelt celle type.

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk diagram ApoBD isolasjon via enten en FACS-basert eller differensiell sentrifugering tilnærming. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Flow cytometri gating strategi. Seks cellen/partikkel delsett (inkludert levedyktig celler, A5- tidlige ApoCells, A5+ ApoCells, nekrotisk celler, ApoBDs og rusk) ble identifisert og brukes til å velge ApoBD for FACS-baserte isolasjon. (a) membran permeabilised nekrose cellene blir separert fra ikke-permeabilised hendelser. (b) A5lav-middels, SSClav-høy cellene blir separert fra A5lav-høy hendelser. (b.i) For grundig analyse, til-POR-3lav levedyktige cellers kan skilles fra til-PRO-3Middels A5- tidlig ApoCells. (b.ii) Alternativt når bare beregne ApoBD renhet, levedyktige cellers kan skilles fra FSClav hendelser. (c) A5lav rusk utelates. (d) FSCMiddels/høy ApoCells er atskilt fra FSClav ApoBDs. (e) alle A5-til-PRO-3Middels/høy ApoBDs velges for sortering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 . Validering av THP-1 monocytt apoptose. Flyt cytometri analyse av ubehandlet eller UV-bestrålt THP-1 monocytter ble utført for å bestemme nivået av levedyktige cellers, A5- tidlige ApoCells, A5+ ApoCells, og nekrose celler.

Figure 4
Figur 4 . Rensing av THP-1 monocytt-avledet ApoBDs. Flyt cytometri analyse var utført på isolerte THP-1 monocytt-avledet ApoBDs via enten en FACS-basert eller differensiell sentrifugering basert tilnærming, viser anriking av ApoBDs fra levedyktig cellene, ApoCells og nekrose. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Siden tidlig beskrivelsen i 1950, har feltet apoptose avansert betydelig bli en fremtredende forskningsområde. Tross av bred interesse og omfattende arbeid, har visse aspekter av apoptose, spesielt dannelsen av ApoBDs, ikke blitt godt studert skyldes mangel på passende metoder. Disse inkluderer spesielt begrensning i å spore apoptose progresjon og ApoBD formasjon samtidig ved hjelp av den tradisjonelle flowcytometri A5/PI analyse og urenheter ApoBD isolasjon. Vi har nylig utviklet metoder for å løse disse metodologiske mangler.

Vår nye flyt cytometri analytisk tilnærming kan ApoBDs, som ofte er oversett bruke tradisjonelle analytiske metoder, kan oppdages og kvantifisert20. I tillegg endret dette flyt cytometri metoden, med bruk av flekken til-PRO-3, avslører en ekstra A5- apoptotisk stadium dermed gjengi bedre avgrensning av apoptose progresjon20. Konvensjonelt, ApoBD oppdagelsen har støttet seg tungt på bilde-baserte teknikker som AC confocal mikroskopi og histology, mens våre flyt cytometri metoden gir en høy gjennomstrømming tilnærming for å quantitate ApoBD formasjon. Men tilsynelatende komplekse, fremgangsmåten er relativt lett og krever bare kommersielt tilgjengelig reagenser og en grunnleggende flyt cytometer. Logisk gjenkjenning og presis kvantifisering av ApoBDs vil fremme kunnskap om apoptotisk celle microenvironment at dikterer celle klarering og immunologiske svar. Faktisk, ved å koble Her beskrives flyt cytometri metoden med organelle-spesifikke flekker, har vi nylig rapportert heterogene fordelingen av mobilnettet innholdet i ApoBDs24. Disse funnene tyder på at ApoBDs kan kategoriseres i ulike undergrupper, og hver ApoBD delsett kan ha ulike funksjoner.

Vår nylig utviklede ApoBD isolasjon teknikker vil også bidra til fremskritt innen ekstracellulære blemmer. Tradisjonelt kan differensial sentrifugering metodene som brukes for ApoBD isolasjon inneholde mye mindre celler, som kan påvirke nedstrøms funksjonelle analyser. Vår endret differensial sentrifugering tilnærming kan imidlertid brukes til å isolere ApoBDs til 97% renhet. Selv om høy renhetsgrad kan oppnås ved differensial sentrifugering, kan slik metode ikke være egnet for å isolere ApoBDs fra komplekse eksempler. I kontrast, våre FACS-basert metode kan berike ApoBDs til 99% renhet, og er basert på de unike biologiske egenskapene til ApoBDs inkludert partikkelstørrelse, tetthet og PtdSer eksponering, i stedet for å stole utelukkende på partikkel tetthet. Denne tilnærmingen har også potensial til å identifisere og isolere ApoBDs av ulike celle opprinnelse med celle type-spesifikk markører24samtidig. Til tross for en langvarig FACS prosedyre som kan ta 1-8 h avhengig av antall ApoBDs som kreves, vil nøyaktig ApoBD isolasjon og påfølgende nedstrøms analyse tillate direkte henvisning av molekylære egenskaper og funksjonelle rollene til ApoBDs. For slike metoder er det kritisk at ApoBD isolasjon tilnærminger er kombinert med teknikker som flowcytometri (som beskrevet her) for å validere både induksjon av apoptose og renhet av ApoBD-beriket prøven. Videre er riktig FACS definere avgjørende for ApoBD isolasjon via FACS-basert tilnærming, som en ustabil strøm eller feilaktig utført slipp forsinkelse kan føre lav renhet.

Kollektivt, har vi skissert cutting-edge metoder for kvantifisering apoptose induksjon, ApoBD oppdagelsen og isolering av svært ren ApoBDs. Vår tilnærming kan gi et nytt verktøy for å studere apoptotisk celle demontering prosessen og belyse rollen denne prosessen i sykdom innstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Health og Medical Research Council (GNT1125033 og GNT1140187) og australske forskningsråd (DP170103790) til I.K.H.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) ATCC -
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Penicillin-streptomycin mixture Life Technologies 15140122
FSC Gibco 10099-141
1x PBS - -
Annexin V FITC BD Bioscience -
TO-PRO-3 iodide Life Technologies T3605 TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact.
10x Annexin V binding buffer BD Bioscience 556454
EDTA Sigma-Aldrich 1001710526
Centrifuge tube (15 mL) Cellstar 188271
Microcentrifuge tube (1.5 mL) Sarstedt 72.690.001
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) - -
Centrifuge Beckman Coulter 392932
FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Diva 6.1.1 software BD Bioscience -
FlowJo 8.8.6 software - -
 UV Stratalinker 1800 Stratagene -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
  2. Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
  3. Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
  4. Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
  5. Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
  6. Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
  7. Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
  8. Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
  9. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
  10. Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
  11. Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
  12. Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
  13. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
  14. Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
  15. Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
  16. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
  17. Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  18. Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
  19. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
  20. Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
  21. Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
  22. Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
  23. Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
  24. Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
Gjenkjennings- og isolering av apoptotisk organer til høy renhet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).More

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter