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Eine anaerobe Biosensor-Test zum Nachweis von Quecksilber und Cadmium

Published: December 17, 2018 doi: 10.3791/58324
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Ottawa

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine anaerobe mikrobielle Biosensor ganze Zelle verwenden, um wie verschiedene Umgebungsvariablen zu bewerten beeinflussen die Bioverfügbarkeit von Hg und Cd auf Bakterien im anoxischen Umgebungen.

Abstract

Quecksilber (Hg) Bioverfügbarkeit Mikroben ist ein wichtiger Schritt zu toxischen Hg Biomagnifikation in Nahrungsketten. Cadmium (Cd) Transformationen und Bioverfügbarkeit auf Bakterien steuern die Menge, die in Grundnahrungsmittel sammeln wird. Die Bioverfügbarkeit dieser Metalle ist abhängig von ihrer Speziation in Lösung, sondern vor allem unter anoxischen Bedingungen wo Hg ist, toxische Monomethylmercury (MeHg) methyliert und Cd besteht in der Rhizosphäre. Ganze Zelle mikrobielle Biosensoren geben eine quantifizierbare Signal, wenn eine Metall die Zellflüssigkeit betritt und folglich nützliche Werkzeuge sind, Metall Bioverfügbarkeit zu beurteilen. Leider haben die meisten Biosensoren Bemühungen bisher oxischen Umgebungen durch die begrenzte Fähigkeit der vorhandenen Reporter Proteine Funktion in Abwesenheit von Sauerstoff abhängig gemacht worden. In dieser Studie stellen wir unsere Bemühungen zu entwickeln und zu optimieren eine ganze Zelle Biosensor-Assay funktionstüchtige anaerob, die Metalle unter anoxischen Bedingungen in quasi-Echtzeit und innerhalb von Stunden erkennen kann. Wir beschreiben, wie der Biosensor helfen kann wie chemische Variablen relevant zu den ökologischen Radsport Metalle beeinflussen ihre Bioverfügbarkeit zu beurteilen. Das folgende Protokoll enthält Methoden zur Vorbereitung (1) Hg und Cd-Standards unter anoxischen Bedingungen, (2) Vorbereitung der Biosensor in Abwesenheit von Sauerstoff, (3) Gestaltung und führen ein Experiment, um festzustellen, wie eine Reihe von Variablen beeinflusst Hg oder Cd Bioverfügbarkeit und (4) zu quantifizieren und zu interpretieren Biosensor-Daten. Wir zeigen die lineare reicht von der Biosensoren und geben Beispiele zeigen die Methode Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Metall Bioverfügbarkeit und Toxizität durch die Verwendung von Metall-induzierbaren und konstitutive Stämme.

Introduction

Quecksilber (Hg) ist ein globaler Schadstoff und seiner Bioverfügbarkeit, Hg methylating Mikroben ist der erste Schritt in Richtung der Biomagnifikation durch Nahrungsnetze und neurotoxischen Nebenwirkungen beim Menschen und Tiere1. Es wird derzeit vermutet, dass mikrobielle Hg-Methylierung ist eine intrazelluläre Prozess, erfordert: (i) die Arten der Hg zu bioverfügbaren2,3,4,5,6,7 und Ii) für die Zelle physiologisch Hg8,9,10methylating werden. Cadmium (Cd) Bioaccumulates in Organismen, aber tut nicht Biomagnifies im Nahrungsnetz und ist weit verbreitet in industriellen und gewerblichen Prozessen, die verursachen häufig akute Expositionen in den Menschen und der Umwelt11. Obwohl Mikroben in das Schicksal der Hg in der Umgebung mehrere wichtige Rollen spielen, konzentrieren sich die meisten Studien über Cd Geochemie und Ökotoxikologie auf mikrobielle Eukaryoten12. Verbrauch von landwirtschaftlichen Kulturen (z.B. Reis) ist die wichtigste Quelle für direkte Einwirkung von Cadmium; in diesem Fall die Bioverfügbarkeit von Cd Mikroben der Rhizosphäre beeinflusst direkt die Menge Pflanzen13ansammeln können.

Hg-Transportwege sind komplex und umfassen möglicherweise einen aktiven Transport Schritt14. Wenn ein Transporter beteiligt ist, den letzten Arbeit vorgeschlagen, dass HgII eine Zn nutztII oder MnII Transporter7,15,16,17. Während CdII vermutet wird, um versehentlich transportiert werden Mechanismen der CdII transport in das Zytosol durch zweiwertigen Metall Transportwege (besonders MnII oder ZnII), im Inneren der Zellen bleiben spekulativ und nicht Cd-spezifische Transport Weg wurde identifizierten13,18. Unabhängig von der Art der Transporter beteiligt, drei mechanistische Faktoren bestimmen letztlich die Fähigkeit der Metalle in eine Zelle eingeben: (i) das Metall Speziation in Lösung2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, Ii) die Biophysiochemical Eigenschaften der Zellmembran17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, und Iii) die Möglichkeit, dass das Metall auf einen Transport Seite7,32zugreifen. CD und Hg dürften existiert als freie Ionen mikrobielle physiologisch relevanten Bedingungen aufgrund ihrer hohen Affinität für gelöste organische Angelegenheit (DOM), chelatisierenden Verunreinigungen (z. B. EDTA) oder Schwefel Moieties33reduziert, 34,35 (CdII kann als eine freie Ionen oder Form-Ionenpaare in Ermangelung dieser Liganden vorhanden). Gibt es ein Mangel an effizienten Methoden bei der Bestimmung, wie diese Metall Arten bioverfügbar unter Bedingungen, die für ihr Schicksal in die Umwelt relevant sind. Zum Beispiel Hg ist unter anaeroben Bedingungen14methyliert und Cadmium und Hg sind weiche Metalle (oder Klasse B kationen), verlangt, dass ihre Artbildung unter Bedingungen untersucht werden, die die Integrität der reduzierten Schwefel Gruppen verwalten.

Mikrobielle Biosensoren sind bakterielle Zellen, die eine quantifizierbare Signal als Reaktion auf die intrazellulären Konzentrationen eines Metalls, in diesem Fall Hg oder Cd abgeben. Als solche sind sie ideale Instrumente zu verstehen, wie Metalle eine Zelle36, betreten, sofern die Bedingungen für sorgfältig kontrolliert werden. Hg-Biosensoren enthalten in der Regel gen Fusionen zwischen den regulatorischen Schaltung der Mer-Operon (einschließlich Gene Kodierung für die Transkription Regler MerRas sowie die Betreiber und Veranstalter Regionen die Operon) und reporting Gene (z.B. Lux, GLP, Lac Gene). Wenn Quecksilber in das Zytoplasma vorhanden ist, wird es an GESEG, was in der Transkription der berichtenden Gene und nachfolgende Signal Produktion19,37binden. Spezielle Cd Biosensoren dienen in der Regel mit CadC CadAC, ZntA oder ZntR codiert Transkription Regulierungsbehörden38, aber es ist erwähnenswert, dass GESEG eine niedrigere, aber messbare Affinität zu Cd5. Durch aerobe Beschränkung der meisten gängigen lumineszierenden oder fluoreszierende Reporter Proteine, bis vor kurzem mikrobielle Biosensoren nicht in der Lage blieb, bieten Einblicke in die Biotransformation von Metallen unter anoxischen Bedingungen. Dies erschwert anaeroben Nachweis von Metallen Bioverfügbarkeit über eine Reihe von Bedingungen für ihr Umweltverhalten, speziell im Beisein von Redox sensible Liganden (z. B. Sulfid und Thiole)4, 5 , 39.

Zur Linderung die methodische Hürde der Leben Bildgebung in der Abwesenheit von Sauerstoff, Drepper Et al. (2007) haben ein Flavin-basierte fluoreszierendes Protein (FbFp) entwickelt, basierend auf Licht Sauerstoff Spannung Domäne SB2 Protein von p. Putida. Dieser Proteinfamilie ist in der Lage, in der Abwesenheit von Sauerstoff40fluoreszieren. Aufbauend auf der Arbeit von Drepper Et Al., entwickelt unser Labor eine anaerobe Biosensor, so dass für das Studium der Hg Bioverfügbarkeit unter oxischen und anoxischen Bedingungen und über einen weiten Bereich von Salzgehalt 17. Im aktuellen Papier beschreiben wir wie Sie vorbereiten und verwenden der Biosensor, um ökologische Variablen Einfluss auf Hg oder Cd Bioverfügbarkeit zu testen. Obwohl wir der Biosensor für HgIIentwickelt, entschieden wir uns für Experimente mit CdII als ein Mittel, um die Aufmerksamkeit des Lesers auf die Tatsache lenken, dass Biosensoren auch auf mehrere Stressoren reagieren können, die in ökologischen zusammen auftreten dürften durchführen Matrizen; in diesem Fall war CdII untersucht, weil es zum Binden an der transcriptional Regulator GESEG5bekannt ist. Hier zeigen wir repräsentative Kalibrierung und funktionale lineare Bereiche in Bezug auf entweder Metall. Wir geben auch ein Beispiel, wenn der Biosensor Ergebnisse schlüssig (MgII und MnII auf Hg Bioverfügbarkeit) sind und nicht schlüssig (ZnII auf Hg Bioverfügbarkeit).

Protocol

1. Wachstum Medien und Exposition Medien Vorbereitung

  1. 250 mL Wachstumsmediumzu machen:
    Hinweis: Wenn die Spurenelemente #1 und Spurenelemente #2 Lösung schon bereit sind, fahren Sie mit Schritt 1.1.5.
    1. Bereiten Sie Spurenelemente #1 Lösung in einem sauberen volumetrischen Kolben (200 mL) enthält die endgültige Molarities von 1,5 x 10-3 M Na2MoO4, 6,5 x 10-4 M Na2SeO4, 5 x 10-3 M H3BO 3, und 0,1 M NaOH.
      Achtung: Starke Basen (NaOH) sind korrosiv. Wann wiegen sicher die Reagenzien um sicherzustellen, dass die endgültige Molarity die wichtigen Spurenelemente stellt zu machen; Mo, Se und B.
    2. Unter einem sterilen Bereich Filter Sterilisieren mit einem 0,22 µm Polyethersulfone Spritze Filter in einer Flasche reinigen/sterile Kunststoff/Polytetrafluorethylen (PTFE).
    3. Bereiten Sie Spurenelemente #2 Lösung in einem sauberen volumetrischen Kolben (200 mL) enthält die endgültige Molarities von 0,01 M MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO4, 3,25 X 10-3 M CoCl2, 6.25 x 10-3 M NiCl 2, und 0,1 M H2SO4.
      Achtung: Starke Säuren (H2SO4) sind korrosiv. Wann wiegen sicher die Reagenzien um sicherzustellen, dass die endgültige Molarity die wichtigen Spurenelemente stellt zu machen; MN, Zn, Co und Ni.
    4. Unter einem sterilen Bereich Filter Sterilisieren mit 0,22 µm Polyethersulfone Spritze Filter in ein sauberes Glas-Flasche.
    5. Unter einem sterilen Bereich in einer reinigen/sterile Glasflasche (mindestens 250 mL); Fügen Sie 200 mL Reinstwasser, 42,5 mL M9 Minimal salzen (5 X; siehe Tabelle der Materialien), 2,5 mL 2 M Glucose, 125 µL 2 M MgSO4, 1200 µL 0,6 M Thiamin HCl aus einem gefrorenen (-20 ° c) Aliquoten, 1,25 mL 4 M NaNO3 , 770 µL 0,075 M L-Leucin / L-Isoleucin / Valin Lösung, 250 µL Spurenelemente #1250 µL Spurenelements #2und 250 µL 0,01 M EDTA Natrium Salz.
      Hinweis: Alle Reagenzien im Schritt 1.1.5 sollte Prior und sterilisiert mit einem 0,22 µm Polyethersulfone Spritze Filter Filter vorbereitet werden. Reinstwasser kann mit einem Autoklaven sterilisiert werden.
    6. Nehmen Sie die Glasflasche jetzt mit Lösung aus Schritt 1.1.5., lose Kappe es und die anaerobe Kammer Schleuse durchlaufen.
    7. Fügen Sie in der anaeroben Kammer15 µL 0,225 M FeSO4 in 0,2 M H2SO4, Flasche fest verschließen und schütteln, bis alle weißen Ausscheidungen verschwinden hinzu.
      Hinweis: Alle Reagenzien im Schritt 1.1.7 sollte Prior und sterilisiert mit einem 0,22 µm Polyethersulfone Spritze Filter Filter vorbereitet werden. Speichern Sie die 0,225 M FeSO4 in 0,2 M H2SO4 in der anaeroben Kammer.
    8. Flasche Kappe entfernen, warten Sie 1 Minute für Luft auszutauschen, ersetzen Sie die Kappe von der Flasche und dann kräftig schütteln. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
    9. Kappe fest auf der Flasche befestigen, entfernen von anaeroben Kammerund Flasche im Kühlschrank (4 ° c) bis zu seiner Verwendung zu speichern.
    10. Wachstumsmedium sollte einmal pro Woche neu angefertigt werden durch Wiederholen der Schritte 1.1.5 auf 1.1.9.
  2. 100 mL Exposition Medium in 2 x 50 mL konische sterile Polypropylen Zentrifuge Rohre machen:
    Hinweis: Wir empfehlen, dass die Exposition Medium vorbereitet am Tag der Exposition Assay zur Minimierung des Risikos einer Kontamination, aber es kann im Voraus gebucht werden und im Kühlschrank aufbewahrt.
    1. In der anaeroben Kammer, je 50 mL Zentrifugenröhrchen hinzufügen 42 mL anaerobe Reinstwasser, 350 µL 1 M Natrium Beta-Gylcerophosphate aus einem gefrorenen (-20 ˚C) Aliquoten, 2 mL 1 M MOPS SO frei von Säure, 50 μL 1 M (NH4)24 , 125 μL von 2 M Glucose, 300 μL von 2,5 M KOH und 200 μL von 2,5 M NaOH.
      Hinweis: Alle Reagenzien im Schritt 1.2.1 sollte Prior und sterilisiert mit einem 0,22 µm Polyethersulfone Spritze Filter Filter vorbereitet werden. Hochreines Wasser kann Wärme mit einem Autoklaven sterilisiert werden. 2,5 M NaOH und 2,5 M NaOH dürfen in Kunststoff/PTFE Flaschen aufbewahrt werden. Alle Reagenzien aufgeführt müssen in der anaeroben Kammer außer Natrium Beta-Gylcerophosphate, die in einer Tiefkühltruhe (-20 ° c) gelagert werden soll gespeichert werden. Im Allgemeinen ist es ratsam, alle Teile aus Kunststoff oder Glas und Behälter für mehrere Tage in der anaeroben Kammer um sicherzustellen, dass keine Spuren von Sauerstoff zu verlassen.
    2. Kappe die 50 mL-Zentrifuge-Röhren, gut schütteln und ein 10 mL Aliquot zur Messung des pH-Wertes zu entfernen. Der gemessene pH-Wert dieser Exposition Medien muss immer 7,00 ± 0,02 bei 25 ° cmessen. Wenn der pH-Wert nicht innerhalb dieses Bereichs zu messen, passen Sie das Volumen der zusätzlichen 2,5 M KOH, dies zu korrigieren.
      Hinweis: Titrieren Sie nie die Lösung mit einer pH-Elektrode für den pH-Wert zu korrigieren. pH-Sonden repräsentieren Verunreinigungsquelle für die Belichtung Medium. Der pH-Wert muss immer ein Produkt der zusätzlichen Reagenzien im Schritt 1.2.1 betragen.
  3. Bereiten Sie eine 5-10 mM NaNO3 -Stammlösung und lassen in anaeroben Kammer während der Zeit der Exposition Assayverwendet werden.
    Hinweis: Es ist einfacher, ein konzentrierter NaNO3 Primärnormal im Gegensatz zu machen eine 5-10 mM NaNO3 Primärnormal verdünnen.

2. Vorbereitung von Quecksilber und Cadmium-Standards.

  1. Zubereitung einer 4-8 µM Mercuric (HgII) Lösung in 0,2 M H2SO4.
    1. Bereiten Sie einen Hg2 + Standard durch Herstellung eines millimolaren (1-10 mM) HgCl2, HgNO3 oder HgSO4 Lösung in 0,2 M H2SO4.
      Achtung: Quecksilber ist hochgiftig und H2SO4 ätzend ist. Arbeiten Sie in Rauch Hauben mit allen erforderlichen persönlichen Schutzausrüstungen.
    2. Verdünnen Sie in einer PTFE-Flasche Standard ab 2.1.1. in 0,2 M H2SO4 bis eine Konzentration im Bereich von 4-8 µM Hg2 +zu erhalten.
      Hinweis: Die Säure verwendet muss sein analysenrein H2SO4.
    3. Die Hg-Konzentration von 2.1.2 sollte mit einem Quecksilber-Analysator überprüft werden (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Andere Methoden zur Validierung der Hg-Konzentration können verwendet werden.
  2. Vorbereitung einer 10 µM CdII Lösung in 10 mM H2SO4.
    1. Bereiten Sie ein Primärnormal CdCl2 (10-50 mM Bereich für genaues Wägen von Pulver) in 0,1 M H2SO4.
    2. In einer Reihe von Verdünnungsreihen in saubere Säure gespült 20 mL Borosilikat Glasfläschchen mit schwarzer phenolischen Schraubverschlüsse mit PTFE Gummizwischenlagen konfrontiert, verdünnen Sie den Standard von 2.2.1 auf 10 µM Cd2 +. Sicherstellen Sie, dass die Konzentration von H2SO4 in jeder nachfolgenden serielle Verdünnung 10 mM bleibt.

3. Vorbereitung der Biosensor für anaerobe Belastung Assay

  1. Platte der Merkur induzierbaren Biosensor (E. coli NEB5α beherbergen PUC57merR-PpFbFp) und der konstitutiv exprimierten Biosensor (E. coli NEB5α beherbergen PUC19Balch-PpFbFp) von-80 ° c Cryostock auf Lysogeny Brühe Platten mit 120 Ug/mL Ampicillin. Sehen Sie unsere bisher veröffentlichten Arbeit für Details auf die Produktion von diesen Biosensoren17.
  2. 04:30-17:00 eine Kultur in 10 mL LB (+ Amp) zu impfen und wachsen über Nacht.
    Hinweis: Ausgehend von einem Teller es dauert 2 Tage vorzubereiten die anaerobe Kultur für die Belichtung Assay (d. h. eine Kultur am Montagnachmittag (04:30-17:00 begann) werden bereit für die Belichtung Assay an um die Mittagszeit am Mittwoch). Die folgenden Schritte sind die erforderlichen mikrobiologischen Techniken notwendig, um die Kulturen am Tag der Belichtung Testvorbereitet.
    1. Nehmen Sie eine Kolonie von der Platte Kultur und 10 mL Lysogeny Brühe (LB) mit 21 µL eine 100 mg/mL Stammlösung Ampicillin Natrium-Salz (Endkonzentration ist 210 Ug/mL Amp) in einem sterilen Kultur Rohr hinzufügen.
    2. Legen Sie die Kultur in einem Inkubator/Shaker und wachsen über Nacht bei 37 ° c mit Schütteln bei 220 u/min.
  3. Am nächsten Morgen um 9 bis 10 Uhr, Aufschwemmen der Kulturkreis und im Laufe des Tages (20 % Inokulum) anaerob wachsen.
    1. Bringen Sie die Kultur aus dem Inkubator (Schritt 3.2.1) und das Wachstumsmedium (Schritt 1.1.9) in der anaeroben Kammer.
    2. 8 mL frisches Wachstumsmedium und Ampicillin (210 μg/mL) in ein steriles Röhrchen Balch hinzugeben.
    3. Sammeln Sie 2 mL der Nacht gewachsene Kultur und Transfer in ein 2 mL Microcentrifuge Schlauch. Bei 10.000 RCF Schritt für 90 Sekunden Zentrifugieren, überstand dump und in 2 mL frisches WachstumsmediumAufschwemmen. Fügen Sie die resuspendierte Kultur am Balch Rohr mit 8 mL frisches Wachstumsmedium und Ampicillin.
    4. Setzen Sie Gummistopfen mit steriler Technik sorgfältig auf die Balch Röhrchen werden auf. Aus der anaeroben Kammer entfernen Sie und in einen Inkubator/Shaker und anaerob wachsen Sie bis zu 3-17:00 bei + 37 ° c mit Schütteln bei 220 u/min.
  4. Zwischen 3 und 17:00 führen Sie eine 1 % anaerobe Inokulum in frischen Wachstumsmedium und wachsen über Nacht.
    1. Bringen Sie Balch Rohr (Schritt 3.3.4) in der anaeroben Kammer zusammen mit Wachstumsmedium. 10 mL frisches Nährmedium (1 % Inokulum) 100 µL der Kultur mit Amp (210 Ug/mL Amp) in ein steriles Röhrchen Balch hinzufügen.
    2. Setzen Sie Gummistopfen mit steriler Technik sorgfältig auf die Balch Röhrchen werden auf. Aus der anaeroben Kammerzu entfernen, legen Sie in einen Inkubator/Shaker und wachsen über Nacht bei 37 ° c mit Schütteln bei 220 u/min.
  5. Zwischen 9 und 10:00 Aufschwemmen der Kultur anaerob wachsen im Laufe des Tages (20 % Inokulum).
    1. Bringen Sie die Kultur aus dem Inkubator (Schritt 3.4.1) und das Wachstumsmedium (Schritt 1.1.9) in der anaeroben Kammer.
    2. 8 mL Wachstumsmedium und Ampicillin (210 Ug/mL Amp) in ein steriles Röhrchen Balch hinzugeben.
    3. Sammeln Sie 2 m über Nacht gewachsenen Kultur und Transfer in ein 2 mL Microcentrifuge Schlauch. Für 90 Sekunden bei 10.000 x g Zentrifugieren, überstand dump, und in 2 mL frisches Wachstumsmediumaufzuwirbeln. Fügen Sie die resuspendierte Kultur am Balch Rohr mit 8 mL frisches Wachstumsmedium und Ampicillin.
    4. Setzen Sie Gummistopfen mit steriler Technik sorgfältig auf die Balch Röhrchen werden auf. Entfernen von Kammer und in einen Inkubator/Shaker und anaerob wachsen bei + 37 ° c mit Schütteln bei 220 u/min.
  6. Überwachen Sie das Wachstum der Kultur mit einem Spektralphotometer (Schritt 3.5.4) bis ein OD600 von 0,6 erreicht ist. Achten Sie darauf, Vortex Kultur vor jeder OD lesen.
    Hinweis: Dieser Schritt dauert 3-4 Stunden und die Exposition Medium (Schritt 1.2) sollten bereit sein, während dieser Zeit sowie die Exposition Assay (Schritt 4.1).
  7. Das Wachstum zu stoppen, wenn die Kultur eines OD600 von 0,6 (±0.1) (3-4 Stunden erwartet Wachstum) erreicht.
    1. Bringen Sie Rohr in der anaeroben Kammer (Schritt 3,6) und Transfer-Kultur in 2 X 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Für 90 Sekunden bei 10.000 x g Zentrifugieren, überstand dump, und in 2 X 2 mL frisches Exposition MediumAufschwemmen.
    2. Wiederholen Sie Waschschritt 3.7.1. einmal, um jede Spur des Kulturmediumsentfernen.
  8. Kombinieren Sie beide Mikrozentrifugenröhrchen der Zellkultur (Schritt 3,7) in ein 7 mL PTFE standard Fläschchen zu Biosensor bestand in der Exposition Assay (Schritt 4) verwendet werden.
    Hinweis: Achten Sie darauf, der Biosensor bestand zu mischen, indem Sie gründlich aber sanft hin und her vor Gebrauch pipettieren. Die Methode kann hier bis zu einer Stunde angehalten werden.

(4) Exposition Assay

  1. Eine Teller-Layout zu entwerfen.
    Hinweis: Achten Sie darauf, alle Pipettieren Werte berechnet und Aktien, die vor dem Start vorbereitet haben die Exposition Assay. Wie richtig Design ein Experiment und welche Kontrollen umfassen wird im Text beschrieben. Darüber hinaus sollte das Experiment nicht gestartet werden, wenn Sauerstoff vorhanden, in der anaerobe Kammer auf die anaerobe Monitor angegeben ist.
    1. Das Platte-Layout nach 96 gut Vorlage. Um Experimente im technischen Wiederholungen von 3 auszuführen, erlaubt dies für 32 verschiedene Behandlungen, die am besten durch ein 4 x 8-Raster dargestellt wird, Fläschchen einrichten (siehe Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: 96 gut Platte (links) und einer entsprechenden 4 x 8-Raster mit PTFE Fläschchen (rechts) auf die Platte übertragen werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Hinweis: Wenn für die Rolle einer Variablen auf Hg-Aufnahme mit dem Quecksilber induzierbaren Biosensor; zwei Behandlungen Tests sind erforderlich für jede Variable: die Behandlung (Biosensor Hg Variable + Nitrat) und deren Behandlung leer (Biosensor + Variable + Nitrat). Beim Testen auf die Rolle einer Variablen auf die Physiologie der Zelle mit der konstitutiven Biosensor, zwei Behandlungen sind erforderlich für jede Variable: die Behandlung (Biosensor Hg Variable + Nitrat) und leer ( Behandlung ) Biosensor Variable + Hg). Quecksilber kann mit Cadmium ersetzt werden. Hg oder Cd wird die Variable bei der Durchführung einer Kalibrationskurve. Die konstitutiven und induzierbaren Biosensoren nicht zur gleichen Zeit (in der gleichen Platte Layout) ausgeführt werden müssen. Eine Vorlage für die Gestaltung der Platte und entsprechenden 4 x 8-Raster beim Testen von eines Konzentrationsbereich von Magnesium (Variable) ist in Tabelle 1Beispiele).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
ein Hg induzierte Biosensor, Hg, Nitrat + 0 mM Mg Hg induzierte Biosensor + Nitrat + 0 mM Mg Konstitutive Biosensor, Hg, Nitrat + 0 mM Mg Konstitutive Biosensor + Hg + 0 mM Mg
b Hg induzierte Biosensor + Hg + Nitrat + 0,1 mM Mg Hg induzierte Biosensor + Nitrat + 0,1 mM Mg Konstitutive Biosensor + Hg + Nitrat + 0,1 mM Mg Konstitutive Biosensor + Hg + 0,1 mM Mg
c Hg induzierte Biosensor, Hg, Nitrat + 1 mM Mg Hg induzierte Biosensor + Nitrat + 1 mM Mg Konstitutive Biosensor, Hg, Nitrat + 1 mM Mg Konstitutive Biosensor + Hg + 1 mM Mg
d Hg induzierte Biosensor, Hg, Nitrat + 10 mM Mg Hg induzierte Biosensor + Nitrat + 10 mM Mg Konstitutive Biosensor, Hg, Nitrat + 10 mM Mg Konstitutive Biosensor + Hg + 10 mM Mg
e

Tabelle 1: Ein Beispiel Platte Layout für die Verwendung der Biosensor, um Hg Bioverfügbarkeit zu testen (5 nM) über ein Gefälle von Magnesium (0-10 mM)

  1. Richten Sie die 4 x 8-Raster entsprechend der Assay-Platte-Layout.
    1. Platz 7 mL PTFE standard Fläschchen in das Fach.
      Hinweis: PTFE Fläschchen sollte Säure gewaschen/Hitze vor Verwendung sterilisiert werden. Fläschchen sollte nur durch Manipulation der Außenseite des Röhrchens behandelt werden.
    2. Jedes Fläschchen fügen Sie die Exposition mittlerer Lautstärke entspricht jeder Behandlung hinzu.
      Hinweis: In eine Exposition mit einem Gesamtvolumen von 2.000 µL (2 mL), das zusätzliche Exposition Medium werden: Exposition Medium µL = 2.000 µL- Behandlung (leer) µL. (z. B. Exposition mittlerer µL = 2.000 – 100 µL (Biosensor) – 40 µL (Nitrat) – 100 µL (Hg ) – 100 µL (variabel (z.B. MgSO4)) = 1660 µL). Achten Sie darauf, dass das Volumen der getesteten Variablen hinzugefügt 5 % (100 µL) das endgültige Volumen nicht übersteigt.
    3. Jedes Fläschchen hinzufügen der entsprechenden Volumen der Lösung der chemische Variablen nach der Platte Layout getestet werden.
    4. Fügen Sie aus Schritt 1.3 Nitrat jedes Fläschchen hinzu, so dass die Endkonzentration 200 µM (40-80 µL) ist. Schließen Sie diesen Schritt für den konstitutiven Biosensor Behandlung Rohlinge.
    5. Ab Schritt 2.1 oder 2.2 hinzufügen Hg (5 nM beim Testen auf eine Variable) oder Cd (300 nM beim Testen auf eine Variable), die Fläschchen nach dem Teller-Layout. Schließen Sie diesen Schritt für Quecksilber induzierbaren Biosensor Behandlung Rohlinge.
      1. Bei der Verwendung von Hg 4-8 µM Bilanz zu ziehen und gut schütteln. Verdünnen Sie die Lösung in Exposition Medium in einer 7 mL PTFE Phiole, 100-250 nM , eine funktionierende Hg Lösung zu machen. Aus diesem Arbeitslösung Hg hinzufügen der erforderlichen Fläschchen. In diesem Fall eine Kalibrierkurve des Hg von 0 bis 12,5 nM.
        Hinweis: Beim Testen auf eine Variable Auswirkung auf Hg oder Cd Bioverfügbarkeit, stellen Sie sicher, dass die [Hg] oder [Cd] bleibt konstant über alle Behandlungen. Wenn Hg oder Cd hinzufügen, achten Sie darauf, eine Pipettenspitze verwenden aber berühren Sie niemals die Exposition-Medium in das Fläschchen.
  2. Schütteln Sie manuell in eine orbitale Bewegung.
    Hinweis: Das Experiment kann nun je nach Zeitaufwand für Hg oder Cd Artenbildung in Lösung angehalten werden. Wenn mehr als eine Stunde lang gelassen, legen Sie PTFE Kappen auf die PTFE-Fläschchen, Verdunstung/Kontamination zu verhindern.
  3. Sanft pipette Biosensor Lager hin und her, um Homogenität zu gewährleisten. Jedes Fläschchen 100 µL der Biosensor bestand hinzufügen. Orbital manuell schütteln.
  4. Vorbereiten den Platte Leser zum Aufwärmen um zu lesen mit folgenden Kriterien: Temperatur bei 37˚C, kinetische laufen für 10 Stunden mit liest alle 2,5-5 Minuten mit orbital schütteln dazwischen liest und Fluoreszenz-Messungen mit einem Fluoreszenzanregung 440 nm und ein Emission von 500 nm.
  5. Pipette 200 µL aus jeder PTFE-Fläschchen in der 4 x 8-Raster in die entsprechenden Vertiefungen der 96-well-Platte (schwarz, 96-Well Clear-unten unverbindlich Oberfläche Mikroplatten). Pipette hin und her vor der Übertragung jeweils 200 µL 5 Mal.
    Hinweis: Anstatt die Pipettenspitze wegzuwerfen, lassen Sie die Pipettenspitze in der PTFE-Durchstechflasche Pipettieren Fortschritte im Überblick behalten.
  6. Legen Sie die 96-well-Platte in das Fach der Platte Leser, dann setzen Sie den Deckel auf die 96-well-Platte und beginnen Sie den Test.

(5) die Daten zu quantifizieren.

  1. Die Fluoreszenz jeder Behandlung zu jedem Zeitpunkt muss für jeden einzelnen gut Lärm korrigiert und ausgeblendet die Behandlung leer.
    1. Die Fluoreszenz für jeden Zeitpunkt (t) einer jeden Behandlung (T) übersetzt werden muss, entfallen die erste Fluoreszenz (t0) an das erste Mal, dass Punkt jedes gut, dann gemittelt über die 3 Behandlungen (R1- R3 repliziert ). Diese Behandlung Durchschnitt muss dann auf die durchschnittliche Behandlung leer (TB) übersetzt in der gleichen Weise (Gleichung 1) ausgeblendet.

Fluoreszenz (t) = durchschnittliche(Tr1()t( ) – Tr1()t0(), Tr2()t( ) – Tr2 ()t0(), Tr3()t( ) – Tr3()t0()) – durchschnittliche(TB R1 ()t( ) – TBr1()t0(), TBr2()t()– TBr2( ) t0 (), TBr3()t( ) – TBr3()t0()) (1)

Hinweis: Dies sollte als eine Arbeitsblattfunktion erfolgen. Richtige Ausbreitung der Fehler sollte auch für jeden Zeitpunkt berechnet werden.

  1. Diagramm der korrigierten Fluoreszenz jeder Behandlung als Funktion der Zeit

Figure 2
Abbildung 2: Fluoreszenz-Daten als Funktion der Zeit korrigiert. Fluoreszenz gemessen als relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) emittiert von E. Coli NEB5α beherbergen die pUC57merR-Pp (induzierbaren Stamm) im Laufe der Zeit mit dem Zusatz von HgII (0-12,5 nM) unter anaeroben Bedingungen. Fluoreszenz ist, dass der Durchschnitt der 3 Technische bei 37 ° c repliziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Hinweis: Es gibt keine 0 nM Hg-Wert im Diagramm, und alle anderen Hg-Konzentrationen haben die 0 ausgeblendet worden nM Hg als Behandlung leer. Daher 0 nM Hg stellt der x-Achse und jede positive Fluoreszenz repräsentiert Fluoreszenz von Hg jede Variable gegeben. Es ist optional, um die Fluoreszenz auf diese Weise nicht leer, aber die fluoreszierenden Kurven werden irreführend Fluoreszenz-Kurven geben, wenn die Variable getestet Hintergrundfluoreszenz hat (d. h. gelöste organischen Substanz selbst fluoreszieren und wenn es keine Behandlung leer, enthält nur Zellen und gelöster organischer Substanz, zunehmende Konzentration gelöster organischer Substanz wird das Fluoreszenzsignal erhöhen).

  1. Die Fluoreszenz-Spitze zu quantifizieren. Eine quantifizierbare Fluoreszenz-Spitze wird in der Regel nach 2,5 bis 4 Stunden auftreten repräsentieren den Kraftaufwand beim Verzehr von allen 200 µM Nitrat als ein terminal Elektronen-Akzeptor. Dieser Gipfel sollte quantifiziert werden und stellt den letzten Fluoreszenz Wert dieser speziellen Behandlung.
    Hinweis: Falls keine Fluoreszenz-Spitze beobachtet (d. h. keine Hg-Bioverfügbarkeit), die Fluoreszenz der Behandlung zum Zeitpunkt der Fluoreszenz Spitze des Steuerelements (d. h. keine zusätzlichen Variablen oder 5nM Hg) quantifiziert werden sollte. Alternativ, wenn es Fluoreszenz Induktion in der Behandlung, aber Fluoreszenz keine gut definierten Gipfel erzeugt, gibt es wahrscheinlich Kontamination der eine höhere Affinität Elektronen-Akzeptor wie O2 und Maßnahmen ergriffen werden, um Spuren zu entfernen Sauerstoff aus allen Lösungen und das Experiment muss erneut durchgeführt werden.

Representative Results

Sobald die Fluoreszenz-Gipfel nach Schritt 5.3 quantifiziert worden, kann das Ergebnis der Fluoreszenz Gipfel grafisch dargestellt werden, entsprechend der Variable Konzentration veranschaulicht, wie diese Variable betrifft die relative Bioverfügbarkeit von Hg oder Cd. Zum Beispiel wird die Kalibrierkurve des Fluoreszenz über [HgII] aus Abbildung 2 induzierbaren in Abbildung 3Apräsentierten Daten ergeben. Für HgII Kalibrierung, die Kurve wird immer enthalten 3 Komponenten für die Hg-induzierbaren Belastung; eine Schwelle Antwort von ca. 1-2 nM HgII vor der Fluoreszenz-Signal-Produktion ist linear proportional zur [HgII], linearen Bereich wo 5 nM HgII werden zuverlässig immer in der Mitte des Bereichs und ein Plateau wo erhöhen [HgII] wird nicht mehr Fluoreszenzsignal. Keine Änderung in der Signal-Produktion auf dem konstitutiven Stamm zeigt, dass die Toxizität von [HgII] Signal-Produktion nicht beeinflusst. Für CdII in Abbildung 3 bgibt es immer 2 Komponenten für die induzierbaren Belastung; ein linearer Bereich wo 200-300 nM CdII zuverlässig immer in der Mitte des linearen Bereichs und einem Plateau werden. Eine Abnahme der Fluoreszenzsignal mit zunehmender [CdII] zeigt, dass höhere Konzentrationen der Cd giftig für die Zellen sind und können eine Abnahme in der induzierbaren Fluoreszenz-Produktion nach der Hochebene bei 1000 nM CdIIerklären. Daher beim Hg oder Cd Bioverfügbarkeit in Bezug auf eine Umgebungsvariable zu testen, empfehlen wir, mit 5 nM für HgII und 300 nM für CdII.

In einigen Fällen kann Signal Produktion richtig auf Hg oder Cd Bioverfügbarkeit zurückgeführt werden, aber in anderen Fällen durch Variation in den physiologischen Zustand der Biosensor Zelle Host Signal Produktion beeinträchtigt werden kann (z. B. das Metall von Interesse oder Umweltbedingungen getestet sind giftig). In Abbildung 4A, 5 nM Hg Bioverfügbarkeit wurde über ein Gefälle von Zn getestet (0-10 µM). Im Hg-induzierbaren und konstitutive Stämme gibt es eine ähnliche Abnahme Signals mit steigenden Konzentrationen Zn. Daher kann nicht man unterscheiden, ob das Signal aus gesenkten Bioverfügbarkeit resultiert oder ergibt sich aus Zn-Toxizität. In Abbildung 4 b und 4 C, 5nM Hg Bioverfügbarkeit wurde getestet, über ein Gefälle von MgII (0-10 mM) und MnII (0-10 µM). Erhöhung der MgII und MnII -Konzentration verringert das Fluoreszenzsignal der induzierbaren Belastung. Auf der anderen Seite die konstitutive Belastung nicht zeigen einen Rückgang der Fluoreszenz mit zunehmender MgII und MnII -Konzentration (MgII und MnII sind vorteilhaft für die Zellen in der Produktion von FbFp, wie eine Zunahme der Fluoreszenzsignal). Dies zeigt, dass die Zellen lebensfähig sind und die Fluoreszenz Abnahme der Hg-induzierbaren Belastung aus einem Rückgang der Hg Bioverfügbarkeit resultiert. Diese Daten betont, wie wichtig es für alle Biosensor-Assays, auch konstitutive Messungen der allgemeinen Zelle Fitness ist.

Figure 3
Abbildung 3: lineare reicht von der Biosensor mit Quecksilber und Cadmium. Maximale Fluoreszenz gemessen als relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) ± 1 Standardabweichung emittiert von E. Coli NEB5α beherbergen die pUC57merR-Pp (Hg-induzierbaren) und pUC19Balch-Pp (aufbauend) mit dem Zusatz von (A) HgII (0-15 nM) und B) CdII (0-1.000 nM) unter anaeroben Bedingungen. Fluoreszenz ist, dass der Durchschnitt der 3 Technische bei 37 ° c repliziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Beispiel für eine nicht eindeutige Ergebnis mit Zink und ein schlüssiges Ergebnis mit Magnesium und Mangan. Maximale Fluoreszenz gemessen als relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) ± 1 Standardabweichung emittiert von E. Coli NEB5α beherbergen die pUC57merR-Pp (Hg-induzierbaren) und pUC19Balch-Pp (aufbauend) mit dem Zusatz von (A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), und C) MnII (0-10 µM) unter anaeroben Bedingungen. [HgII] wurde gegründet um 5 nM für alle Behandlungen und Fluoreszenz war der Durchschnitt der 3 Technische Wiederholungen bei 37 ° c. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Mikrobielle Biosensoren sind nützliche Werkzeuge, die Mechanismen zu identifizieren, mit denen Metalle mit Mikroben interagieren. Hier beschreiben wir eine Methode, die anaerob Hg quantifizieren kannII und CdII Bioverfügbarkeit, ein gramnegatives Wirtszelle (E. Coli) und geben ein quantifizierbares Ergebnis innerhalb von wenigen Stunden. Eine der großen Stärken dieses Protokolls ist, dass es umfangreiche Kontrolle über Metall Speziation Mittel-und Belichtung durch die Vermeidung von starken Bindung Liganden oder Komponenten, die zu metallischen Niederschlägen führen können. Metall Speziation wurde modelliert und getestet in dieser Exposition Medium mit PHREEQC17, aber andere Metall Speziation Software eingesetzt werden darf. Im Falle keine zusätzlichen Liganden, Hg Speziation wird voraussichtlich als 97 % Hg(OH)2 und 3 % Hg (NH3)22 +, anwesend sein während Cd Speziation werden als 59 % Cd-β-Glycerophosphat, 25 % Cd2 +und 16 % CdSO4präsentieren. Der Benutzer kann mit einem einfachen Thermodynamische Modellierung Software, design Exposition Medien und testen für die Bioverfügbarkeit des Metalls von Interesse. Darüber hinaus ist die Biosensor Wirtszelle (E. Coli NEB5α) über einen weiten Bereich von pH (5-8,5) und NaCl-Konzentration lebensfähig (0-0,55 M)17.

Hg-Methylierung ist ein anaerober Prozess, und das Protokoll in dieser Studie beschriebenen keinen Voraussetzung für Sauerstoff, für eine genauere Beschreibung der anaeroben Stoffwechsel auf Metall Bioverfügbarkeit ermöglicht. Dies ist wichtig, weil das Vorhandensein von Sauerstoff gen Ausdruck Profile48,49 ändert und somit Potenzial Wege transportieren; Daher stellt diese Methode einen Vorteil gegenüber derzeit vorhandene aeroben Alternativen. Die hier vorgestellten Biosensoren-Konstrukt kann mit anderen anaeroben Hosts, die für Quecksilber-Methylierung (z. B. Geobacter, Desulfovibrio), aber vielleicht mehr relevant sein könnten genutzt werden weniger steuerbar als E. Coli. Eine Strombegrenzung des hier vorgestellten Ansatzes ist, dass unser Limit der Erkennung pM-Werte im Gegensatz zu bestehenden aerobe Systeme4,19,37noch nicht erreicht hat. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese niedrige Nachweisgrenzen erreichen mehrere Schritte44ergriffen werden müssen: ich) Liganden ist erforderlich, um sicherzustellen, dass Hg in Lösung bleibt und nicht auf die mikrobielle Zellwand (Hg werden irreversibel gebunden zu adsorbieren zur Zelle Oberfläche Thiole verhindert seine Bioverfügbarkeit25,27; Siehe die Schwelle Antwort für Hg in Abbildung 3A), Ii) Änderungen der Zelldichte oder Iii) ändern der genetischen Konstrukt um Transportproteine Mererweitert-Operon (nämlich MerT und MerP), zunehmende Hg Flux im Inneren der Zelle50,51. Diese Änderungen wäre bei der Aufdeckung von geringen Konzentrationen von Hg vorteilhaft, aber nicht unbedingt ideal ökologisch relevanten Sachverhalte zu beurteilen. Während frühere Kadmium Biosensoren in erster Linie als ein "Proof of Principle" existieren, wurden sie in komplexen Medien entwickelt, denen nicht die Ermittler zu beurteilen, die Rolle der Artbildung auf Bioverfügbarkeit41,42, 43 , 44.

Der Biosensor ist ein unglaublich nützliches Werkzeug bei der Bestimmung der Mechanismen, die in denen Metall Arten bioverfügbar sind. Da der Wirtsorganismus nicht Hg-Methylator ist, kann es nur verwendet werden, ein Modell für wie Hg geben Sie können gramnegative Bakterien und keine endgültige Begründung für wie Hg-Methylators Hg erwerben zu entwickeln. Gibt es andere Methoden zur Bestimmung von Hg Bioverfügbarkeit, z. B. Methylierung, als ein Ergebnis der Aufnahme oder der Einsatz einer Massenbilanz Ansatz10,15,20,45,46. Abgesehen davon bietet die hier vorgestellte Methode den Vorteil der quasi Bioverfügbarkeit Echtzeitdaten in lebensfähige Zellen. Wir empfehlen nicht, dass diese Methode verwendet werden, um insgesamt Hg oder Cd Level in einer Umwelt-Matrix zu quantifizieren. Trotz der vorgeschlagenen Verwendung von Biosensoren Metallkonzentrationen im Umfeld36zu bestimmen gibt es viele mehr zur Verfügung stehen standard-Methoden wie z. B. ICP-MS, FAAS (für Cd-Analyse) oder Kaltdampf-Atom-Absorptions-Spektroskopie (für Hg -Analyse). Jedoch kann der Biosensor verwendet, um festzustellen, ob eine gegebene Umwelt Matrix das Potenzial hat, zu verbessern oder behindern Bioverfügbarkeit; Dies wird erreicht, indem Sie standard Ergänzungen durchführen.

Der pH-Wert des Mediums Exposition kann geändert werden überall innerhalb des Bereichs von 5 und 8,5, vorausgesetzt der MOPS freie Säure (Puffer) mit einer Alternative freie Säure eines Puffers mit der entsprechenden PKA-Wert ausgetauscht werden (siehe Liste der entsprechenden Puffer (Ferreira Et Al. (2015) 47) und mit KOH zu den entsprechenden pH-Wert eingestellt, wenn die Exposition Medien machen. Darüber hinaus die Methode beschränkt sich nicht auf Hg und Cd, aber für andere Metalle mit anderen Regulierungsbehörden Transkription ausgeweitet werden könnte.

Die Exposition-Assay kann geändert werden, um den Einfluss der anderen Elektronen-Akzeptoren wie O2 und Fumarat auf Hg oder Cd Bioverfügbarkeit zu erkunden. Geringfügige Änderungen an der Methode, O2 und Fumarat als Elektronen-Akzeptoren zu nutzen sind auf Anfrage erhältlich.

Zusammenfassend wir folgende Punkte hervorheben möchten: ich) es ist zwingend notwendig, dass die Konzentrationen von Cd oder Hg Bestände in Schritt 2 bekannt sind, wie diese verwendet werden, um der Biosensor zu kalibrieren. II) am Tag Exposition muss das Wachstum von Zellen bei einer OD600 von 0,6 (± 0,1) gestoppt werden und die Sorgfalt beim resuspending der Zellkulturen als der Biosensor zu dieser Zelle Dichte kalibriert ist. III) zu guter Letzt ist es wichtig, dass Exposition Medium akribisch auf die Exposition Tag erfolgt. Um den Erfolg des Protokolls zu gewährleisten, sollten mehrere Kulturen angebaut werden, gleichzeitig (um die Möglichkeit einer Wachstumsstörung zu umgehen) und das Wachstumsmedium sollte wöchentlich erneuert werden (um die Metastabilität der Medien und der möglichen Kontamination zu umgehen). Anzumerken ist, dass biologische Wiederholungen (mehrere Zellkulturen) Variabilität äußern, wenn es darum geht, die Produktion zu signalisieren. Obwohl die fluoreszierenden Antworten von Kultur zu Kultur unterschiedlich sein können, sollte die fluoreszierenden Trends in Beantwortung einer bestimmten Variablen in zahlreichen biologischen Wiederholungen unverändert.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir möchten Kommentare von zwei anonymen Gutachtern als auch Mitglieder der Poulain Labor für aufschlussreiche Diskussion über die Entwicklung der anaeroben Biosensor zu danken. Eine frühe Forscher Auszeichnung aus der Provinz Ontario und ein Discovery Grant und eine Ergänzung der Beschleuniger aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada A.J.P finanziert dieser Studie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 ml standard vial, rounded interior Delta Scientific 200-007-20 34 recommended
Vial tray, 21 mm openings Delta Scientific 730-2001 4 for (4 x 8 grid)
24 mm Closure Delta Scientific 600-024-01 32 recommended
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 Corning Corning 3931
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate Corning Corning 3651
Anaerobic Chamber (glovebox) The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %)
Palladium catalyst Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.
Microplate reader
450 (±10) nM filter for the microplate reader
500 (±10) nM filter for the microplate reader
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers
Spectrophotometer Modified for anaerobic culture tubes
MA-3000 (mercury analyzer)
pH probe Any pH probe will work
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe
Sterile/clean glass bottles For growth media and standards
Sterile/clean plastic or PTFE bottles For alkali solutions (NaOH/KOH)
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Sterile Milli-Q water Autoclaved or filter sterilized is fine.
Lysogeny Broth
Analytical grade H2SO4

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Eine anaerobe Biosensor-Test zum Nachweis von Quecksilber und Cadmium
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