Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

En anaerob Biosensor Assay til påvisning af kviksølv og Cadmium

Published: December 17, 2018 doi: 10.3791/58324
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Ottawa

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at bruge en anaerob hele-celle mikrobielle biosensor til at evaluere hvordan forskellige miljøvariabler påvirke biotilgængeligheden af Hg og Cd til bakterier i iltfattige miljøer.

Abstract

Kviksølv (Hg) biotilgængelighed til mikrober er et vigtigt skridt til giftige Hg Bioakkumuleringen i mad webs. Cadmium (Cd) transformationer og biotilgængelighed til bakterier kontrollere det beløb, der vil ophobe sig i korte fødevareafgrøder. Biotilgængelighed af disse metaller er afhængige af deres typebestemmelse i løsning, men mere især under iltfattige forhold hvor Hg er methylerede til giftige monomethylmercury (MeHg) og Cd fortsætter i rhizosfære. Hele-celle mikrobielle biosensorer give en kvantificerbar signal, når en metal ind i cytosol og derfor er nyttige værktøjer til at vurdere metal biotilgængelighed. Desværre, de fleste biosensing bestræbelser har hidtil været begrænset til oxic miljøer på grund af den begrænsede evne af eksisterende reporter proteiner til at fungere i mangel af ilt. I denne undersøgelse præsenterer vi vores indsats for at udvikle og optimere en helhed-celle biosensor assay funktionsdygtigt anaerobt der kan registrere metaller under iltfattige betingelse i næsten realtid og inden for timer. Vi beskriver, hvordan biosensor kan hjælpe med at vurdere hvordan kemiske variabler er relevante for den miljømæssige cykling af metaller påvirker deres biotilgængelighed. Følgende protokol omfatter metoder til at (1) forberede Hg og Cd-standarder under iltfattige forhold, (2) forberede biosensor i mangel af ilt, (3) design og Udfør et eksperiment for at bestemme, hvordan en række variabel påvirker Hg eller Cd biotilgængelighed, og (4) at kvantificere og fortolke biosensor data. Vi viser de lineære intervaller af biosensorer og give eksempler viser metodens evne til at skelne mellem metal biotilgængelighed og toksicitet ved at udnytte både metal-inducerbar og konstituerende stammer.

Introduction

Kviksølv (Hg) er et globalt forurenende stof og dets biotilgængelighed til Hg methylating mikrober er det første skridt mod sin Bioakkumuleringen gennem mad webs og dens mulige neurotoksiske virkninger i menneskelige og dyreliv1. Det er i øjeblikket troede at mikrobielle Hg methylering er en intracellulær proces, der kræver: i) arterne af Hg skal være biotilgængelige2,3,4,5,6,7 og ii) for cellen at være fysiologisk i stand til at methylating Hg8,9,10. Cadmium (Cd) bioakkumulerende i organismer, men ikke ikke biomagnifies i foodwebs og er almindeligt anvendt i industrielle og kommercielle processer, der almindeligvis forårsage akut engagementer i mennesker og miljø11. Selv om mikrober spiller flere vigtige roller i Hg skæbne i miljøet, fokusere de fleste undersøgelser på Cd Geokemi og økotoksikologi på mikrobiel eukaryoter12. Forbruget af landbrugsafgrøder (fx ris) er den største kilde til direkte eksponering for cadmium; i dette tilfælde biotilgængelighed af Cd til mikrober af rhizosfære direkte påvirkninger af beløbet planter kan ophobes13.

HG transport veje er komplekse og muligvis indebærer en aktiv transport trin14. Når en transportør er involveret, seneste arbejde foreslog, at HgII bruger en ZnII eller MnII transporter7,15,16,17. Mens CdII er hypotese for at transporteres ved et uheld i cytosol gennem divalent metal transport veje (især MnII eller ZnII) mekanismer af CdII transport indeni cellerne forblive spekulative, og ingen Cd-specifikke transport pathway har været identificeret13,18. Uanset arten af transportvirksomheder involveret, tre mekanistiske faktorer i sidste ende bestemme metaller evne til at indtaste en celle: i) den metal typebestemmelse i løsning2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) biophysiochemical egenskaber af cellemembranen17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, og iii) evne til metal til at få adgang til en transport site7,32. CD og Hg er usandsynligt, at eksisterer som frie ioner på mikrobiel fysiologisk relevante betingelser på grund af deres høje affinitet for opløst organisk stof (DOM), chelaterende forurenende stoffer (fx, EDTA), eller reduceret svovl fraspaltning33, 34,35 (CdII kan eksistere som en gratis ion eller form ion-par i mangel af disse ligander). Der er en mangel på effektive metoder til at bestemme, hvordan disse metal arter er biotilgængelige under betingelser, der er relevante for deres skæbne i miljøet. For eksempel, Hg er methylerede under anaerobe betingelser14, og både cadmium og Hg er bløde metaller (eller klasse B kationer), der kræver, at deres artsdannelse undersøges under forhold, der opretholder integriteten af reduceret svovl grupper.

Mikrobielle biosensorer er bakterieceller, der udsender en kvantificerbar signal som svar på de intracellulære koncentrationer af et metal, i dette tilfælde Hg eller Cd. Som sådan, er de ideelle værktøjer til at forstå, hvordan metaller Indtast en celle36, forudsat at eksponeringsforhold er omhyggeligt kontrolleret. HG biosensorer indeholder typisk gen fusioner mellem de regulerende kredsløb af mer-operon (herunder gener kodning for transskription regulator MerRas samt operatør og promotor regioner af operonen), og rapportering gener (f.eks. Lux, normal god landbrugspraksis, lac gener). Når kviksølv findes i cytoplasma, vil den binde sig til MerR, hvilket resulterer i transskription af rapportering gener og efterfølgende signal produktion19,37. Særlige Cd biosensorer er normalt udviklet ved hjælp af cadC, cadAC, zntA eller zntR kodet transskription regulatorer38, men det er værd at bemærke, at MerR har en lavere, men alligevel målbare affinitet til Cd5. På grund af aerobe begrænsning af de fleste anvendte almindeligt selvlysende eller fluorescerende reporter proteiner, indtil for nylig mikrobielle biosensorer forblev ikke tilbyde indsigt i biotransformation af metaller under iltfattige forhold. Dette gør anaerob påvisning af metaller biotilgængelighed meget vanskeligt på en række betingelser er relevante for deres skæbne i miljøet, specielt i overværelse af redox følsomme ligander (fx sulfid og dithioler)4, 5 , 39.

For at afhjælpe den metodologiske forhindring af live imaging i mangel af ilt, Drepper et al. (2007) har udviklet en flavin-baserede fluorescerende proteiner (FbFp), baseret på lys ilt spænding domæne SB2 protein fra P. putida. Dette protein familie er købedygtig fluorescerer i mangel af ilt40. Med udgangspunkt i arbejdet i Drepper et al., designet vores lab en anaerob biosensor giver mulighed for undersøgelse af Hg biotilgængelighed under oxic og iltfattige forhold og over en bred vifte af saltholdighed 17. I den nuværende papir beskriver vi hvordan man kan forberede og bruge biosensor for at teste miljømæssige variabler indflydelse på Hg eller Cd biotilgængelighed. Selv om vi udviklet biosensor for HgII, valgte vi at udføre eksperimenter med CdII som et middel til at henlede læserens opmærksomhed på, at biosensorer kan også reagere på flere stressfaktorer, der kan forventes at samtidig forekomme i miljøet matricer; i dette tilfælde CdII blev undersøgt fordi det er kendt for at binde til det transkriptionel regulator MerR5. Her viser vi repræsentative kalibrering og funktionelle lineær intervaller med hensyn til enten metal. Vi giver også et eksempel når biosensor's resultater er afgørende (MgII og MnII på Hg biotilgængelighed) og usikkert (ZnII på Hg biotilgængelighed).

Protocol

1. vækst medier og eksponering Media forberedelse

  1. At gøre 250 mL af vækstmediet:
    Bemærk: Hvis sporstoffer #1 løsning og sporstoffer #2 løsning er allerede forberedt, springe til trin 1.1.5.
    1. Forberede sporstoffer #1 løsning i en ren målekolbe (200 mL) indeholder de endelige molarities 1,5 x 10-3 M Na2MoO4, 6,5 x 10-4 M Na2SeO4, 5 x 10-3 M H3BO 3, og 0,1 M NaOH.
      Advarsel: Stærke baser (NaOH) er ætsende. Gøre sikker på Hvornår vejer reagenser til at sikre, at den endelige molariteten repræsenterer de vigtige sporstoffer; MO, Se og B.
    2. Under et sterilt felt sterilisere filter ved hjælp af et 0,22 µm polyethersulfone sprøjte filter i et rent/sterilt plastik/polytetrafluorethylen (PTFE) flaske.
    3. Forberede sporstoffer #2 løsning i en ren målekolbe (200 mL) indeholder de endelige molarities af 0,01 M MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO4, 3.25 x 10-3 M CoCl2, 6,25 x 10-3 M NiCl 2, og 0,1 M H2så4.
      Advarsel: Stærke syrer (H2SO4) er ætsende. Gøre sikker på Hvornår vejer reagenser til at sikre, at den endelige molariteten repræsenterer de vigtige sporstoffer; MN, Zn, Co, og Ni.
    4. Under et sterilt felt sterilisere filter ved hjælp af et 0,22 µm polyethersulfone sprøjte filter i en ren glasflaske.
    5. Under et sterilt felt, i et rent/sterilt glasflaske (250 mL minimum); tilføje 200 mL ultrarent vand, 42,5 mL af M9 Minimal salte (5 x; se Tabel af materialer), 2,5 mL 2 M glukose, 125 µL af 2 M MgSO4, 1200 µL 0,6 M thiamin HCL fra en frosne (-20 ˚C) alikvot, 1,25 mL 4 M NaNO3 , 770 µL af 0.075 M L-leucin / L-isoleucin / valin løsning, 250 µL sporstoffer #1, 250 µL af sporstoffet #2, og 250 µL 0,01 M EDTA natrium salt.
      Bemærk: Alle reagenser i trin 1.1.5 bør forberedes, forudgående og steriliseret ved hjælp af et 0,22 µm polyethersulfone sprøjte filter-filter. Ultrarent vand kan steriliseres ved hjælp af autoklave.
    6. Tage glasflaske nu indeholdende løsning fra trin 1.1.5., løst cap det og gennemløbe anaerob kammer luft lås.
    7. Tilføj 15 µL af 0,225 M FeSO4 i 0,2 M H2i anaerobe kammer, så4, cap flaske stramt, og ryste, indtil alle hvide bundfald forsvinde.
      Bemærk: Alle reagenser i trin 1.1.7 bør forberedes, forudgående og steriliseret ved hjælp af et 0,22 µm polyethersulfone sprøjte filter-filter. Store 0,225 M FeSO4 i 0,2 M H2så4 i anaerobe kammer.
    8. Fjern hætten fra flaske, vent 1 minut for luft til at udveksle, erstatte fælles landbrugspolitik fra flaske og derefter rystes kraftigt. Gentag dette trin en gang.
    9. Spænd hætten tæt på flasken, fjerne fra anaerob kammerog gemme flaske i køleskab (4 ˚C) indtil brug.
    10. Vækstmediet bør være genskabt en gang om ugen ved at gentage trin 1.1.5 at 1.1.9.
  2. At gøre 100 mL af eksponering medium i 2 x 50 mL konisk sterile polypropylen centrifugeglas:
    Bemærk: Vi anbefaler at eksponering medium være forberedt på dagen for eksponering assay at minimere risikoen for kontaminering, men den kan laves i forvejen og opbevares i køleskabet.
    1. I den anaerobe kammer, til hver 50 mL centrifugeglas tilføje 42 mL af anaerobe ultrarent vand, 350 µL 1 M natrium Beta-Gylcerophosphate fra en frosne (-20 ˚C) alikvot, 2 mL 1 M MOPS fri syre, 50 μL af 1 M (NH4)2så4 , 125 μL 2 M glukose, 300 μL af 2,5 M KOH og 200 μl af 2,5 M NaOH.
      Bemærk: Alle reagenser i trin 1.2.1 bør forberedes, forudgående og steriliseret ved hjælp af et 0,22 µm polyethersulfone sprøjte filter-filter. Ultrarent vand kan være varme steriliseret ved hjælp af autoklave. 2.5 M NaOH og 2,5 M NaOH skal opbevares i plast/PTFE flasker. Alle reagenser opført skal opbevares i anaerobe kammer undtagen natrium Beta-Gylcerophosphate, som skal opbevares i en (-20 ˚C) fryser. Generelt er det god praksis at forlade alle plast eller glas dele og beholdere i flere dage i den anaerobe kammer til at sikre, at ingen spor af ilt forbliver.
    2. Cap 50 mL centrifugeglas, ryst godt og fjerne en 10 mL prøve for at måle pH-værdien. Målte pH-værdien af denne eksponering media skal altid måle 7,00 ± 0,02 på 25 ˚C. Hvis pH-værdien ikke måler inden for dette interval, justere mængden af tilsat 2,5 M KOH at korrigere for dette.
      Bemærk: Aldrig titreres løsning at korrigere for pH med et pH-sonde. pH-sonder udgør en kilde til kontaminering eksponering medium. PH-værdien skal altid være et produkt af de tilsatte reagenser i trin 1.2.1.
  3. Forbered en 5-10 mM NaNO3 stamopløsning og forlade i anaerobe kammer til at blive brugt i løbet af eksponering assay.
    Bemærk: Det er lettere at fortynde en mere koncentreret primære NaNO3 standard i stedet for at gøre en 5-10 mM NaNO3 primære standard.

2. forberedelse af kviksølv og Cadmium standarder.

  1. Forberede en 4-8 µM Mercuric (HgII) løsning i 0,2 M H2SO4.
    1. Forberede en Hg2 + standard ved at lave en millimolar (1-10 mM) HgCl2, HgNO3 eller HgSO4 løsning i 0,2 M H2SO4.
      Forsigtig: Kviksølv er yderst giftigt og H2så4 er ætsende. Operere i fume emhætter med alle nødvendige personlige værnemidler.
    2. I en PTFE flaske, fortyndet standard fra 2.1.1. i 0,2 M H2SO4 at opnå en koncentration inden for 4-8 µM Hg2 +rækkevidde.
      Bemærk: Syren bruges skal være analysekvalitet H2så4.
    3. Hg koncentration fra 2.1.2 skal bekræftes vha. et kviksølv analyzer (Se Tabel af materialer).
      Bemærk: Andre metoder til validering af Hg koncentration kan bruges.
  2. Forberede en 10 µM CdII løsning i 10 mM H2SO4.
    1. Forberede en primær standard CdCl2 (10-50 mM rækkevidde til præcis vejning af pulver) i 0,1 M H2SO4.
    2. I en serie af serielle fortyndinger i ren syre skylles 20 mL borsilikatglas hætteglas med sort phenol skruelåg med PTFE over gummi liners, fortyndet standard fra 2.2.1 til 10 µM Cd2 +. Sikre, at koncentrationen af H2så4 i hver efterfølgende seriel fortynding forbliver 10 mM.

3. forberedelse af Biosensor for anaerob eksponering Assay

  1. Plade kviksølv inducerbar biosensor (E. coli NEB5α husly PUC57merR-PpFbFp) og den constitutively udtrykt biosensor (E. coli NEB5α husly PUC19Balch-PpFbFp) fra-80 ˚C cryostock på Lysogeny bouillon plader der indeholder 120 ug/mL ampicillin. Se vores tidligere offentliggjorte arbejde for detaljer om produktionen af disse biosensorer17.
  2. På 4:30-5 PM, podes en kultur i 10 mL af LB (+ amp) og vokse natten over.
    Bemærk: Start fra en plade det tager 2 dage til at forberede den anaerobe kultur for eksponering assay (dvs. en kultur begyndte mandag eftermiddag (4:30-5 PM) vil være klar til eksponering assay på omkring middagstid på onsdag). Følgende trin er de nødvendige mikrobiologiske teknikker nødvendige for at forberede kulturerne på dagen for eksponering assay.
    1. Tage en koloni fra plade kultur og tilsættes 10 mL Lysogeny bouillon (LB) med 21 µL af en 100 mg/mL stamopløsning af ampicillin natriumsalt (endelig koncentration er 210 ug/mL amp) i en steril kultur tube.
    2. Placere kulturen i en inkubator/shaker og vokse natten over på +37 ˚C med rysten på 220 rpm.
  3. Den næste morgen kl 9-10, resuspend kultur og vokse anaerobt hele dagen (20% inokulum).
    1. Bringe kultur fra inkubator (trin 3.2.1) og vækstmedium (trin 1.1.9) i anaerobe kammer.
    2. Tilføje 8 mL frisk vækstmedium og ampicillin (210 μg/mL) i en steril Balch tube.
    3. Indsamle 2 mL af overnight dyrket kultur og overførsel til en 2 mL Microcentrifuge tube. Centrifugeres ved 10.000 Genbrugsfibre trin i 90 sekunder, dump supernatanten og resuspend i 2 mL af frisk vækstmedium. Tilføje den resuspenderede kultur til Balch rør indeholdende 8 mL frisk vækstmedium og ampicillin.
    4. Brug steril teknik, omhyggeligt placere en gummiprop på Balch tube. Fjern fra anaerob kammer og placere i en inkubator/shaker og vokse anaerobt indtil 3-5 PM på +37 ˚C med rysten på 220 rpm.
  4. Mellem 3 og 5 PM, udføre en 1% anaerob inokulum til frisk vækstmedium og vokse natten over.
    1. Bringe Balch tube (trin 3.3.4) i anaerobe mødesalen sammen med vækstmediet. Tilsættes 100 µL af kulturen 10 mL frisk vækstmedium (1% inokulum) med amp (210 ug/mL amp) i en steril Balch tube.
    2. Brug steril teknik, omhyggeligt placere en gummiprop på Balch tube. Fjern fra anaerob kammer, placere i en inkubator/shaker og vokse natten over på +37 ˚C med rysten på 220 rpm.
  5. Mellem 9 og 10 AM, resuspend kultur at vokse anaerobt hele dagen (20% inokulum).
    1. Bringe kultur fra inkubator (trin 3.4.1) og vækstmedium (trin 1.1.9) i anaerobe kammer.
    2. Tilføje 8 mL af vækstmediet og ampicillin (210 ug/mL amp) ind i en steril Balch rør.
    3. Indsamle 2 m af overnight dyrket kultur og overførsel til en 2 mL Microcentrifuge tube. Centrifugeres ved 10.000 x g i 90 sekunder, dump supernatanten, og pelleten i 2 mL af frisk vækstmedium. Tilføje den resuspenderede kultur til Balch rør indeholdende 8 mL frisk vækstmedium og ampicillin.
    4. Brug steril teknik, omhyggeligt placere en gummiprop på Balch tube. Fjern fra salen og placere i en inkubator/shaker og vokse anaerobt ved +37 ˚C med rysten på 220 rpm.
  6. Overvåge vækst af den kultur, der bruger et spektrofotometer (trin 3.5.4) indtil en OD600 på 0,6 er nået. Vær sikker på at vortex kultur før hver OD læsning.
    Bemærk: Dette trin tager 3-4 timer, og eksponering medium (trin 1.2) skal udarbejdes i løbet af denne tid samt eksponering assay (trin 4.1).
  7. Stoppe væksten når kultur når en OD600 på 0,6 (±0.1) (3-4 timer forventet vækst).
    1. Bringe tube i anaerobe kammer (trin 3.6) og overførsel kultur i 2 x 2 mL Microcentrifuge rør. Centrifugeres ved 10.000 x g i 90 sekunder, dump supernatanten, og pelleten i 2 x 2 mL af frisk eksponering medium.
    2. Gentag vask trin 3.7.1. én gang for at fjerne ethvert spor af vækstmediet.
  8. Kombinere begge microcentrifuge rør af cellekultur (trin 3.7) i en 7 mL PTFE standard hætteglas at opnå Biosensor materiel anvendes i Eksponering Assay (trin 4).
    Bemærk: Sørg for at blande Biosensor bestand af grundigt men forsigtigt pipettering frem og tilbage inden brug. Metoden kan være pause her i op til en time.

4. eksponering Assay

  1. Designe en plade layout.
    Bemærk: Sørg for at have alle pipettering værdier beregnes og lagre parat før du starter den eksponering assay. Hvordan at korrekt design et eksperiment og hvad styrer for at medtage er detaljeret i teksten. Derudover bør eksperimentet ikke startes, hvis der er ilt anaerob her angivet på den anaerobe skærm.
    1. Designe layoutet plade efter en 96 godt skabelon. Hvis du vil køre eksperimenter i tekniske replikater af 3, giver det mulighed for 32 forskellige behandlinger, som er bedst repræsenteret ved en 4 x 8-gitter til at konfigurere hætteglas (Se figur 1).

Figure 1
Figur 1: en 96 godt plade (venstre) og en tilsvarende 4 x 8-gitter, der indeholder PTFE hætteglas (højre) for at blive overført til pladen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Bemærk: Når test til rollen som en variabel Hg optrækket med kviksølv inducerbar biosensor; to behandlinger er påkrævet for hver variabel: behandling (biosensor + Hg + variabel + nitrat) og dens behandling Tom (biosensor + variabel + nitrat). Når du tester til rollen som en variabel på fysiologi af cellen ved hjælp af konstituerende biosensor, to behandlinger er påkrævet for hver variabel: behandling (biosensor + Hg + variabel + nitrat) og Tom () behandling biosensor + variabel + Hg). Kviksølv kan erstattes med Cadmium. HG eller Cd bliver variablen når du udfører en kalibreringskurve. Den konstituerende og inducerbar biosensorer skal ikke køres på samme tid (i den samme plade layout). En skabelon eksempel for plade layout og tilsvarende 4 x 8-gitter når du tester et koncentrationsområde af magnesium (variabel) er fastsat i tabel 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
en HG induceret biosensor + Hg + nitrat + 0 mM Mg HG induceret biosensor + nitrat + 0 mM Mg Konstituerende biosensor + Hg + nitrat + 0 mM Mg Konstituerende biosensor + Hg + 0 mM Mg
b HG induceret biosensor + Hg + nitrat + 0,1 mM Mg HG induceret biosensor + nitrat + 0,1 mM Mg Konstituerende biosensor + Hg + nitrat + 0,1 mM Mg Konstituerende biosensor + Hg + 0,1 mM Mg
c HG induceret biosensor + Hg + nitrat + 1 mM Mg HG induceret biosensor + nitrat + 1 mM Mg Konstituerende biosensor + Hg + nitrat + 1 mM Mg Konstituerende biosensor + Hg + 1 mM Mg
d HG induceret biosensor + Hg + nitrat + 10 mM Mg HG induceret biosensor + nitrat + 10 mM Mg Konstituerende biosensor + Hg + nitrat + 10 mM Mg Konstituerende biosensor + Hg + 10 mM Mg
e

Tabel 1: Et eksempel plade layout for at bruge biosensor for at teste Hg biotilgængelighed (5 nM) over et forløb af Magnesium (0-10 mM)

  1. Oprettet 4 x 8-gitter ifølge analysen plade layout.
    1. Plads 7 mL PTFE standard hætteglas i skuffen.
      Bemærk: PTFE hætteglas skal være acid vasket/varme steriliseret før brug. Glassene bør kun håndteres ved at manipulere med ydersiden af hætteglasset.
    2. Hvert hætteglas, tilføje eksponering medium volumen svarende til hver behandling.
      Bemærk: I en eksponering med en samlede volumen af 2.000 µL (2 mL), bliver den tilføjede eksponering medium : eksponering medium µL = 2.000 µL- behandling (tom) µL. (f.eks. eksponering medium µL = 2.000 – 100 µL (biosensor) – 40 µL (nitrat) – 100 µL (Hg ) – 100 µL (variabel (f.eks. MgSO4)) = 1660 µL). Sørg for at volumen tilføjet af variablen testet ikke overstiger 5% (100 µL) af det endelige rumfang.
    3. Hvert hætteglas, tilføje de tilsvarende rumfang af opløsning af den kemiske variabel skal testes ifølge plade layout.
    4. Fra trin 1.3, skal du føje nitrat til hvert hætteglas, så den endelige koncentration er 200 µM (40-80 µL). Udelade dette trin for konstituerende biosensor behandling blanks.
    5. Fra trin 2.1 og 2.2, tilføje Hg (5 nM ved test for en variabel) eller Cd (300 nM ved test for en variabel) til hætteglas ifølge plade layout. Udelade dette trin for kviksølv inducerbar biosensor behandling blanks.
      1. Når du bruger Hg, tage 4-8 µM lager og ryst godt. Fortynd løsningen i eksponering medium i en 7 mL PTFE hætteglas til 100-250 nM til at gøre en fungerende Hg løsning. Fra denne brugsopløsning tilføje Hg til de krævede hætteglas. I dette tilfælde en kalibreringskurve af Hg spænder fra 0 til 12,5 nM.
        Bemærk: Når du tester for en variabel effekt på Hg eller Cd biotilgængelighed, Sørg for, at [Hg] eller [Cd] forbliver konstant på tværs af alle behandlinger. Når du tilføjer Hg eller Cd, skal du sørge for at bruge en pipette tip, men aldrig røre eksponering medium i hætteglassene.
  2. Ryst i en orbital bevægelse manuelt.
    Bemærk: Forsøget kan afbrydes midlertidigt nu afhængig af den tid, der kræves for Hg eller Cd til speciate i løsning. Hvis venstre for mere end en time, skal du placere PTFE caps på PTFE hætteglas at forhindre fordampning/forurening.
  3. Forsigtigt afpipetteres Biosensor materiel frem og tilbage for at sikre ensartethed. Tilføje 100 µL af Biosensor materiel til hvert hætteglas. Ryst orbitally manuelt.
  4. Forberede Pladelæser til at varme op til at læse med følgende kriterier: temperatur på 37˚C, kinetic køre for 10 timer med læser hver 2,5-5 minutter med orbital ryster i mellem læser og fluorescens målinger med en Fluorescens excitation af 440 nm og en emission af 500 nm.
  5. Der afpipetteres 200 µL fra hver PTFE hætteglas i 4 x 8-gitter i de tilsvarende huller i 96 godt pladen (sort, 96-godt klar-bunden anden overflade mikroplader). Afpipetteres og tilbage 5 gange før du overfører hver 200 µL.
    Bemærk: I stedet for at kassere pipette tip, lad pipette tip i PTFE hætteglas til at holde styr på pipettering fremskridt.
  6. 96 godt pladen anbringes i magasinet af Pladelæser, derefter låget lægges på 96 godt pladen og begynde analysen.

5. kvantificering af Data

  1. Fluorescens af hver behandling på hvert tidspunkt skal korrigeres for hver enkelte godt støj og blændede til den behandling tom.
    1. Fluorescens for hvert tidspunkt (t) for hver behandling (T) skal oversættes til konto til den oprindelige fluorescens (t0) for første gang punkt i hver brønd, så i gennemsnit på tværs af de 3 behandlinger replikater (r1- r3 ). Denne behandling gennemsnit skal derefter blændede til den gennemsnitlige behandling Tom (TB) oversat på samme måde (ligning 1).

Fluorescens (t) = gennemsnitlige(Tr1(t) - Tr1(t0), Tr2(t) - Tr2 (t0), Tr3(t) - Tr3(t0))- gennemsnitlig(TB R1 (t) - TBr1(t0), TBr2(t)- TBr2() t0 ), TBr3(t) - TBr3(t0)) (1)

Bemærk: Dette bør gøres som en regnearksfunktion. Ordentlig formering af fejl skal også beregnes for hvert tidspunkt.

  1. Graf den korrigerede fluorescens af hver behandling som funktion af tiden

Figure 2
Figur 2: korrigeret fluorescens data som en funktion af tiden. Fluorescens måles som relativ fluorescens enheder (RFU) udsendes af E. coli NEB5α husly pUC57merR-Pp (inducerbar stamme) over tid med tilføjelse af HgII (0-12,5 nM) under anaerobe forhold. Fluorescens var gennemsnittet af 3 tekniske replikater på 37 ˚C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Bemærk: Der er ingen 0 nM Hg værdi på grafen, og alle andre Hg koncentrationer har været blændede til 0 nM Hg som en behandling være tomt. Derfor, 0 nM Hg repræsenterer x-aksen og enhver positiv fluorescens udgør fluorescens fra Hg givet enhver variabel. Det er valgfrit at ikke tom fluorescens på denne måde, men de fluorescerende kurver vil give vildledende fluorescens kurver, hvis variablen testet har baggrund fluorescens (dvs. opløst organisk materiale sig vil fluorescerer og hvis der er nogen behandling Tom indeholdende bare celler og af opløst organisk stof, opløst organisk stof koncentration vil øge den fluorescerende signal).

  1. Kvantificere fluorescens peak. En kvantificerbar fluorescens peak vil typisk forekomme efter 2,5-4 timer, der repræsenterer den energi brugt ved indtagelse af alle 200 µM nitrat som en terminal elektron acceptor. Denne peak skal kvantificeres og repræsenterer den endelige fluorescens værdi af denne særlige behandling.
    Bemærk: I tilfælde nogen fluorescens peak er observeret (dvs. ingen Hg biotilgængelighed), fluorescens af behandling for tidspunkt af fluorescens-toppen af kontrol (dvs. ingen tilføjet variabel eller 5nM Hg) skal kvantificeres. Alternativt, hvis der er fluorescens induktion i behandlingen, men fluorescens producerer ikke en veldefineret top, der er sandsynlige kontaminering af en højere affinitet elektron acceptor som O2 og bør træffes foranstaltninger til at fjerne spor af ilt fra alle løsninger og eksperimentet skal udføres igen.

Representative Results

Når fluorescens toppe har opgjort ifølge trin 5.3, kan resultatet af fluorescens toppe grafen efter den variable koncentration illustrerer, hvordan denne variabel påvirker den relative biotilgængelighed enten Hg eller Cd. For eksempel, vil fluorescens over [HgII] fra figur 2 kalibreringskurve give inducerbar data præsenteret i figur 3A. Til HgII kalibrering, kurve vil altid indeholde 3 komponenter til Hg-inducerbar stammen; en tærskel svar på omkring 1-2 nM HgII før fluorescens signal produktion er lineært proportionelt til [HgII], det lineære område hvor 5 nM HgII pålideligt altid vil være i midten af dette område, og et plateau hvor øge [HgII] vil ikke længere øge fluorescens signal. Ingen ændring i signal produktion på den konstituerende stamme viser, at toksicitet fra [HgII] ikke påvirker signalet produktion. CdII i figur 3Ber der altid 2 komponenter for inducerbar stamme; en lineære område hvor 200-300 nM CdII bliver pålideligt altid i midten af det lineære område og et plateau. Et fald i fluorescens signal med stigende [CdII] viser, at højere Cd koncentrationer er giftigt for celler og kan forklare en nedgang i inducerbar fluorescens produktionen efter plateau ved 1000 nM CdII. Derfor, når du tester Hg eller Cd biotilgængelighed med hensyn til en miljømæssig variable, vi foreslår at bruge 5 nM for HgII og 300 nM for CdII.

I nogle tilfælde signal produktion kan korrekt tilskrives Hg eller Cd biotilgængelighed, men i andre tilfælde signal produktion kan blive påvirket af variation i biosensor celle vært fysiologiske tilstand (f.eks. metal af interesse eller miljøforhold testet er giftige). I figur 4A, 5 nM Hg biotilgængelighed blev testet over et forløb af Zn (0-10 µM). I både Hg-inducerbar og konstituerende stammer er der et lignende fald i signal med stigende Zn koncentrationer. Derfor, man kan ikke diskriminere om signalet er et resultat af sænkede biotilgængelighed eller er et resultat af Zn toksicitet. I figur 4B og 4 C, 5nM Hg biotilgængelighed blev testet over et forløb af MgII (0-10 mM) og MnII (0-10 µM). Stigende MgII og MnII koncentrationer faldt fluorescens signal af den inducerbare stamme. På den anden side den konstituerende stamme ikke viser et fald i fluorescens med stigende MgII og MnII koncentrationer (MgII og MnII er til gavn for cellerne i produktionen af FbFp, som det fremgår af en stigning i fluorescens-signalet). Dette viser, at cellerne er levedygtig og fluorescens faldet af Hg-inducerbar stammen resultater fra et fald i Hg biotilgængelighed. Denne data understreger, hvor vigtigt det er for alle biosensor assays til også give konstitutiv målinger af overordnede celle fitness.

Figure 3
Figur 3: lineær intervaller af biosensor med kviksølv og Cadmium. Maksimale fluorescens måles som relativ fluorescens enheder (RFU) ± 1 standardafvigelse fra E. coli NEB5α husly pUC57merR-Pp (Hg-inducerbar) og pUC19Balch-Pp (Constitutive) med tilføjelse af A) HgII (0-15 nM) og B) CdII (0-1.000 nM) under anaerobe forhold. Fluorescens var gennemsnittet af 3 tekniske replikater på 37 ˚C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: eksempel på et usikkert resultat med zink og en afgørende resultat med Magnesium og mangan. Maksimale fluorescens måles som relativ fluorescens enheder (RFU) ± 1 standardafvigelse fra E. coli NEB5α husly pUC57merR-Pp (Hg-inducerbar) og pUC19Balch-Pp (Constitutive) med tilføjelse af A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), og C) MnII (0-10 µM) under anaerobe forhold. [HgII] blev sat til 5 nM for alle behandlinger og fluorescens var gennemsnittet af 3 tekniske replikater på 37 ˚C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Mikrobielle biosensorer er nyttige værktøjer til at identificere mekanismer som metaller interagerer med mikrober. Her, vi beskriver en metode, der kan anaerobt kvantificere HgII og CdII biotilgængelighed til en Gram-negative vært celle (E. coli) og give en kvantificerbar resultat inden for et par timer. En af de store styrker af denne protokol er at det giver omfattende kontrol af metal typebestemmelse på mellemlang og eksponering ved at undgå stærke binding ligander eller komponenter, der kan føre til metal nedbør. Metal artsdannelse har modelleret og afprøvet i denne eksponering medium ved hjælp af PHREEQC17, men andre metal artsdannelse software kan installeres. Ingen ekstra ligander, Hg artsdannelse forventes at være til stede som 97% Hg(OH)2 og 3% Hg (NH3)22 +, mens Cd typebestemmelse vil være til stede ved som 59% Cd-β-Glycerophosphate, 25% Cd2 +og 16% CdSO4. Ved hjælp af en simpel termodynamiske modellering software, kan brugeren designe eksponering medier og teste for biotilgængeligheden af metal af interesse. Biosensor vært celle (E. coli NEB5α) er derudover levedygtige over en bred vifte af pH (5-8,5) og NaCl koncentration (0-0,55 M)17.

HG methylering er en anaerob proces, og den protokol, der er skitseret i denne undersøgelse har ikke et krav for ilt, giver mulighed for mere præcis beskrivelse af anaerobe metabolisme på metal biotilgængelighed. Dette er vigtigt, fordi tilstedeværelsen af ilt ændrer gen expression profiler48,49 og dermed potentialet transport veje; derfor udgør denne metode en fordel frem for øjeblikket eksisterer aerob alternativer. Den biosensing konstruktion præsenteres her kan potentielt bruges med andre anaerobe værter, der kan være mere relevante for kviksølv methylering (f.eks. Geobacter, Desulfovibrio), men måske mindre tractable end E. coli. En nuværende begrænsning af tilgang præsenteres her er, at vores grænse for registrering endnu ikke har nået pM niveauer, i modsætning til eksisterende aerobe systemer4,19,37. Det er dog vigtigt at bemærke, at for at opnå disse lave påvisningsgrænser flere skridt skal tages44: Jeg) ligand tilføjelse er forpligtet til at sikre, at Hg forbliver i løsning og ikke adsorberes på mikrobiel cellevæggen (Hg vil være uoprettelige bundet til cellens overflade dithioler forhindrer dens biotilgængelighed25,27; Se tærskel svar til Hg i figur 3A), ii) ændringer til celle tæthed, eller iii) ændre genkonstruktion til også at omfatte transport proteiner af mer-operon (nemlig merT og merP), stigende Hg flux inde i cellen50,51. Disse ændringer ville være gavnlige i forbindelse med afsløring lave koncentrationer af Hg, men ikke nødvendigvis ideel ved vurderingen miljømæssigt relevante situationer. Tidligere cadmium biosensorer findes primært som en "proof of princippet", var de designet i komplekse medier, der ikke tillader investigator at vurdere rollen som artsdannelse biotilgængelighed41,42, 43 , 44.

Biosensor er et utroligt nyttigt redskab til bestemmelse af mekanismer som metal arter er biotilgængelige. Fordi værtsorganismen ikke er en Hg-methylator, kan den kun bruges til at udvikle en model for hvordan Hg kan indtaste Gram-negative bakterier og ikke en endelig rationale for hvordan Hg-methylators erhverve Hg. Der findes andre metoder til bestemmelse af Hg biotilgængelighed, såsom methylering, som et resultat af optagelsen eller brug af en massebalance tilgang10,15,20,45,46. Når det er sagt, tilbyder metoden præsenteres her fordel af kvasi realtid biotilgængelighed data i levedygtige celler. Vi anbefaler ikke, at denne metode bruges til at kvantificere samlede Hg eller Cd niveauer i en miljømæssig matrix. Trods den påtænkte anvendelse af biosensorer til at bestemme metal koncentrationer i miljøet36, er mange mere let tilgængelige standard metoder tilgængelige som ICP-MS, Frederiksen (for Cd analyse) eller kolde damp atomic absorption spektroskopi (for Hg analyse). Biosensor kan dog bruges til at afgøre, om en given miljømæssige matrix har potentiale til at fremme eller hæmme biotilgængelighed; Dette opnås ved at udføre standardopløsninger.

PH af eksponering medier kan ændres til hvor som helst inden for intervallet af 5 og 8,5, forudsat MOPS fri syre (buffer) udveksles med en alternativ fri syre af en buffer med den bør pKa (Se venligst listen over relevante buffere (Ferreira et al. (2015) 47) og justeret med KOH passende pH-værdi, når du foretager eksponering mediet. Derudover metoden er ikke begrænset til Hg og Cd, men kan udvides til andre metaller ved hjælp af andre transskription regulatorer.

Eksponering assay kan ændres for at udforske andre elektronacceptorer O2 og fumarat indflydelse på Hg eller Cd biotilgængelighed. Mindre ændringer til metoden til at udnytte både O2 og fumarat som elektronacceptorer er tilgængelige efter anmodning.

I sammendrag, vi gerne vil fremhæve følgende punkter: jeg) det er bydende nødvendigt, at koncentrationerne af Cd eller Hg bestande er kendt i trin 2, da disse skal bruges til at kalibrere biosensor. II) på dagens eksponering væksten af celler skal være stoppet ved en OD600 på 0,6 (± 0,1) og den omhu, når resuspending cellekulturer, som biosensor er kalibreret til denne celle tæthed. III) endelig er det vigtigt, at eksponering medium er gjort grundigt på dagens eksponering. For at sikre succes i protokollen, flere kulturer bør dyrkes samtidigt (for at omgå muligheden for vækst fiasko) og vækstmediet bør være genskabt ugentligt (for at omgå metastability medier og eventuel forurening). Det skal også bemærkes, at biologiske flergangsbestemmelser (flere cellekulturer) express variabilitet, når det kommer til at signalere produktion. Selv om de fluorescerende svar kan variere fra kultur til kultur, bør de fluorescerende tendenser som reaktion på en given variabel forblive den samme i hele mange biologiske replikater.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke bemærkninger fra to anonyme anmeldere som godt medlemmer af Poulain Lab for indsigtsfulde diskussion om udviklingen i den anaerobe biosensor. En tidlig forsker Award fra provinsen Ontario og Discovery tilskud og en accelerator supplement fra naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada til A.J.P. finansieret denne undersøgelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 ml standard vial, rounded interior Delta Scientific 200-007-20 34 recommended
Vial tray, 21 mm openings Delta Scientific 730-2001 4 for (4 x 8 grid)
24 mm Closure Delta Scientific 600-024-01 32 recommended
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 Corning Corning 3931
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate Corning Corning 3651
Anaerobic Chamber (glovebox) The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %)
Palladium catalyst Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.
Microplate reader
450 (±10) nM filter for the microplate reader
500 (±10) nM filter for the microplate reader
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers
Spectrophotometer Modified for anaerobic culture tubes
MA-3000 (mercury analyzer)
pH probe Any pH probe will work
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe
Sterile/clean glass bottles For growth media and standards
Sterile/clean plastic or PTFE bottles For alkali solutions (NaOH/KOH)
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Sterile Milli-Q water Autoclaved or filter sterilized is fine.
Lysogeny Broth
Analytical grade H2SO4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Futsaeter, G., Wilson, S. The UNEP Global Mercury Assessment: Sources, Emissions and Transport. E3S Web of Conferences. 1, 36001 (2013).
  2. Barkay, T., Gillman, M., Turner, R. R. Effects of dissolved organic carbon and salinity on bioavailability of mercury. Applied and Environmental Microbiology. 63 (11), 4267-4271 (1997).
  3. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  4. Golding, G. R., et al. Evidence for facilitated uptake of Hg(II) by Vibrio anguillarum and Escherichia coli under anaerobic and aerobic conditions. Limnology and Oceanography. 47 (4), 967-975 (2002).
  5. Golding, G. R., Sparling, R., Kelly, C. A. Effect of pH on intracellular accumulation of trace concentrations of Hg(II) in Escherichia coli under anaerobic conditions, as measured using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 74 (3), 667-675 (2008).
  6. Chiasson-Gould, S. A., Blais, J. M., Poulain, A. J. Dissolved Organic Matter Kinetically Controls Mercury Bioavailability to Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (6), 3153-3161 (2014).
  7. Schaefer, J. K., Szczuka, A., Morel, F. M. M. Effect of Divalent Metals on Hg(II) Uptake and Methylation by Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (5), 3007-3013 (2014).
  8. Compeau, G., Bartha, R. Sulfate-reducing bacteria: principal methylators of mercury in anoxic estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 50 (2), 498-502 (1985).
  9. Compeau, G. C., Bartha, R. Effect of salinity on mercury-methylating activity of sulfate-reducing bacteria in estuarine sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (2), 261-265 (1987).
  10. Gilmour, C. C., Henry, E. A., Mitchell, R. Sulfate stimulation of mercury methylation in freshwater sediments. Environmental Science & Technology. 26 (11), 2281-2287 (1992).
  11. Rani, A., Kumar, A., Lal, A., Pant, M. Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity: a review. International Journal of Environmental Health Research. 24 (4), 378-399 (2014).
  12. Liu, F., Fortin, C., Campbell, P. G. C. Can freshwater phytoplankton access cadmium bound to low-molecular-weight thiols? Limnology and Oceanography. 62 (6), 2604-2615 (2017).
  13. Shahid, M., Dumat, C., Khalid, S., Niazi, N. K., Antunes, P. M. C. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. de Voogt, P. 241, Springer International Publishing. 73-137 (2017).
  14. Hsu-Kim, H., Kucharzyk, K. H., Zhang, T., Deshusses, M. A. Mechanisms regulating mercury bioavailability for methylating microorganisms in the aquatic environment: a critical review. Environmental Science and Technology. 47 (6), 2441-2456 (2013).
  15. Szczuka, A., Morel, F. M. M., Schaefer, J. K. Effect of Thiols, Zinc, and Redox Conditions on Hg Uptake in Shewanella oneidensis. Environmental Science and Technology. 49 (12), 7432-7438 (2015).
  16. Schaefer, J. K., et al. Active transport, substrate specificity, and methylation of Hg(II) in anaerobic bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8714-8719 (2011).
  17. Stenzler, B. R., Hinz, A., Ruuskanen, M. O., Poulain, A. J. Ionic strength differentially affects the bioavailability of neutral and negatively charged inorganic Hg complexes. Environmental Science and Technology. , (2017).
  18. Sigel, A. Cadmium: From Toxicity to Essentiality. , Dordrecht : Springer Netherlands : Imprint: Springer (2013).
  19. Barkay, T., Turner, R. R., Rasmussen, L. D., Kelly, C. A., Rudd, J. W. Luminescence facilitated detection of bioavailable mercury in natural waters. Methods in Molecular Biology. 102, Clifton, N.J. 231-246 (1998).
  20. Zhang, T., et al. Methylation of mercury by bacteria exposed to dissolved, nanoparticulate, and microparticulate mercuric sulfides. Environmental Science and Technology. 46 (13), 6950-6958 (2012).
  21. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  22. Moreau, J. W., et al. The Effect of Natural Organic Matter on Mercury Methylation by Desulfobulbus propionicus 1pr3. Frontiers in Microbiology. 6 (1389), (2015).
  23. Schaefer, J. K., Morel, F. M. M. High methylation rates of mercury bound to cysteine by Geobacter sulfurreducens. Nature Geoscience. 2 (2), 123-126 (2009).
  24. Dunham-Cheatham, S., Farrell, B., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of chloride on the adsorption of Hg onto three bacterial species. Chemical Geology. 373, 106-114 (2014).
  25. Dunham-Cheatham, S., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of natural organic matter on the adsorption of mercury to bacterial cells. Geochimica et Cosmochimica Acta. 150, 1-10 (2015).
  26. Mishra, B., Shoenfelt, E., Yu, Q., et al. Stoichiometry of mercury-thiol complexes on bacterial cell envelopes. Chemical Geology. 464, 137-146 (2017).
  27. Sara Anne, T., Qing, M., Jean-François, G. Probing changes in Hg(II) coordination during its bacterial uptake. Journal of Physics: Conference. 712 (1), 012078 (2016).
  28. Macek, T. Microbial Biosorption of Metals. , Springer. Netherlands. (2011).
  29. Ledin, M., Pedersen, K., Allard, B. Effects of pH and Ionic Strength on the Adsorption of Cs, Sr, Eu, Zn, Cd and Hg by Pseudomonas Putida. Water, Air, and Soil Pollution. 93 (1-4), 367-381 (1997).
  30. Daughney, C. J., Fein, J. B. The effect of ionic strength on the adsorption of H+, Cd2+, Pb2+ and Cu2+ by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis: A surface complexation model. Journal of Colloid and Interface Science. 198 (1), 53-77 (1998).
  31. Borrok, D. M., Fein, J. B. The impact of ionic strength on the adsorption of protons, Pb, Cd, and Sr onto the surfaces of Gram negative bacteria: testing non-electrostatic, diffuse, and triple-layer models. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 110-126 (2005).
  32. Daguené, V., et al. Divalent Base Cations Hamper HgII Uptake. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6645-6653 (2012).
  33. Turner, D. R. Speciation and cycling of arsenic, cadmium, lead and mercury in natural waters. Lead, Mercury, Cadmium and Arsenic in the Environment. , 175-186 (1987).
  34. Liu, G., Cai, Y., O'Driscoll, N. Environmental Chemistry and Toxicology of Mercury. , John Wiley & Sons. (2011).
  35. North, A. E., Sarpong-Kumankomah, S., Bellavie, A. R., White, W. M., Gailer, J. Environmentally relevant concentrations of aminopolycarboxylate chelating agents mobilize Cd from humic acid. Journal of Environmental Sciences. 57, 249-257 (2017).
  36. Van Der Meer, J. R., Belkin, S. Where microbiology meets microengineering: design and applications of reporter bacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (7), 511-522 (2010).
  37. Rasmussen, L. D., Turner, R. R., Barkay, T. Cell-density-dependent sensitivity of a mer-lux bioassay. Applied and Environmental Microbiology. 63 (8), 3291-3293 (1997).
  38. Magrisso, S., Erel, Y., Belkin, S. Microbial reporters of metal bioavailability. Microbial Biotechnology. 1 (4), 320-330 (2008).
  39. Golding, G. R., Kelly, C. A., Sparling, R., Loewen, P. C., Barkay, T. Evaluation of mercury toxicity as a predictor of mercury bioavailability. Environmental Science and Technology. 41 (16), 5685-5692 (2007).
  40. Drepper, T., et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. Nature biotechnology. 25 (4), 443-445 (2007).
  41. Kumar, S., Verma, N., Singh, A. K. Development of cadmium specific recombinant biosensor and its application in milk samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 240, 248-254 (2017).
  42. Yoon, Y., et al. Simultaneous detection of bioavailable arsenic and cadmium in contaminated soils using dual-sensing bioreporters. Applied and Environmental Microbiology. 100 (8), 3713-3722 (2016).
  43. Kang, Y., Lee, W., Jang, G., Kim, B. G., Yoon, Y. Modulating the sensing properties of Escherichia coli-based bioreporters for cadmium and mercury. Applied and Environmental Microbiology. 102 (11), 4863-4872 (2018).
  44. Hynninen, A., Tõnismann, K., Virta, M. Improving the sensitivity of bacterial bioreporters for heavy metals. Bioengineered Bugs. 1 (2), 132-138 (2010).
  45. Graham, A. M., Bullock, A. L., Maizel, A. C., Elias, D. A., Gilmour, C. C. Detailed assessment of the kinetics of Hg-cell association, Hg methylation, and methylmercury degradation in several Desulfovibrio species. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7337-7346 (2012).
  46. Graham, A. M., Aiken, G. R., Gilmour, C. C. Dissolved Organic Matter Enhances Microbial Mercury Methylation Under Sulfidic Conditions. Environmental Science & Technology. 46 (5), 2715-2723 (2012).
  47. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions-a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  48. Salmon, K., Hung, S. P., Mekjian, K., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global gene expression profiling in Escherichia coli K12: the effects of oxygen availability and FNR. Journal of Biological Chemistry. 278 (32), 29837-29855 (2003).
  49. Salmon, K. A., Hung, S. P., Steffen, N. R., Krupp, R., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global Gene Expression Profiling in Escherichia coli K12 effects of oxygen availability and ArcA. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 15084-15096 (2005).
  50. Larose, C., Dommergue, A., Marusczak, N., Coves, J., Ferrari, C. P., Schneider, D. Bioavailable mercury cycling in polar snowpacks. Environmental Science & Technology. 45 (6), 2150-2156 (2011).
  51. Omura, T., Kiyono, M., Pan-Hou, H. Development of a specific and sensitive bacteria sensor for detection of mercury at picomolar levels in environment. Journal of Health Science. 50 (4), 379-383 (2004).

Tags

Miljøvidenskab sag 142 Biosensor kviksølv Cadmium anaerobe biotilgængelighed Metal typebestemmelse
En anaerob Biosensor Assay til påvisning af kviksølv og Cadmium
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stenzler, B. R., Gaudet, J.,… More

Stenzler, B. R., Gaudet, J., Poulain, A. J. An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium. J. Vis. Exp. (142), e58324, doi:10.3791/58324 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter