Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لاستخدام biosensor كامل الخلية جرثومية اللاهوائية لتقييم المتغيرات البيئية المختلفة كيف تؤثر على التوافر الحيوي للزئبق، ومؤتمر نزع السلاح للبكتيريا في بيئات وصول.
Abstract
الزئبق (Hg) التوافر البيولوجي للميكروبات خطوة أساسية للسمية Hg الأحيائي في الشبكات الغذائية. التحولات الكادميوم (Cd) والتوافر الحيوي للبكتيريا مراقبة المبلغ الذي سوف تتراكم في محاصيل الأغذية الرئيسية. التوافر البيولوجي لهذه المعادن مرهون بهم انتواع في الحل، ولكن أكثر خاصة تحت ظروف وصول فيها زئبق هو ميثليته إلى مونوميثيلميركوري السامة (لميثيل) ومؤتمر نزع السلاح لا يزال قائما في رهيزوسفيري. كامل الخلية الميكروبية أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تعطي إشارة قابلة للقياس عند معدن يدخل في سيتوسول وبالتالي فهي أدوات مفيدة لتقييم المعادن التوافر البيولوجي. للأسف، حتى الآن كان مقيداً معظم بيوسينسينج الجهود للبيئات أوضاع مؤكسدة بسبب القدرة المحدودة للبروتينات مراسل موجود للدالة في غياب الأكسجين. في هذه الدراسة، نقدم جهودنا الرامية إلى تطوير وتحسين مقايسة biosensor كامل الخلية قادرة على أداء لاهوائيا التي يمكن الكشف عن المعادن تحت شرط وصول في الوقت شبه الحقيقي، وفي غضون ساعة. يصف لنا كيف يمكن أن تساعد بيوسينسور تقييم المتغيرات الكيميائية كيف ذات الصلة للدراجات البيئية تؤثر المعادن على التوافر البيولوجي. يشمل البروتوكول التالي أساليب (1) إعداد Hg ومعايير مؤتمر نزع السلاح في ظروف وصول، (2) إعداد بيوسينسور في غياب الأكسجين، (3) تصميم وتنفيذ تجربة لتحديد كيفية تأثير سلسلة متغير على التوافر البيولوجي زئبق أو مؤتمر نزع السلاح، و (4) لقياس وتفسير البيانات بيوسينسور. إظهار نطاقات الخطي أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، وتقديم الأمثلة التي توضح الأسلوب القدرة على التمييز بين المعادن من التوافر البيولوجي وسمية باستخدام سلالات كل المعادن إيندوسيبلي والتأسيسي.
Introduction
الزئبق (Hg) ملوثاً عالمياً وعلى التوافر البيولوجي لنيافة ميثيلاتينج الميكروبات هو الخطوة الأولى نحو التضخم الأحيائي لها من خلال الشبكات الغذائية والآثار السمية العصبية في الإنسان والحياة البرية1. ويعتقد حاليا أن مثلايشن Hg الميكروبية هي عملية داخل الخلايا التي تتطلب: ط) نوعا الزئبق يكون متوافراً بيولوجيا2،،من34،،من56،7 والثاني) للخلية لتكون قادرة على الناحية الفسيولوجية ميثيلاتينج Hg8،،من910. الكادميوم (Cd) تتراكم أحيائياً في الكائنات الحية، ولكن لا لا يتضخم أحيائياً في فودويبس، ويستخدم على نطاق واسع في العمليات الصناعية والتجارية التي تسبب التعرض الحاد يشيع في الناس و البيئة11. على الرغم من أن الميكروبات أدواراً رئيسية عدة في مصير الزئبق في البيئة، تركز معظم الدراسات على القرص المضغوط الكيمياء الجيولوجية وعلم السموم الإيكولوجية على حقيقيات النوى الميكروبية12. استهلاك المحاصيل الزراعية (مثل الأرز) هو المصدر الرئيسي للتعرض المباشر للكادميوم؛ في هذه الحالة، التوافر الأحيائي لمؤتمر نزع السلاح للميكروبات رهيزوسفيري يؤثر تأثيراً مباشرا المبلغ النباتات يمكن أن تتراكم13.
مسارات النقل Hg معقدة، وربما تنطوي نقل نشط خطوة14. عندما يتعلق الأمر نقل، العمل الأخيرة واقترح أن يستخدم الزئبقالثاني الزنكالثاني أو Mnالثاني الناقل7،15،،من1617. بينما القرص المضغوطالثاني هو الافتراض بنقلها بطريق الخطأ في سيتوسول من خلال مسارات النقل معدنية ديفالينت (لا سيما Mnالثاني أو الزنكالثاني)، نقل الآليات من القرص المضغوطالثاني داخل الخلايا تظل ممر النقل المضاربة، ولا مؤتمر نزع السلاح الخاصة قد حددت13،18. بغض النظر عن طبيعة الناقلين المشاركة، تحديد ثلاثة عوامل ميكانيكية في نهاية المطاف قدرة المعادن على إدخال خلية: ط) انتواع معدنية في الحل2،،من615، 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23، ثانيا) خصائص بيوفيسيوتشيميكال غشاء الخلية17،24،25،،من2627،28،29 ،،من3031، وثالثاً) القدرة على المعدن الوصول إلى موقع نقل7،32. مؤتمر نزع السلاح، والزئبق من غير المحتمل أن يوجد أيونات حرة تحت الشروط ذات الصلة فسيولوجيا الميكروبات بسبب ما تقارب عالية لحله العضوية هذه المسألة (DOM)، خالب الملوثات (مثل، يدتا)، أو تخفيض الكبريت مويتيس33، ،من 3435 (القرص المضغوطالثاني يمكن أن توجد حرة أيون أو شكل أيون-أزواج في غياب هذه يغاندس). وهناك نقص في أساليب فعالة في تحديد كيفية هذه الأنواع المعدنية أحيائياً في ظروف ذات صلة بمصيرهم في البيئة. على سبيل المثال، زئبق هو ميثليته تحت الظروف اللاهوائية14، والكادميوم والزئبق المعادن اللينة (أو فئة ب الكاتيونات)، التي تتطلب أن بهم انتواع التحقيق في الظروف التي تحافظ على سلامة المجموعات تخفيض الكبريت.
أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الميكروبية هي الخلايا البكتيرية التي تنبعث منها إشارة قابلة للقياس في استجابة لتركيزات المعادن، في هذه الحالة زئبق أو القرص المضغوط داخل الخلايا. على هذا النحو، وأدوات مثالية لفهم كيفية إدخال المعادن خلية36، شريطة أن يتم التحكم بعناية في ظروف التعرض ل. أجهزة استشعار العوامل البيولوجية Hg تحتوي عادة على اندماج الجينات بين الدوائر التنظيمية مير-مشغل (بما في ذلك الجينات ترميز للجهة المنظمة للنسخ ميرس فضلا عن المشغل ومروج المناطق لمشغل)، والإبلاغ عن الجينات (مثلاً، لوكس، والتجارة والنقل، وأمريكا اللاتينية والكاريبي الجينات). عند الزئبق موجود في السيتوبلازم، فإنه سيتم ربط ميرر، أسفر عن النسخ من جينات الإبلاغ والإشارات اللاحقة إنتاج19،37. صممت أجهزة استشعار العوامل البيولوجية مؤتمر نزع السلاح المحددة عادة استخدام كادك، كادك أو زنتا أو زنتر ترميز النسخ المنظمين38، ولكن تجدر الإشارة إلى أن مير لها صلة أقل، ولكن قابلة للقياس الكمي لمؤتمر نزع السلاح5. بسبب تقييد الهوائية معظم استخداماً البروتينات مراسل الإنارة أو الفلورسنت، حتى الميكروبية مؤخرا أجهزة استشعار العوامل البيولوجية ما زال غير قادر على تقديم رؤى في التحول الأحيائي للمعادن في ظروف وصول. وهذا يجعل الكشف عن المعادن التوافر البيولوجي اللاهوائي صعبة جداً أكثر من مجموعة من الظروف ذات الصلة لمصيرهم البيئية، على وجه التحديد حضور الأكسدة يغاندس حساسة (مثل كبريتيد وثيولس)4، 5 , 39.
للتخفيف من وطأة العيش عقبة المنهجية التصوير في غياب الأكسجين، دريبير et al. (2007) قد وضعت بروتين فلوري المستندة إلى فلافين (فبفب)، استناداً إلى مجال الجهد الأكسجين الخفيفة من البروتين SB2 من P. putida. هذا البروتين الأسرة غير قادرة على فلوريس في غياب الأوكسجين40. بناء على عمل دريبير et al., لدينا مختبر تصميم بيوسينسور اللاهوائية السماح لدراسة التوافر البيولوجي Hg ظروف أوضاع مؤكسدة ووصول وعلى نطاق واسع من الملوحة 17. في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية إعداد واستخدام في بيوسينسور لاختبار تأثير المتغيرات البيئية على التوافر البيولوجي زئبق أو القرص المضغوط. على الرغم من وضعنا في بيوسينسور لنيافةثانيا، لقد اخترنا القيام بتجارب مع القرص المضغوطالثاني كوسيلة استرعاء انتباه القارئ إلى حقيقة أن هذه الأجهزة قد تستجيب أيضا لعدة عوامل الإجهاد التي من المحتمل أن تحدث المشاركة في البيئة مصفوفات؛ وفي هذه الحالة كان التحقيق القرص المضغوطالثاني لأنه من المعروف أن ربط الهيئة التنظيمية النسخي ميرر5. هنا، نعرض المعايرة الممثل ونطاقات الخطية الفنية فيما يتعلق بأي معدن. نحن أيضا إعطاء مثال عندما تكون النتائج بيوسينسور قاطعة (مغالثاني و Mnالثاني عن التوافر الأحيائي Hg) وغير حاسمة (الزنكالثاني عن التوافر الأحيائي Hg).
Protocol
1-نمو وسائل الإعلام وإعداد وسائل الإعلام التعرض
- جعل 250 مل من متوسط النمو:
ملاحظة: إذا كان الفعل تعد العناصر النزرة #1 الحل و الحل #2 العناصر النزرة ، انتقل إلى الخطوة 1.1.5.- إعداد حل العناصر النزرة #1 في دورق حجمي نظيفة (200 مل) تحتوي على مولاريتيس النهائي من 1.5 × 10-3 "م غ"2مو4، 6.5 × 10-4 "نا م"2كبار المسئولين الاقتصاديين4، 5 × 10-3 "ح م"3بو 3ومن هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M.
تنبيه: أسس قوية (هيدروكسيد الصوديوم) المسببة للتآكل. تجعل من المؤكد عندما يزن الكواشف لضمان أن molarity النهائي يمثل العناصر النزرة الرئيسية؛ مو، سراج الدين، و b - تحت حقل معقمة، وتعقيم عامل التصفية استخدام عامل تصفية حقنه بولييثيرسولفوني مكم 0.22 في زجاجة بلاستيكية نظيفة/معقم/تترافلوروايثيلين (PTFE).
- إعداد الحل #2 العناصر النزرة في قارورة نظيفة حجمي (200 مل) تحتوي على مولاريتيس النهائي منسو 0.01 م4، 5 × 10-4 "زنسو م"4، 3.25 x 10-3 "كوكل م"2، 6.25 × 10-3 "م نيكل" 2، و 0.1 م ح2حتى4.
تنبيه: الأحماض القوية (ح2هكذا4) هي المسببة للتآكل. تجعل من المؤكد عندما يزن الكواشف لضمان أن molarity النهائي يمثل العناصر النزرة الرئيسية؛ مينيسوتا، الزنك، أول أكسيد الكربون، والمؤسسات الوطنية. - تحت حقل معقمة، وتعقيم تصفية استخدام عامل تصفية حقنه بولييثيرسولفوني مكم 0.22 في زجاجة زجاج نظيفة.
- تحت حقل عقيمة، في زجاجة زجاج نظيفة/العقيمة (الحد الأدنى 250 مل)؛ إضافة 200 مل من الماء عالي النقاوة، مل 42.5 من M9 أملاح الحد الأدنى (5 x؛ انظر الجدول للمواد)، 2.5 مل 2 م الجلوكوز، ميليلتر 125 م 2 MgSO4، 1200 ميليلتر من 0.6 متر الثيامين HCl من قاسمة (˚C-20) مجمدة، 1.25 مل نانو متر 43 ، 770 ميليلتر من 0.075 M L-ليوسيني/L-آيسولوسين/الحل فالين 250 ميليلتر العناصر النزرة #1، 250 ميليلتر تتبع عنصر #2و 250 ميليلتر من 0.01 م يدتا الصوديوم الملح.
ملاحظة: ينبغي أن تعد جميع الكواشف في خطوة 1.1.5 المسبقة وتصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حقنه بولييثيرسولفوني 0.22 ميكرومتر. يجوز تعقيم المياه عالي النقاوة استخدام اﻷوتوكﻻف. - تأخذ زجاجة الآن تحتوي على حل من خطوة 1.1.5. وفضفاضة في آب والتنقل من خلال قفل الهواء الدائرة اللاهوائية .
- في قاعة اللاهوائية، إضافة 15 ميليلتر من م 0.225 FeSO4 في 0.2 م ح2حتى4، كاب زجاجة محكم، ويهز حتى تختفي جميع رواسب بيضاء.
ملاحظة: ينبغي أن تعد جميع الكواشف في خطوة 1.1.7 المسبقة وتصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حقنه بولييثيرسولفوني 0.22 ميكرومتر. تخزين FeSO 0.225 م4 في 0.2 م ح2حتى4 في الدائرة اللاهوائية. - إزالة غطاء من زجاجة، انتظر دقيقة للهواء لتبادل، واستبدال الغطاء من زجاجة، ومن ثم هزة بقوة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
- ربط غطاء محكم على الزجاجة وإزالة من الدائرة اللاهوائيةوتخزين زجاجة في الثلاجة (4 ˚C) حتى الاستخدام.
- يجب أن يكون متوسط النمو مجدد مرة واحدة في أسبوع بتكرار الخطوات من 1.1.5 إلى 1.1.9.
- إعداد حل العناصر النزرة #1 في دورق حجمي نظيفة (200 مل) تحتوي على مولاريتيس النهائي من 1.5 × 10-3 "م غ"2مو4، 6.5 × 10-4 "نا م"2كبار المسئولين الاقتصاديين4، 5 × 10-3 "ح م"3بو 3ومن هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M.
- لجعل 100 مل من التعرض المتوسطة في 2 × 50 مل أنابيب الطرد المركزي البوليبروبيلين العقيمة المخروطية:
ملاحظة: نوصي بأن التعرض المتوسطة أن أعد اليوم من تحليل التعرض التقليل من مخاطر التلوث، ومع ذلك فإنه يمكن إجراء في وقت مبكر وتخزينها في الثلاجة.- إضافة أنبوب الطرد المركزي في الدائرة اللاهوائية، لكل 50 مل 42 مل من الماء عالي النقاوة اللاهوائية، 350 ميليلتر من 1 م الصوديوم بيتا-جيلسيروفوسفاتي من قاسمة مجمدة (˚C-20)، 2 مل 1 م اجتماعات مجانية حمض، 50 ميكروليتر من 1 م (NH4)2حتى4 ، 125 ميكروليتر من الجلوكوز م 2 و 300 ميكروليتر من كوه 2.5 م 200 ميكروليتر من 2.5 م هيدروكسيد الصوديوم.
ملاحظة: ينبغي أن تعد جميع الكواشف في خطوة 1.2.1 المسبقة وتصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية حقنه بولييثيرسولفوني 0.22 ميكرومتر. قد يكون الماء عالي النقاوة تعقيمها باستخدام اﻷوتوكﻻف الحرارة. 2.5 يجب تخزين هيدروكسيد الصوديوم متر و 2.5 متر هيدروكسيد الصوديوم في زجاجات بلاستيكية/PTFE. يجب أن يتم تخزين كافة الكواشف المدرجة في الدائرة اللاهوائية ما عدا الصوديوم بيتا-جيلسيروفوسفاتي، الذي يجب أن يتم تخزين في ثلاجة (˚C-20). وبصفة عامة، أنها ممارسة جيدة لمغادرة جميع أجزاء من البلاستيك أو الزجاج والحاويات لعدة أيام في قاعة اللاهوائية لضمان بقاء أي آثار للأوكسجين. - كاب أنابيب الطرد المركزي 50 مل ويهز جيدا، وإزالة قاسمة 10 مل لقياس درجة الحموضة. ويجب قياس درجة الحموضة يقاس هذا التعرض لوسائل الإعلام دائماً 7.00 ± 0.02 في 25 ˚C. إذا كان عدم قياس درجة الحموضة داخل هذا النطاق، إعادة ضبط حجم 2.5 م وأضاف كوه لتصحيح هذا.
ملاحظة: ابدأ تيتراتي الحل لتصحيح الرقم الهيدروجيني مع تحقيق درجة حموضة. المسابر الأس الهيدروجيني تمثل مصدرا للتلوث التعرض المتوسطة. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني دائماً منتج من الكواشف المضافة في الخطوة 1.2.1.
- إضافة أنبوب الطرد المركزي في الدائرة اللاهوائية، لكل 50 مل 42 مل من الماء عالي النقاوة اللاهوائية، 350 ميليلتر من 1 م الصوديوم بيتا-جيلسيروفوسفاتي من قاسمة مجمدة (˚C-20)، 2 مل 1 م اجتماعات مجانية حمض، 50 ميكروليتر من 1 م (NH4)2حتى4 ، 125 ميكروليتر من الجلوكوز م 2 و 300 ميكروليتر من كوه 2.5 م 200 ميكروليتر من 2.5 م هيدروكسيد الصوديوم.
- إعداد حل أسهم 5-10 ملم نانو3 وترك في الدائرة اللاهوائية لاستخدامها خلال فترة التعرض للمقايسة.
ملاحظة: أنه من الأسهل تمييع معيار3 نانو الابتدائي أكثر تركيزاً بدلاً من صنع مم 5-10 نانو3 المعيار الأساسي.
2-إعداد معايير الكادميوم والزئبق.
- إعداد حل Mercuric (Hgالثاني) 4-8 ميكرومتر في 0.2 م ح2هكذا4.
- إعداد معيار زئبق2 + بجعل ميليمولار (1-10 مم) هجكل2، هنو3 أو4 هجسو الحل في 0.2 م ح2هكذا4.
تنبيه: الزئبق شديدة السمية وح2حتى4 التآكل. وتعمل في أغطية الدخان مع كل ما يلزم من معدات الحماية الشخصية. - في زجاجة PTFE، وتمييع المعايير من 2.1.1. إلى 0.2 م ح2هكذا4 للحصول على تركيز داخل النطاق من 4-8 ميكرومتر Hg2 +.
ملاحظة: يجب أن يكون الحامض تستخدم التحليلية الصف ح2حتى4. - أن تركيز الزئبق من 2.1.2 ينبغي التحقق من صحة استخدام محلل الزئبق (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: يمكن استخدام أساليب أخرى للتحقق من أن تركيز الزئبق.
- إعداد معيار زئبق2 + بجعل ميليمولار (1-10 مم) هجكل2، هنو3 أو4 هجسو الحل في 0.2 م ح2هكذا4.
- إعداد مكم 10 Cd الحلالثاني في 10 ملم ح2هكذا4.
- إعداد معيار أساسي (10-50 ملم على نطاق لموازنة دقيقة من مسحوق) كدكل2 في 0.1 م ح2هكذا4.
- في سلسلة من تخفيف المسلسل في تنظيف حمض مشطوف 20 مل تواجه قنينة زجاج البورسليكات مع الأسود الأغطية اللولبية الفينولية مع السليكوون بطانات المطاط، وتمييع القياسية من 2.2.1 إلى 10 ميكرون Cd2 +. تأكد من أن تركيز ح2حتى4 في كل تمييع المسلسل لاحقة يبقى 10 ملم.
3-إعداد بيوسينسور مقايسة التعرض اللاهوائية
- لوحة بيوسينسور إيندوسيبلي الزئبق (هاء القولونية NEB5α تأوي PUC57merR-بفبفب) و biosensor أعرب مؤثرا (هاء القولونية NEB5α تأوي PUC19Balch-بفبفب) من-80 ˚C كريوستوك على لوحات "مرق ليسوجيني" التي تحتوي على 120 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. انظر عملنا المنشورة سابقا للحصول على التفاصيل المتعلقة بإنتاج هذه أجهزة استشعار العوامل البيولوجية17.
- الساعة 04:30-05:00 م، تطعيم ثقافة في 10 مل من رطل (+ أمبير) وتنمو بين عشية وضحاها.
ملاحظة: بدءاً من لوحة فإنه يأخذ يومين لإعداد ثقافة اللاهوائية المقايسة التعرض (أي ثقافة بدأت بعد ظهر اليوم الاثنين (04:30-05:00 م) سيكون جاهزاً المقايسة التعرض في حوالي ظهر اليوم الأربعاء). الخطوات التالية هي التقنيات الميكروبيولوجية المطلوبة اللازمة لإعداد الثقافات اليوم من الإنزيم التعرض.- تأخذ مستعمرة واحدة من ثقافة اللوحة وإضافة إلى 10 مل مرق ليسوجيني (رطل) مع 21 ميليلتر من حل الأسهم 100 مغ/مل من ملح الصوديوم الأمبيسلّين (التركيز النهائي 210 ميكروغرام/مل أمبير) في أنبوب ثقافة عقيمة.
- وضع الثقافة في حاضنة/شاكر وتنمو بين عشية وضحاها في ˚C +37 مع الهز 220 لفة في الدقيقة.
- في صباح اليوم التالي في الساعة 9-10، ريسوسبيند الثقافة وتنمو لاهوائيا طوال اليوم (20% العدوى).
- إدخال الثقافة من الحاضنة (الخطوة 3.2.1) و المتوسطة النمو (الخطوة 1.1.9) في الدائرة اللاهوائية.
- إضافة 8 مل الطازجة المتوسطة النمو والامبيسلين (210 ميكروغرام/mL) في أنبوب بالش عقيمة.
- جمع 2 مل من ثقافة نمت بين عشية وضحاها ونقل إلى 2 مل أنبوب ميكروسينتريفوجي. الطرد المركزي في 10,000 التعاون الإقليمي خطوة لمدة 90 ثانية، وتفريغ المادة طافية وريسوسبيند في 2 مل من الطازجة المتوسطة النمو. إضافة ثقافة ريسوسبينديد بالش الأنبوبة التي تحتوي على 8 مل الطازجة المتوسطة النمو والامبيسلين.
- باستخدام تقنية معقمة، بعناية وضع سداده مطاطية على أنبوب بالش. إزالة من الدائرة اللاهوائية ومكان في حاضنة/شاكر وتنمو لاهوائيا حتى 3-05:00 م في +37 ˚C مع الهز 220 لفة في الدقيقة.
- بين 3 و 05:00 م، تؤدي العدوى اللاهوائية 1% إلى الطازجة المتوسطة النمو وتنمو بين عشية وضحاها.
- إحضار أنبوب بالش (الخطوة 3.3.4) إلى الدائرة اللاهوائية جنبا إلى جنب مع النمو المتوسطة. إضافة 100 ميليلتر للثقافة إلى 10 مل من الطازجة المتوسطة النمو (العدوى 1%) مع أمبير (210 ميكروغرام/مل أمبير) في أنبوب بالش عقيمة.
- باستخدام تقنية معقمة، بعناية وضع سداده مطاطية على أنبوب بالش. إزالة من الدائرة اللاهوائية، طرأت حاضنة/شاكر، وتنمو بين عشية وضحاها في ˚C +37 مع الهز 220 لفة في الدقيقة.
- بين 9 و 10:00 ص، ريسوسبيند ثقافة تنمو لاهوائيا طوال اليوم (20% العدوى).
- إدخال الثقافة من الحاضنة (الخطوة 3.4.1) و المتوسطة النمو (الخطوة 1.1.9) في الدائرة اللاهوائية.
- إضافة 8 مل من الأمبيسلّين (210 ميكروغرام/مل أمبير) و المتوسطة النمو في أنبوب بالش عقيمة.
- جمع م 2 الثقافة نمت بين عشية وضحاها ونقل إلى 2 مل أنبوب ميكروسينتريفوجي. الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 90 ثانية وتفريغ المادة طافية، وريسوسبيند في 2 مل من الطازجة المتوسطة النمو. إضافة ثقافة ريسوسبينديد بالش الأنبوبة التي تحتوي على 8 مل الطازجة المتوسطة النمو والامبيسلين.
- باستخدام تقنية معقمة، بعناية وضع سداده مطاطية على أنبوب بالش. إزالة من الدائرة ومكان في حاضنة/شاكر وتنمو لاهوائيا في ˚C +37 مع الهز 220 لفة في الدقيقة.
- رصد نمو ثقافة استخدام جهاز المطياف الضوئي (الخطوة 3.5.4) حتى يتم التوصل إلى OD600 من 0.6 . من المؤكد أن الثقافة دوامة قبل كل OD القراءة.
ملاحظة: هذه الخطوة تستغرق 3-4 ساعات، وينبغي إعداد متوسطة التعرض (الخطوة 1، 2) خلال هذا الوقت، فضلا عن تحليل التعرض (الخطوة 4، 1). - تتوقف عن النمو عندما تصل إلى الثقافة OD600 من 0.6 (هو) (3-4 ساعات من المتوقع نمو).
- إحضار أنبوب في الدائرة اللاهوائية (الخطوة 3، 6) ونقل الثقافة إلى 2 x 2 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب. الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 90 ثانية وتفريغ المادة طافية، وريسوسبيند في 2 x 2 مل من الطازجة المتوسطة التعرض.
- كرر الخطوة الغسيل 3.7.1. مرة واحدة لإزالة أي أثر المتوسطة النمو.
- الجمع بين كلا أنابيب ميكروسينتريفوجي خلية الثقافة (الخطوة 3، 7) إلى 7 مل PTFE قنينة قياسية للحصول على الأسهم بيوسينسور لاستخدامها في تحليل التعرض (الخطوة 4).
ملاحظة: يجب التأكد من مزج الأسهم بيوسينسور بيبيتينج تماما بعد بلطف ذهابا وإيابا قبل الاستخدام. أن يكون مؤقتاً الأسلوب هنا لما يصل إلى ساعة.
4-التعرض للفحص
- تصميم تخطيط لوحة.
ملاحظة: تأكد من بيبيتينج جميع القيم المحسوبة والأرصدة التي أعدت قبل البدء الإنزيم التعرض. كيف للتصميم بشكل صحيح تجربة، وما هي الضوابط لتشمل هو مفصل في النص. وبالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي أن تبدأ التجربة إذا كان هناك أكسجين في قاعة اللاهوائية المبينة على الشاشة اللاهوائية.- تصميم تخطيط اللوحة وفقا لقالب جيدا 96. لتشغيل التجارب في replicates التقنية من 3، سيسمح لعلاجات مختلفة 32، الذي يمثل أفضل شبكة 4 × 8 لإعداد قنينة (انظر الشكل 1).
الشكل 1: 96 لوحة جيدا (على اليسار) وشبكة 4 × 8 مقابلة التي تحتوي على PTFE زجاجة (يمين) لنقلها إلى اللوحة- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ملاحظة: عند اختبار لدور متغير على امتصاص الزئبق مع العلاجات بيوسينسور إيندوسيبلي الزئبق؛ اثنين مطلوبة لكل متغير: العلاج (Hg + بيوسينسور + نترات، متغير) و معاملة فارغة (بيوسينسور + متغير + نترات). عند اختبار لدور متغير في فسيولوجيا الخلية biosensor التأسيسي، باستخدام المعالجتين المطلوبة لكل متغير: العلاج (Hg + بيوسينسور + نترات، متغير) و العلاج ( فارغة بيوسينسور + متغير + Hg). يمكن الاستعاضة عن الزئبق بالكادميوم. زئبق أو مؤتمر نزع السلاح سوف تصبح المتغير عند إجراء منحنى معايرة. التأسيسي و إيندوسيبلي لا تحتاج أجهزة استشعار العوامل البيولوجية ليتم تشغيلها في نفس الوقت (في نفس تخطيط لوحة). مثال قالب تخطيط لوحة وشبكة 4 × 8 المقابلة عند اختبار تركيز يتراوح من المغنيسيوم (متغير) ويرد في الجدول 1).
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| أ | Hg المستحث بيوسينسور + + + نترات الزئبق مم 0 ملغ | Hg الناجمين عن نترات + بيوسينسور + 0 مم مغ | بيوسينسور التأسيسي + + + نترات الزئبق مم 0 ملغ | بيوسينسور التأسيسي + زئبق ملم 0 ملغ | ||||||||
| ب | الناجم عن الزئبق Hg + بيوسينسور + نترات + مم 0.1 مغ | Hg الناجمين عن نترات + بيوسينسور + مم 0.1 مغ | بيوسينسور التأسيسي + Hg + نترات + مم 0.1 مغ | بيوسينسور التأسيسي + Hg مم 0.1 مغ | ||||||||
| ج | الزئبق الناجم عن بيوسينسور + + + نترات زئبق ملم 1 ملغ | Hg الناجمين عن 1 مم مغ + بيوسينسور + نترات | بيوسينسور التأسيسي + + + نترات زئبق ملم 1 ملغ | بيوسينسور التأسيسي + Hg mM 1 ملغ | ||||||||
| د | الزئبق الناجم عن بيوسينسور + + + نترات زئبق ملم 10 ملغ | Hg المستحث ملم 10 ملغ + بيوسينسور + نترات | بيوسينسور التأسيسي + + + نترات زئبق ملم 10 ملغ | بيوسينسور التأسيسي + زئبق ملم 10 ملغ | ||||||||
| ه | ||||||||||||
جدول 1: مثال لوحة تخطيط باستخدام في بيوسينسور لاختبار زئبق التوافر البيولوجي (5 نانومتر) عبر رج المغنيسيوم (0-10 مم)
- قم بإعداد الشبكة 4 × 8 وفقا لتخطيط اللوحة المقايسة.
- ضع 7 مل PTFE قنينات موحدة في الدرج.
ملاحظة: ينبغي أن تكون قارورة PTFE حمض تغسل/الحرارة أن تعقيمها قبل الاستخدام. إلا ينبغي أن تعالج قنينات التلاعب خارج القنينة. - لكل قنينة، إضافة إلى حجم التعرض المتوسطة المقابلة لكل معاملة.
ملاحظة: في تعرض مع إجمالي حجم 2,000 ميليلتر (2 مل)، وأضاف التعرض المتوسطة ستكون: ميليلتر المتوسطة التعرض = ميليلتر 2,000 – ميليلتر (فارغة) في المعاملة . (مثل التعرض ميليلتر متوسطة = 2,000 – 100 ميليلتر (biosensor) – ميليلتر (نترات) 40 – 100 ميليلتر (Hg ) – 100 ميليلتر (متغير (مثلاً، مجسو4)) = ميليلتر 1660). تأكد من أن وحدة التخزين إضافة متغير اختبار لا يتجاوز 5% (100 ميليلتر) وحدة التخزين النهائي. - لكل قنينة، إضافة إلى حجم المقابلة لحل المتغير الكيميائية لفحصها وفقا لتخطيط لوحة.
- من الخطوة 1، 3، إضافة نترات لكل قنينة بحيث يكون التركيز النهائي 200 ميكرومتر (40-80 ميليلتر). استبعاد هذه الخطوة biosensor التأسيسي علاجالفراغات.
- من خطوة 2.1 أو 2.2، إضافة زئبق (5 نانومتر عند اختبار لمتغير) أو القرص المضغوط (300 نانومتر عند اختبار لمتغير) للقنينات وفقا لتخطيط لوحة. استبعاد هذه الخطوة الزئبق بيوسينسور إيندوسيبلي معاملة الفراغات.
- عند استخدام الزئبق، تتخذ الأسهم 4-8 ميكرومتر ويهز جيدا. تمييع الحل في التعرض المتوسطة في قنينة PTFE 7 مل إلى 100-250 نيوتن متر القيام بعمل الحل Hg. من هذا الحل العامل إضافة الزئبق إلى قارورة المطلوبة. في هذه الحالة منحنى معايرة من الزئبق تتراوح من 0 إلى 12.5 شمال البحر الأبيض المتوسط.
ملاحظة: عند اختبار تأثير متغير على التوافر البيولوجي زئبق أو قرص مضغوط، تأكد من أن [Hg] أو [مؤتمر نزع السلاح] لا تزال مستمرة عبر جميع العلاجات. عند إضافة زئبق أو قرص مضغوط، تأكد من استخدام تلميح ماصة واحد ولكن لا تلمس المتوسطة التعرض في القنينات.
- عند استخدام الزئبق، تتخذ الأسهم 4-8 ميكرومتر ويهز جيدا. تمييع الحل في التعرض المتوسطة في قنينة PTFE 7 مل إلى 100-250 نيوتن متر القيام بعمل الحل Hg. من هذا الحل العامل إضافة الزئبق إلى قارورة المطلوبة. في هذه الحالة منحنى معايرة من الزئبق تتراوح من 0 إلى 12.5 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- ضع 7 مل PTFE قنينات موحدة في الدرج.
- هزة في حركة مدارية يدوياً.
ملاحظة: التجربة قد يكون مؤقتاً الآن اعتماداً على الوقت اللازم للزئبق أو القرص المضغوط إلى سبيسياتي في الحل. إذا تركت لأكثر من ساعة، وضع قبعات PTFE على قارورة PTFE لمنع تبخر/التلوث. - بلطف "الماصة؛" الأسهم Biosensor ذهابا وإيابا لضمان التجانس. إضافة 100 ميليلتر الأوراق المالية بيوسينسور لكل قنينة. يهز أوربيتالي يدوياً.
- إعداد القارئ لوحة الحارة إلى قراءة مع المعايير التالية: درجة الحرارة في 37˚C، الحركية تشغيل لما يلي في ما بين 10 ساعات مع كل 2.5-5 دقائق مع الهز المداري على ما يلي، وقياسات الأسفار مع الإثارة الأسفار من 440 نانومتر و انبعاثات 500 نانومتر.
- "الماصة؛" 200 ميليلتر من كل قنينة PTFE في الشبكة 4 × 8 في الآبار المقابلة للوحة جيدا 96 (واضحة الأسود، 96-جيدا-أسفل الفلسطنيين ميكروبلاتيس السطحية). "الماصة؛" ذهابا وإيابا 5 مرات قبل نقل كل 200 ميليلتر.
ملاحظة: بدلاً من تجاهل نصيحة ماصة، ترك تلميح ماصة في القنينة PTFE لتتبع التقدم بيبيتينج. - ضع لوحة جيدا 96 في العلبة للقارئ لوحة، ثم ضع الغطاء على اللوحة جيدا 96 وتبدأ الفحص.
5-التحديد الكمي للبيانات
- الأسفار لكل معاملة في كل نقطة الوقت يجب تصحيح لكل الضوضاء جيدا الفردية ومموها معاملة فارغة.
- يجب أن تترجم الأسفار لكل نقطة في الوقت (t) لكل معاملة (T) إلى حساب للأسفار الأولى (t0) للمرة الأولى نقطة لكل بئر، وبلغ متوسط ثم عبر 3 علاجات يتطابق (ص1-ص3 ). ثم يجب أن يكون مموها هذا العلاج المتوسط متوسط معاملة فارغة (السل) ترجمة بنفس الطريقة (المعادلة 1).
ومضان (t) = متوسط(تيr1(تي) -t0 رr1()، تيr2(تي) – تيr2 (ر0)،تي تيr3() -t0 رr3()) – متوسط(السل r1 (تي) -t0 السلr1()،ر السلr2()–( من السلr2 t0 )، السلr3(تي) -t0 السلr3()) (1)
ملاحظة: هذا ينبغي اعتبارها وظيفة جدول بيانات. وينبغي أيضا حساب النشر الصحيح من الخطأ لكل نقطة في الوقت.
- الرسم البياني fluorescence المصححة لكل معاملة كدالة للزمن
رقم 2: تصحيح البيانات الأسفار كدالة للزمن. الأسفار تقاس كوحدات fluorescence النسبي (رفو) المنبعثة من NEB5α كولاي إيواء pUC57merR-Pp (سلالة إيندوسيبلي) على مر الزمن بالإضافة إلى Hgالثاني (0-12.5 nM) تحت الظروف اللاهوائية. الأسفار بمتوسط 3 التقنية وإنشاء نسخ متماثلة في 37 ˚C. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ملاحظة: ليس هناك 0 نانومتر Hg قيمة على الرسم البياني، وقد كان مموها جميع تركيزات الزئبق الأخرى إلى 0 نانومتر Hg معاملة فارغة. ولذلك 0 نانومتر Hg يمثل المحور x وأي الأسفار إيجابي يمثل الأسفار من الزئبق نظراً لأي متغير. اختياري فارغة لا الأسفار بهذه الطريقة، ولكن منحنيات الفلورسنت سيعطي مضللة fluorescence المنحنيات إذا كان المتغير اختبار fluorescence الخلفية (أي العضوية الذائبة نفسها سوف فلوريس، وإذا كان هناك لا العلاج الفارغة التي تحتوي على الخلايا فقط والمواد العضوية المذابة، زيادة تركيز المواد العضوية المذابة سوف تزيد الإشارات الفلورسنت).
- التحديد الكمي لذروة الأسفار. سوف تحدث عادة في ذروة فلورية القابلة للقياس الكمي بعد 2.5-4 ساعات، تمثل الطاقة المنفقة من استهلاك كل من 200 ميكرومتر نترات كما يقبلون إلكترون المحطة طرفية. هذه الذروة ينبغي تحديده كمياً ويمثل قيمة الأسفار النهائي أن محددة من العلاج.
ملاحظة: في حال لا ذروة الأسفار ويلاحظ (أي لا التوافر البيولوجي Hg)، fluorescence المعاملة عند نقطة وقت الذروة الأسفار لعنصر التحكم (أي لا متغير المضافة أو زئبق 5nM) ينبغي أن يكون كمياً. بدلاً من ذلك، إذا كان هناك تحريض fluorescence في العلاج، ولكن لا تنتج fluorescence ذروة محددة تحديداً جيدا، وهناك احتمال تلوث يقبلون الإلكترون تقارب أعلى مثل س2 والتدابير الواجب اتخاذها لإزالة آثار يجب أن يتم الأوكسجين من جميع الحلول والتجربة مرة أخرى.
Representative Results
مرة واحدة على قمم الأسفار التي تم كمياً وفقا للخطوة 5.3، يمكن رسوم بيانية نتيجة لقمم fluorescence طبقاً لتركيز المتغيرات التي توضح كيفية تأثير هذا المتغير على التوافر البيولوجي النسبي للزئبق أو القرص المضغوط. على سبيل المثال، سوف تسفر عن منحنى المعايرة للأسفار على مدى [Hgالثاني] من الشكل 2 إيندوسيبلي البيانات المعروضة في الشكل 3 ألف. لنيافةثانيا المعايرة، إرادة منحنى دائماً تحتوي على 3 عناصر لسلالة إيندوسيبلي الزئبق؛ استجابة الحد الأدنى من حوالي 1-2 نانومتر Hgالثاني قبل إنتاج إشارة fluorescence تناسبا خطيا إلى [Hgالثاني]، مجموعة الخطي حيث 5 نانومتر Hgالثاني سوف يكون موثوق بها دائماً في وسط هذا النطاق، وهضبة فيها لم يعد ستزيد زيادة [Hgالثاني] إشارة الأسفار. أي تغيير في إنتاج إشارة عن سلالة التأسيسي يبين أن السمية من [Hgالثاني] لا يؤثر على إنتاج إشارة. القرص المضغوطالثاني في الشكل 3B، هناك دائماً المكونات 2 لسلالة إيندوسيبلي؛ مجموعة خطي فيها 200-300 نانومتر القرص المضغوطالثاني ستكون موثوق بها دائماً في وسط النطاق الخطي وهضبة. يظهر انخفاض في الأسفار إشارة مع زيادة [القرص المضغوطالثاني] أن تركيزات أعلى من القرص المضغوط سامة للخلايا، ويمكن أن يفسر انخفاض في إنتاج إيندوسيبلي fluorescence بعد الهضبة في شمال البحر الأبيض المتوسط 1000 القرص المضغوطالثاني. ولذلك، عند اختبار التوافر البيولوجي زئبق أو مؤتمر نزع السلاح فيما يتعلق بمتغير البيئة، فإننا نقترح استخدام 5 نانومتر لنيافةالثاني و 300 نانومتر لمؤتمر نزع السلاحالثاني.
في بعض الحالات، إنتاج إشارة بشكل صحيح ويعزى إلى التوافر البيولوجي زئبق أو مؤتمر نزع السلاح، ولكن في حالات أخرى، يمكن أن تتأثر إنتاج إشارة بالتباين في الدولة المضيفة خلية biosensor الفسيولوجية (مثل المعادن ذات الأهمية أو الظروف البيئية التي اختبرت السامة). في الشكل 4A، تم اختبار 5 التوافر البيولوجي Hg شمال البحر الأبيض المتوسط عبر رج الزنك (0-10 ميكرومتر). في كل زئبق إيندوسيبلي وسلالات التأسيسي، هناك انخفاض مماثل في إشارة مع زيادة تركيزات الزنك. ولذلك، لا تميز أحد عما إذا كانت الإشارة ناتج عن انخفاض التوافر البيولوجي أو نتيجة للسمية الزنك. في الشكل 4 باء وجيم 4، تم اختبار 5nM Hg التوافر البيولوجي عبر رج مغثانيا (0-10 مم) والثاني مينيسوتا (0-10 ميكرومتر). زيادة مغ انخفضت تركيزاتالثاني الثاني والمليون إشارة الأسفار من سلالة إيندوسيبلي. من ناحية أخرى، لم تظهر سلالة التأسيسي انخفاض في الأسفار مع زيادة مغ تركيزاتالثاني الثاني والمنغنيز (مغالثاني والمليونالثاني مفيدة للخلايا في إنتاج فبفب، كما يتبين من زيادة في إشارة الأسفار). وهذا يدل على أن الخلايا قابلة للبقاء والنقصان الأسفار من سلالة إيندوسيبلي Hg ناجم عن انخفاض التوافر البيولوجي Hg. هذه البيانات تؤكد كم مهم لجميع فحوصات biosensor أيضا توفير قياسات التأسيسي العام خلية اللياقة.
الشكل 3: النطاقات الخطي من بيوسينسور مع الزئبق والكادميوم- الأسفار أقصى تقاس الأسفار النسبية وحدات (رفو) ± الانحراف المعياري 1 المنبعثة من NEB5α كولاي إيواء pUC57merR-Pp (Hg-إيندوسيبلي) وصفحة pUC19Balch (كونستيتوتيفي) بالإضافة إلى A) Hgثانيا (0-15 نانومتر) و ب) القرص المضغوطالثاني (0-1,000 nM) تحت الظروف اللاهوائية. الأسفار بمتوسط 3 التقنية وإنشاء نسخ متماثلة في 37 ˚C. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مثال على نتيجة غير حاسمة مع الزنك ونتيجة نهائية مع المغنيسيوم والمنغنيز. الأسفار أقصى تقاس الأسفار النسبية وحدات (رفو) ± الانحراف المعياري 1 المنبعثة من NEB5α كولاي إيواء pUC57merR-Pp (Hg-إيندوسيبلي) وصفحة pUC19Balch (كونستيتوتيفي) بالإضافة إلى A) الزنكثانيا (0-10 ميكرومتر)، ب) مغثانيا (0-10 ملم)، و ج) Mnالثاني (0-10 ميكرومتر) تحت الظروف اللاهوائية. تم تعيين [Hgالثاني] إلى 5 نانومتر لكل العلاجات والأسفار وكان متوسط 3 replicates التقنية في 37 ˚C. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الميكروبية هي أدوات مفيدة لتحديد الآليات التي تتفاعل الفلزات مع الميكروبات. هنا، يمكننا وصف أسلوب التي يمكن قياس لاهوائيا Hg التوافر البيولوجيالثاني الثاني ومؤتمر نزع السلاح إلى الخلية المضيفة الغرام (كولاي) وتعطي نتيجة قابلة للقياس في غضون ساعات قليلة. واحدة من نقاط القوة الرئيسية في هذا البروتوكول هو أنه يتيح مراقبة واسعة النطاق من المعادن انتواع في الأجلين المتوسط والتعرض عن طريق تجنب يغاندس ملزمة قوية أو المكونات التي قد تؤدي إلى هطول الأمطار معدنية. تم على غرار انتواع معدنية واختبارها في هذا التعرض المتوسطة استخدام فريقك17، لكن قد يتم نشر البرمجيات انتواع معدنية أخرى. في حالة لا يغاندس المضافة، زئبق انتواع من المتوقع أن تكون موجودة ك Hg(OH) 97%2 و 3% زئبق (NH3)22 +، بينما سيكون انتواع القرص المضغوط حاليا ك 59% مؤتمر نزع السلاح--β-جليسيروفوسفاتي و 25% Cd2 +و 16% كدسو4. استخدام برمجيات نمذجة الحرارية بسيطة، يمكن للمستخدم تصميم وسائط التعرض واختبار للتوافر البيولوجي المعادن ذات الأهمية. وبالإضافة إلى ذلك، الخلية المضيف بيوسينسور (NEB5αكولاي ) قابلة للتطبيق على طائفة واسعة من الأس الهيدروجيني (5-8.5) وتركيز كلوريد الصوديوم (0-0.55 م)17.
مثلايشن Hg عملية اللاهوائية، وليس لديه البروتوكول الواردة في هذه الدراسة الحاجة إلى الأوكسجين، مما يسمح لوصف أكثر دقة الأيض اللاهوائي في التوافر البيولوجي معدنية. وهذا مهم لأن وجود الأكسجين يغير الجينات التعبير الملامح48،49 ومن ثم إمكانات النقل مسارات؛ ولذلك يقدم هذا الأسلوب ميزة على exising حاليا بدائل الهوائية. يمكن أن تستخدم في بناء بيوسينسينج المقدمة هنا مع المضيفين اللاهوائية الأخرى التي قد تكون أكثر أهمية للزئبق مثلايشن (مثلاً، جيوباكتير، ديسولفوفيبريو)، ولكن ربما أقل أصعب من كولاي. واحد الحد الحالي للنهج الذي قدم هنا أن لدينا حد الكشف لم يبلغ بعد المستويات بعد الظهر، خلافا للأنظمة الهوائية الموجودة4،19،37. هو مع ذلك من المهم الإشارة إلى أنه من أجل تحقيق هذه الحدود الكشف عن انخفاض العديد من الخطوات الواجب اتخاذها44: أنا) إضافة يجند مطلوب لضمان أن الزئبق يبقى في حل ولا الجسميات على جدار الخلية الجرثومية (Hg سوف تكون محددة لا رجعة فيها إلى الخلية ثيولس السطحية منع عن التوافر الأحيائي25،27؛ انظر الرد عتبة للزئبق في الشكل 3 ألف)، ثانيا) تعديلات على كثافة الخلية، أو الثالث) تعديل بنية الوراثية تشمل بروتينات النقل مير-مشغل (هي merT وميرب)، وتزايد Hg التمويه داخل الخلية50،51. هذه التعديلات ستكون مفيدة في الكشف عن تركيزات منخفضة من الزئبق، ولكن ليس بالضرورة مثاليا عند تقييم الحالات ذات الصلة بيئياً. بينما أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الكادميوم السابقة موجودة أساسا كدليل "من حيث المبدأ"، تم تصميمها في وسائل الإعلام المعقدة التي لا تسمح للمحقق لتقييم دور انتواع في التوافر البيولوجي41،42، 43 , 44.
بيوسينسور هو أداة مفيدة بشكل لا يصدق في تحديد الآليات التي الأنواع المعدنية أحيائياً. لأن الكائن الحي المضيف ليس زئبق-ميثيلاتور، قد فقط استخدامه لوضع نموذج لكيفية قد أدخل Hg بكتيريا سلبية الغرام ولا أساس منطقي نهائي لكيفية اكتساب ميثيلاتورس Hg Hg. وتوجد أساليب أخرى لتحديد التوافر البيولوجي الزئبق، مثل مثلايشن، كنتيجة لامتصاص أو استخدام التوازن الكتلي نهج10،15،20،،من4546. ومع ذلك، الطريقة المعروضة هنا يقدم في الاستفادة من الوقت الحقيقي شبه التوافر البيولوجي البيانات في خلايا قابلة للحياة. لا نوصي بأن استخدام هذا الأسلوب لقياس مجموع مستويات الزئبق أو القرص المضغوط في مصفوفة بيئية. تتوفر العديد من الأساليب القياسية متاحة بسهولة أكبر على الرغم من استخدام أجهزة استشعار العوامل البيولوجية لتحديد تركيزات المعادن في البيئة36المقترحة، مثل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد، FAAS (لتحليل القرص المضغوط) أو بخار الباردة مطيافية الامتصاص الذري (لنيافة تحليل). بيوسينسور مع ذلك يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان مصفوفة بيئية معينة يمكن أن تعزز أو تعرقل التوافر الأحيائي؛ ويتحقق ذلك عن طريق إجراء الإضافات القياسية.
الرقم الهيدروجيني للتعرض لوسائل الإعلام قد يكون تغيير إلى أي مكان داخل نطاق 5 و 8-5، شريطة أن يتم تبادل حمض والمماسح الحرة (المخزن) مع حمض حرة بديلة من المخزن المؤقت مع pKa المناسبة (انظر قائمة مخازن مناسبة (فيريرا et al. (2015) 47) وتعديلها مع كوه على درجة الحموضة المناسبة عند اتخاذ التعرض لوسائل الإعلام. وبالإضافة إلى ذلك، الأسلوب لا يقتصر على الزئبق، ومؤتمر نزع السلاح، ولكن يمكن أن تمتد إلى المعادن الأخرى استخدام المنظمين النسخ الأخرى.
قد يتم تعديل المقايسة التعرض لاستكشاف تأثير متقبلون الإلكترون الأخرى مثل س2 وفيوماريت عن التوافر الأحيائي زئبق أو القرص المضغوط. إجراء تعديلات طفيفة على طريقة لاستخدام كل من س2 وفيوماريت متقبلون إلكترون متوفرة عند الطلب.
وخلاصة القول أننا نود أن نؤكد على النقاط التالية: أنا) من المحتم أن تركيزات الأرصدة Cd أو زئبق معروفة في الخطوة 2، كما سوف تستخدم هذه لمعايرة في بيوسينسور. الثاني) اليوم التعرض، يجب أن يتوقف نمو الخلايا التطوير التنظيمي من 0.6 (± 0.1)600 وأن الحرص عند ريسوسبيندينج الثقافات الخلية، كما بيوسينسور معايرة كثافة هذه الخلية. الثالث) وأخيراً، من المهم بذل المتوسطة التعرض دقة التعرض في اليوم. لضمان نجاح البروتوكول، ينبغي أن تزرع ثقافات متعددة في وقت واحد (للالتفاف حول إمكانية فشل النمو) وينبغي مجدد المتوسطة النمو الأسبوعية (للتحايل metastability لوسائل الإعلام والتلوث المحتمل). كما تجدر الإشارة إلى أن replicates البيولوجية (متعددة الثقافات الخلية) تعبر عن التغير عندما يتعلق الأمر بإشارة الإنتاج. على الرغم من أن الردود الفلورية قد تختلف من ثقافة إلى ثقافة، ينبغي أن تظل الاتجاهات الفلورسنت ردا على متغير معطى نفسه طوال replicates البيولوجية العديدة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونود أن أشكر التعليقات من المراجعين المجهولين اثنين كأعضاء جيدا في مختبر بولان لمناقشة الثاقبة في تطوير بيوسينسور اللاهوائية. جائزة الباحث المبكر من مقاطعة أونتاريو ومنحة الاكتشاف وتكملة مسرع من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا إلى A.J.P. بتمويل هذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7 ml standard vial, rounded interior | Delta Scientific | 200-007-20 | 34 recommended |
| Vial tray, 21 mm openings | Delta Scientific | 730-2001 | 4 for (4 x 8 grid) |
| 24 mm Closure | Delta Scientific | 600-024-01 | 32 recommended |
| LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 | Corning | Corning 3931 | |
| Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate | Corning | Corning 3651 | |
| Anaerobic Chamber (glovebox) | The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %) | ||
| Palladium catalyst | Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended. | ||
| Microplate reader | |||
| 450 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
| 500 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
| Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers | |||
| Spectrophotometer | Modified for anaerobic culture tubes | ||
| MA-3000 (mercury analyzer) | |||
| pH probe | Any pH probe will work | ||
| 50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes. | |||
| 0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe | |||
| Sterile/clean glass bottles | For growth media and standards | ||
| Sterile/clean plastic or PTFE bottles | For alkali solutions (NaOH/KOH) | ||
| Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2 | |||
| Sterile Milli-Q water | Autoclaved or filter sterilized is fine. | ||
| Lysogeny Broth | |||
| Analytical grade H2SO4 |
References
- Futsaeter, G., Wilson, S. The UNEP Global Mercury Assessment: Sources, Emissions and Transport. E3S Web of Conferences. 1, 36001 (2013).
- Barkay, T., Gillman, M., Turner, R. R. Effects of dissolved organic carbon and salinity on bioavailability of mercury. Applied and Environmental Microbiology. 63 (11), 4267-4271 (1997).
- Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
- Golding, G. R., et al. Evidence for facilitated uptake of Hg(II) by Vibrio anguillarum and Escherichia coli under anaerobic and aerobic conditions. Limnology and Oceanography. 47 (4), 967-975 (2002).
- Golding, G. R., Sparling, R., Kelly, C. A. Effect of pH on intracellular accumulation of trace concentrations of Hg(II) in Escherichia coli under anaerobic conditions, as measured using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 74 (3), 667-675 (2008).
- Chiasson-Gould, S. A., Blais, J. M., Poulain, A. J. Dissolved Organic Matter Kinetically Controls Mercury Bioavailability to Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (6), 3153-3161 (2014).
- Schaefer, J. K., Szczuka, A., Morel, F. M. M. Effect of Divalent Metals on Hg(II) Uptake and Methylation by Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (5), 3007-3013 (2014).
- Compeau, G., Bartha, R. Sulfate-reducing bacteria: principal methylators of mercury in anoxic estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 50 (2), 498-502 (1985).
- Compeau, G. C., Bartha, R. Effect of salinity on mercury-methylating activity of sulfate-reducing bacteria in estuarine sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (2), 261-265 (1987).
- Gilmour, C. C., Henry, E. A., Mitchell, R. Sulfate stimulation of mercury methylation in freshwater sediments. Environmental Science & Technology. 26 (11), 2281-2287 (1992).
- Rani, A., Kumar, A., Lal, A., Pant, M. Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity: a review. International Journal of Environmental Health Research. 24 (4), 378-399 (2014).
- Liu, F., Fortin, C., Campbell, P. G. C. Can freshwater phytoplankton access cadmium bound to low-molecular-weight thiols? Limnology and Oceanography. 62 (6), 2604-2615 (2017).
- Shahid, M., Dumat, C., Khalid, S., Niazi, N. K., Antunes, P. M. C. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. de Voogt, P. 241, Springer International Publishing. 73-137 (2017).
- Hsu-Kim, H., Kucharzyk, K. H., Zhang, T., Deshusses, M. A. Mechanisms regulating mercury bioavailability for methylating microorganisms in the aquatic environment: a critical review. Environmental Science and Technology. 47 (6), 2441-2456 (2013).
- Szczuka, A., Morel, F. M. M., Schaefer, J. K. Effect of Thiols, Zinc, and Redox Conditions on Hg Uptake in Shewanella oneidensis. Environmental Science and Technology. 49 (12), 7432-7438 (2015).
- Schaefer, J. K., et al. Active transport, substrate specificity, and methylation of Hg(II) in anaerobic bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8714-8719 (2011).
- Stenzler, B. R., Hinz, A., Ruuskanen, M. O., Poulain, A. J. Ionic strength differentially affects the bioavailability of neutral and negatively charged inorganic Hg complexes. Environmental Science and Technology. , (2017).
- Sigel, A. Cadmium: From Toxicity to Essentiality. , Dordrecht : Springer Netherlands : Imprint: Springer (2013).
- Barkay, T., Turner, R. R., Rasmussen, L. D., Kelly, C. A., Rudd, J. W. Luminescence facilitated detection of bioavailable mercury in natural waters. Methods in Molecular Biology. 102, Clifton, N.J. 231-246 (1998).
- Zhang, T., et al. Methylation of mercury by bacteria exposed to dissolved, nanoparticulate, and microparticulate mercuric sulfides. Environmental Science and Technology. 46 (13), 6950-6958 (2012).
- Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
- Moreau, J. W., et al. The Effect of Natural Organic Matter on Mercury Methylation by Desulfobulbus propionicus 1pr3. Frontiers in Microbiology. 6 (1389), (2015).
- Schaefer, J. K., Morel, F. M. M. High methylation rates of mercury bound to cysteine by Geobacter sulfurreducens. Nature Geoscience. 2 (2), 123-126 (2009).
- Dunham-Cheatham, S., Farrell, B., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of chloride on the adsorption of Hg onto three bacterial species. Chemical Geology. 373, 106-114 (2014).
- Dunham-Cheatham, S., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of natural organic matter on the adsorption of mercury to bacterial cells. Geochimica et Cosmochimica Acta. 150, 1-10 (2015).
- Mishra, B., Shoenfelt, E., Yu, Q., et al. Stoichiometry of mercury-thiol complexes on bacterial cell envelopes. Chemical Geology. 464, 137-146 (2017).
- Sara Anne, T., Qing, M., Jean-François, G. Probing changes in Hg(II) coordination during its bacterial uptake. Journal of Physics: Conference. 712 (1), 012078 (2016).
- Macek, T. Microbial Biosorption of Metals. , Springer. Netherlands. (2011).
- Ledin, M., Pedersen, K., Allard, B. Effects of pH and Ionic Strength on the Adsorption of Cs, Sr, Eu, Zn, Cd and Hg by Pseudomonas Putida. Water, Air, and Soil Pollution. 93 (1-4), 367-381 (1997).
- Daughney, C. J., Fein, J. B. The effect of ionic strength on the adsorption of H+, Cd2+, Pb2+ and Cu2+ by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis: A surface complexation model. Journal of Colloid and Interface Science. 198 (1), 53-77 (1998).
- Borrok, D. M., Fein, J. B. The impact of ionic strength on the adsorption of protons, Pb, Cd, and Sr onto the surfaces of Gram negative bacteria: testing non-electrostatic, diffuse, and triple-layer models. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 110-126 (2005).
- Daguené, V., et al. Divalent Base Cations Hamper HgII Uptake. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6645-6653 (2012).
- Turner, D. R. Speciation and cycling of arsenic, cadmium, lead and mercury in natural waters. Lead, Mercury, Cadmium and Arsenic in the Environment. , 175-186 (1987).
- Liu, G., Cai, Y., O'Driscoll, N. Environmental Chemistry and Toxicology of Mercury. , John Wiley & Sons. (2011).
- North, A. E., Sarpong-Kumankomah, S., Bellavie, A. R., White, W. M., Gailer, J. Environmentally relevant concentrations of aminopolycarboxylate chelating agents mobilize Cd from humic acid. Journal of Environmental Sciences. 57, 249-257 (2017).
- Van Der Meer, J. R., Belkin, S. Where microbiology meets microengineering: design and applications of reporter bacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (7), 511-522 (2010).
- Rasmussen, L. D., Turner, R. R., Barkay, T. Cell-density-dependent sensitivity of a mer-lux bioassay. Applied and Environmental Microbiology. 63 (8), 3291-3293 (1997).
- Magrisso, S., Erel, Y., Belkin, S. Microbial reporters of metal bioavailability. Microbial Biotechnology. 1 (4), 320-330 (2008).
- Golding, G. R., Kelly, C. A., Sparling, R., Loewen, P. C., Barkay, T. Evaluation of mercury toxicity as a predictor of mercury bioavailability. Environmental Science and Technology. 41 (16), 5685-5692 (2007).
- Drepper, T., et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. Nature biotechnology. 25 (4), 443-445 (2007).
- Kumar, S., Verma, N., Singh, A. K. Development of cadmium specific recombinant biosensor and its application in milk samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 240, 248-254 (2017).
- Yoon, Y., et al. Simultaneous detection of bioavailable arsenic and cadmium in contaminated soils using dual-sensing bioreporters. Applied and Environmental Microbiology. 100 (8), 3713-3722 (2016).
- Kang, Y., Lee, W., Jang, G., Kim, B. G., Yoon, Y. Modulating the sensing properties of Escherichia coli-based bioreporters for cadmium and mercury. Applied and Environmental Microbiology. 102 (11), 4863-4872 (2018).
- Hynninen, A., Tõnismann, K., Virta, M. Improving the sensitivity of bacterial bioreporters for heavy metals. Bioengineered Bugs. 1 (2), 132-138 (2010).
- Graham, A. M., Bullock, A. L., Maizel, A. C., Elias, D. A., Gilmour, C. C. Detailed assessment of the kinetics of Hg-cell association, Hg methylation, and methylmercury degradation in several Desulfovibrio species. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7337-7346 (2012).
- Graham, A. M., Aiken, G. R., Gilmour, C. C. Dissolved Organic Matter Enhances Microbial Mercury Methylation Under Sulfidic Conditions. Environmental Science & Technology. 46 (5), 2715-2723 (2012).
- Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions-a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
- Salmon, K., Hung, S. P., Mekjian, K., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global gene expression profiling in Escherichia coli K12: the effects of oxygen availability and FNR. Journal of Biological Chemistry. 278 (32), 29837-29855 (2003).
- Salmon, K. A., Hung, S. P., Steffen, N. R., Krupp, R., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global Gene Expression Profiling in Escherichia coli K12 effects of oxygen availability and ArcA. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 15084-15096 (2005).
- Larose, C., Dommergue, A., Marusczak, N., Coves, J., Ferrari, C. P., Schneider, D. Bioavailable mercury cycling in polar snowpacks. Environmental Science & Technology. 45 (6), 2150-2156 (2011).
- Omura, T., Kiyono, M., Pan-Hou, H. Development of a specific and sensitive bacteria sensor for detection of mercury at picomolar levels in environment. Journal of Health Science. 50 (4), 379-383 (2004).
