Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Assay анаэробных биосенсора для обнаружения ртути и кадмия

Published: December 17, 2018 doi: 10.3791/58324
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Ottawa

Summary

Здесь мы представляем протокол для использования анаэробных микробных биосенсор поклеточного оценить как различные переменные среды влияет на биодоступность Hg и Cd для бактерий в анаэробных условиях.

Abstract

Ртуть (Hg) биодоступность микробов является ключевым шагом для токсичных Hg биоусиления в пищевых цепях. Кадмия (Cd) преобразования и биодоступность бактерии контролировать суммы, которые будут накапливаться в основных продовольственных культур. Биодоступность этих металлов зависит от их видообразования в растворе, но более особенно в анаэробных условиях где Hg метилированию для токсичных monomethylmercury (MeHg) и Cd сохраняется в ризосфере. Поклеточного микробной биодатчики количественно сигналом, когда металл входит в цитозоле и поэтому являются полезными инструментами для оценки металла биодоступность. К сожалению до настоящего времени большинство biosensing усилия сдерживаются в аэробных условиях ввиду ограниченной способности существующих репортер белков функции в отсутствие кислорода. В этом исследовании мы представляем наши усилия разработать и оптимизировать поклеточного биосенсор пробирного способен функционировать анаэробно, который может обнаружить металлов в анаэробных условиях в близком к реальному времени и в течение часа. Мы описываем, как биосенсор может помочь оценить как химические переменные, имеющие отношение к экологической циркуляцией металлов влияет на их биодоступность. Следующий протокол включает методы для (1) Подготовьте Hg и Cd стандартов в анаэробных условиях, (2) подготовить биосенсор в отсутствие кислорода, (3) дизайн и выполнить эксперимент, чтобы определить, как серия переменная влияет на биодоступность Hg или Cd и (4) для количественной оценки и интерпретации данных биодатчик. Мы Показать линейной диапазоны биодатчики и приводятся примеры показаны метод способность различать между металла биодоступность и токсичности путем использования металла индуцибельной и учредительные штаммов.

Introduction

Ртуть (Hg) является глобальным загрязнителем и его биодоступность для Hg метилирующих микробы является первым шагом на пути к его биоусиления в пищевых цепях и его возможные нейротоксические эффекты в человека и дикой природы1. В настоящее время считается, что микробные метилирования Hg является внутриклеточным процесс, который требует: i видов РТ биодоступной2,3,4,5,6,7 и ii) для клетки способны физиологически метилирующих Hg8,9,10. Кадмий (Cd) биоаккумулируется в организмы, но не не биоусиления в foodwebs и широко используется в промышленных и коммерческих процессов, которые обычно вызывают острого облучения людей и окружающей среды11. Хотя микробы играют несколько ключевую роль в судьбе Hg в окружающей среде, большинство исследований на Cd геохимии и экотоксикологии сосредоточиться на микробные эукариот12. Потребление сельскохозяйственных культур (например, рис) является основным источником прямого воздействия кадмия; в этом случае, биодоступность Cd микробов ризосфере непосредственно влияет на объем растений могут накапливаться13.

Путей переноса Hg, являются сложными и возможно привлечь активного транспорта по шаг14. Когда перевозчик участвует, последние работы предложил, что HgII использует ZnII или MnII транспортер7,,1516,17. В то время как CdII предположил случайно транспортируется в цитозоль путями двухвалентной металла транспорта (особенно MnII или ZnII), механизмы CdII транспорт внутри клетки остаются спекулятивные и нет Cd специфические транспортные пути были определены13,18. Независимо от характера участвующих перевозчиков, три механистический факторы в конечном счете определяют способность металлов ввести ячейку: i металла видообразования в решение2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) biophysiochemical свойства клеточной мембраны17,24,25,26,27,28,29 ,30,31и iii) способность для металла для доступа к транспортного узла7,32. CD и Hg вряд ли существует как свободные ионы микробной физиологически соответствующих условиях из-за их высокое сродство для растворенного органического вещества (DOM), хелатирующие загрязнители (например, ЭДТА), или снижение серы постановление33, 34,35 (CdII может существовать как свободный Ион или формы Ион пар в отсутствие этих лигандами). Существует нехватка эффективных методов в определении, как эти виды металла являются биодоступными в условиях, имеющих отношение к их судьба в окружающей среде. Например Hg метилированию в анаэробных условиях14, и кадмия и Hg мягких металлов (или класса B катионы), требующих расследование их видообразования в условиях, обеспечивающих целостность уменьшение серы групп.

Микробные биодатчики являются бактериальные клетки, которые количественно сигнал в ответ на внутриклеточной концентрации металла, в данном случае Hg или компакт-диск. Как таковые они являются идеальными инструментами, чтобы понять, как металлов ввести ячейку36, при том условии, что условия воздействия тщательно контролируются. Hg биодатчики обычно содержат ген слияния между нормативной схемой mer-Оперон (включая гены, кодирующие для транскрипции регулятор MerRas также оператор и промоутер регионах Оперон) и отчетности генов (например, Люкс, gfp, лак генов). Когда ртуть присутствует в цитоплазме, он выполняет привязку к MerR, что приводит к транскрипции генов отчетности и последующих сигнал производства19,37. Конкретные Cd биодатчики обычно разработаны с использованием cadC, выходит, zntA или zntR в кодировке транскрипции регуляторы38, но стоит отметить, что MerR имеет меньше, но количественно сродство к Cd5. За счет аэробного ограничение наиболее часто используемые репортер люминесцентные и флуоресцентные белки, до тех пор, пока недавно микробной биодатчиков по-прежнему не в состоянии предложить взглянуть на биотрансформацию металлов в анаэробных условиях. Это затрудняет анаэробных обнаружения металлов биодоступность в диапазоне условий соответствующих экологических судьбы, специально в присутствии редокс чувствительных лигандами (например, сероводорода и тиолы)4, 5 , 39.

Чтобы облегчить методологических препятствие живут изображений в отсутствие кислорода, Drepper и др. (2007) разработали на основе Флавин флуоресцентный белок (FbFp), основанная на домене напряжения легких кислорода SB2 белка из P. putida. Этот белок семья способна флуоресцировать в отсутствие кислорода40. Опираясь на работу Drepper et al., нашей лаборатории разработан анаэробных биосенсор, позволяя для изучения Hg биодоступность при аэробных и анаэробных условиях и в широком диапазоне солености 17. В текущем документе мы опишем, как подготовить и использовать биосенсора для тестирования переменные среды влияние на биодоступность Hg или Cd. Хотя мы разработали биосенсора для HgII, мы решили проводить эксперименты с CdII как средство привлечь внимание читателя на тот факт, что биодатчики также могут реагировать на несколько раздражители, которые совместно встречаются в окружающей матрицы; в этом случае CdII было расследовано, потому что он известен для привязки к transcriptional регулятор MerR5. Здесь мы покажем, представитель калибровки и функциональных линейных диапазоны в отношении любой металл. Мы также дать пример, когда биосенсор результаты являются окончательными (мгII и MnII на биодоступность Hg) и безрезультатно (ZnII на биодоступность Hg).

Protocol

1. развитие средств массовой информации и подготовка экспозиции СМИ

  1. Чтобы сделать 250 мл среднего роста:
    Примечание: Если прослеживающие элементы #1 решение и прослеживающие элементы #2 решения уже готовы, переходите к шагу 1.1.5.
    1. Подготовить прослеживающие элементы #1 решение в чистый объемный колбу (200 мл) содержит окончательный molarities 1,5 x 10-3 М на2MoO4, 6.5 x 10-4 М на2SeO4, 5 x 10-3 M H3бо 3и 0,1 М NaOH.
      Предупреждение: Сильные основания (NaOH) коррозионные. Сделать уверены когда весом реагентов для обеспечения окончательного Молярность представляет ключевых микроэлементов; Mo, Se и б.
    2. В стерильных поля фильтр стерилизовать, используя фильтр шприц Полиэфирсульфон 0,22 мкм в бутылке чистые стерильные пластик/политетрафторэтилена (ПТФЭ).
    3. Готовят раствор прослеживающие элементы #2 в чистый объемный колбу (200 мл) содержит окончательный molarities 0,01 М MnSO4, 5 x 10-4 M ZnSO4, 3.25 x 10-3 M CoCl2, 6.25 x 10-3 M NiCl 2и так40,1 М H2.
      Предупреждение: Сильных кислот (H2т4) вызывают коррозию. Сделать уверены когда весом реагентов для обеспечения окончательного Молярность представляет ключевых микроэлементов; MN, Zn, Co и Ni.
    4. В стерильных поля фильтр стерилизовать, используя фильтр шприц Полиэфирсульфон 0,22 мкм в чистой стеклянной бутылке.
    5. В поле стерильным, в чистой стерильной стеклянной бутылке (минимум 250 мл); Добавьте 200 мл ультрачистая вода, 42,5 мл M9 минимальная соли (5 x; см. Таблицу материалы), 2,5 мл 2 M глюкозы, 125 мкл 2м MgSO4, 1200 мкл 0.6 М тиамин HCl из замороженных Алиготе (-20 ° c), 1,25 мл 4 M NaNO3 , 770 мкл 0,075 М L-лейцина / L-изолейцина / решение валина, 250 мкл прослеживающие элементы #1, 250 мкл элемента trace #2и 250 мкл 0,01 М ЭДТА натрия соль.
      Примечание: Все реагенты в шаге 1.1.5 должен быть подготовлен предварительного и фильтр, используя фильтр шприц Полиэфирсульфон 0,22 мкм. Ультрачистая вода может быть простерилизованы с помощью автоклава.
    6. Возьмите стеклянная бутылка, теперь содержит решение от шага 1.1.5., слабо крышка его и цикл через анаэробные камеры air lock.
    7. В анаэробные камерымкл 15 0,225 М FeSO4 в 0,2 М H2,4, крышка плотно бутылку и встряхнуть, пока не исчезнут все белые осадки.
      Примечание: Все реагенты в шаге 1.1.7 должен быть подготовлен предварительного и фильтр, используя фильтр шприц Полиэфирсульфон 0,22 мкм. Поэтому хранить 0,225 М FeSO4 в 0,2 М H24 в анаэробные камеры.
    8. Снимите колпачок из бутылки, подождите 1 минуту для воздуха для обмена, заменить крышку из бутылки и затем встряхнуть. Повторите этот шаг один раз.
    9. Плотно закрепите крышку на бутылку, удалить из анаэробные камерыи хранить бутылки в холодильник (4 ° c) до использования.
    10. Среднего роста должен быть переделана один раз в неделю, повторив шаги 1.1.5 для 1.1.9.
  2. Чтобы сделать 100 мл воздействия среды в 2 x 50 мл конические стерильные полипропиленовые пробирок:
    Примечание: Мы рекомендуем, что воздействия среды быть подготовлен в день анализа воздействия к минимуму риск загрязнения, однако он может быть сделан заранее и хранить в холодильнике.
    1. В анаэробные камеры, чтобы каждый 50 мл пластиковых пробирок добавить 42 мл анаэробных ультрачистая вода, 350 мкл 1 M натрия бета-Gylcerophosphate из замороженных (-20 ° c) Алиготе, 2 мл 1 м швабры так свободной кислоты, 50 мкл 1 М (NH4)24 , 125 мкл глюкозы 2 М, 300 мкл Кох 2,5 М и 200 мкл 2,5 М NaOH.
      Примечание: Все реагенты в шаг 1.2.1 должен быть подготовлен предварительного и фильтр, используя фильтр шприц Полиэфирсульфон 0,22 мкм. Ультрачистая вода может быть тепловой стерилизации с помощью автоклава. 2,5 NaOH М и 2,5 М NaOH должны храниться в бутылки пластиковые/PTFE. Все перечисленные реагенты должны храниться в анаэробные камеры за исключением натрия бета-Gylcerophosphate, который должен храниться в холодильнике (-20 ° c). В общем это хорошая практика, чтобы оставить все пластиковые или стеклянные детали и контейнеров на несколько дней в анаэробных камере для обеспечения сохранения следов кислорода.
    2. Крышка 50 мл пробирок, встряхнуть и удалить Алиготе 10 мл для измерения рН. Измеренное pH этой экспозиции СМИ всегда должны измерить 7.00 ± 0,02 в 25 градусов. Если pH не измерения в пределах этого диапазона, скорректировать объем добавлены 2,5 М Кох, чтобы исправить это.
      Примечание: Никогда не Титруйте решение исправить для pH с рН зонд. pH датчики представляют собой источник загрязнения для воздействия среды. PH всегда должны быть продуктом добавил реагентов в шаг 1.2.1.
  3. Подготовить 5-10 мм NaNO3 Стоковый раствор и оставить в анаэробные камеры для использования во время анализа воздействия.
    Примечание: Это проще для разбавления более концентрированной основной стандарт NaNO3 отличие от приготовления 5-10 мм основной стандарт NaNO3 .

2. Подготовка ртути и кадмия стандартов.

  1. Подготовка 4-8 мкм Mercuric (HgII) решения в 0,2 М H2т4.
    1. Подготовить стандарт2 + Hg, сделав millimolar (1-10 мм) HgCl2, HgNO3 или HgSO4 раствор 0,2 М H2т4.
      Предупреждение: Ртуть является высокотоксичным и2H,4 коррозионные. Работают в вытяжных с всеми необходимыми средствами индивидуальной защиты.
    2. В бутылке PTFE разбавляют стандарт от 2.1.1. в 0,2 М H2т4 до получения концентрации в диапазоне 4-8 мкм Hg2 +.
      Примечание: Кислота, используемая должно быть чда H2,4.
    3. Концентрация Hg из 2.1.2 должны быть проверены с помощью анализатор ртути (см. Таблицу материалы).
      Примечание: Могут использоваться другие методы для проверки концентрации Hg.
  2. Подготовка 10 мкм CdII решения в 10 мм H2т4.
    1. Подготовьте первичный эталон CdCl2 (10-50 мм диапазон для точного взвешивания порошка) в 0,1 М H2т4.
    2. В серии серийных разведений в чистой кислоты промыть 20 мл боросиликатного стекла флаконы с черным фенольные колпачки с PTFE сталкиваются резиновые вкладыши, разбавить стандарта от 2.2.1 до 10 мкм Cd2 +. Убедитесь, что концентрация H2,4 в каждый последующий серийный разбавления остается 10 мм.

3. Подготовка биосенсора для анаэробных экспозиции Assay

  1. Пластина индуцибельной биосенсор ртути (E. coli NEB5α укрывательство PUC57merR-PpFbFp) и конститутивно выраженной биосенсора (E. coli NEB5α укрывательство PUC19Balch-PpFbFp) от-80 ° c cryostock на плиты Lysogeny бульон, содержащий ампициллина 120 мкг/мл. Посмотреть наши ранее опубликованные работы сведения на производство этих биодатчики17.
  2. В 4:30-5 вечера, прививать культуру в 10 мл фунтов (+ усилитель) и расти на ночь.
    Примечание: Начиная с плиты, он принимает 2 дней , чтобы подготовить анаэробные культуры для анализа воздействия (т.е., культуры начался в понедельник днем (4:30-5 вечера) будет готова для анализа воздействия на около полудня в среду). Следующие шаги являются необходимые микробиологические методы, необходимые для подготовки культур в день анализа воздействия.
    1. Возьмите один колонии от плиты культуры и добавить в 10 мл Lysogeny бульон (LB) с 21 µL 100 мг/мл Стоковый раствор ампициллина натриевая соль (конечная концентрация составляет 210 ампер мкг/мл) в стерильных культуры трубки.
    2. Место культуры в инкубатор/шейкер и расти на ночь + 37 градусов с встряхивания на 220 об/мин.
  3. На следующее утро в 9-10 утра, Ресуспензируйте культуру и анаэробно расти в течение всего дня (20% посевным материалом).
    1. Принесите культуры из инкубатора (шаг 3.2.1) и среднего роста (шаг 1.1.9) в анаэробные камеры.
    2. Добавьте 8 мл свежего среднего роста и ампициллин (210 мкг/мл) в стерильную пробирку Бэлч.
    3. Сбор 2 мл ночи выращивать культуры и передачи в 2 мл пробки Microcentrifuge. Центрифуга на 10000 РПРС шаг за 90 секунд, дамп супернатант и Ресуспензируйте в 2 мл свежего среднего роста. Добавьте ресуспензированы культуры в Бэлч трубка, содержащая 8 мл свежего среднего роста и ампициллина.
    4. Тщательно используя стерильную методику, поместите резиновой пробкой на Бэлч трубки. Удалить из анаэробные камеры и место в инкубатор/шейкер и анаэробно расти до 3-5 вечера, в котором + 37 градусов встряхивании в 220 об/мин.
  4. Между 3 и 5 вечера выполнить 1% анаэробные посевным материалом в свежие среднего роста и расти на ночь.
    1. Принесите Бэлч трубки (шаг 3.3.4) в анаэробные камеры вместе с среднего роста. Добавьте 100 мкл культуры с amp (210 ампер мкг/мл) в стерильную пробирку Бэлч 10 мл свежего среднего роста (1% посевным материалом).
    2. Тщательно используя стерильную методику, поместите резиновой пробкой на Бэлч трубки. Удалить из анаэробные камеры, место в инкубатор/шейкер и расти на ночь + 37 градусов с встряхивания на 220 об/мин.
  5. Между 9 и 10 часами утра Ресуспензируйте культуры анаэробно расти в течение дня (20% посевным материалом).
    1. Принесите культуры из инкубатора (шаг 3.4.1) и среднего роста (шаг 1.1.9) в анаэробные камеры.
    2. Добавьте 8 мл среднего роста и ампициллин (210 ампер мкг/мл) в стерильную пробирку Бэлч.
    3. Сбор 2 m ночь выращивать культуры и передачи в 2 мл пробки Microcentrifuge. Центрифуга на 10000 g x 90 секунд, дамп супернатант и Ресуспензируйте в 2 мл свежего среднего роста. Добавьте ресуспензированы культуры в Бэлч трубка, содержащая 8 мл свежего среднего роста и ампициллина.
    4. Тщательно используя стерильную методику, поместите резиновой пробкой на Бэлч трубки. Удалите из камеры и место в инкубатор/шейкер и расти анаэробно + 37 градусов с встряхивания на 220 об/мин.
  6. Следить за ростом культуры, используя спектрофотометр (шаг 3.5.4) до 600 ОД 0,6 . Не забудьте вихревой культуры до каждого ОД чтения.
    Примечание: Этот шаг занимает 3-4 часа, и воздействия среды (шаг 1.2) должны подготавливаться в течение этого времени, а также анализа воздействия (шаг 4.1).
  7. Остановите рост, когда культура достигает 600 ОД 0,6 (± 0,1) (3-4 часа ожидали роста).
    1. Принесите трубки в анаэробные камеры (шаг 3,6) и передаче культуры в 2 x 2 мл Microcentrifuge трубы. Центрифуга на 10000 g x 90 секунд, дамп супернатант и Ресуспензируйте в 2 x 2 мл свежего воздействия среды.
    2. Повторите шаг Стиральная 3.7.1. один раз для удаления следов среднего роста.
  8. Объедините оба microcentrifuge трубы клеточной культуры (шаг 3.7) в 7 мл флаконе стандартных PTFE для получения Биосенсор запасов для использования в Assay экспозиции (шаг 4).
    Примечание: Не забудьте mix Биосенсор фондовой тщательно еще мягко закупорить и обратно до использования. Метод может быть приостановлен здесь до одного часа.

4. воздействие Assay

  1. Проектирование макета пластины.
    Примечание: Обязательно иметь все дозирования значения, вычисленные и запасах, подготовленные до начала воздействия пробирного. Как правильно оформить эксперимент и что контролирует включить подробно в тексте. Кроме того эксперимент не будет запущен, если есть кислород в анаэробных камере указал на анаэробную мониторе.
    1. Разработка макета пластины согласно 96 хорошо шаблон. Чтобы запустить эксперименты в технических реплицирует 3, это позволит 32 различных методов лечения, который лучше всего представлена в сетку 4 x 8 для настройки флаконов (см. Рисунок 1).

Figure 1
Рисунок 1: 96 хорошо пластины (слева) и соответствующее 4 x 8 сетку, содержащую PTFE ампул (справа) могут быть переданы пластину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Примечание: Когда тестирования для роли переменной на поглощение Hg с ртути индуцибельной биосенсор; два лечения требуются для каждой переменной: лечение (биосенсор + Hg + переменной нитрата) и его лечения пустой (биосенсор + переменной + нитрат). При тестировании на роль переменной на физиологии клетки с помощью составных биосенсор, две процедуры необходимы для каждой переменной: лечение (биосенсор + Hg + переменной нитрата) и пустой ( лечение Биосенсор + переменная + Hg). Ртуть может быть заменен кадмия. Hg или компакт-диск станет переменной при выполнении калибровочной кривой. Учредительные и индуцибельной биодатчики не нужно запускать в то же время (в один и тот же макет пластины). Пример шаблона для макета пластины и соответствующих сетка 4 x 8 при тестировании диапазон концентрации магния (переменная) приводится в таблице 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
a Hg индуцированной биосенсор + Hg + нитрат + 0 мм Mg Hg индуцированной биосенсор + нитрат + 0 мм Mg Учредительный биосенсор + Hg + нитрат + 0 мм Mg Учредительный биосенсор + Hg + 0 мм Mg
b Hg индуцированной биосенсор + Hg нитрат + 0,1 мм Mg Hg индуцированной биосенсор + нитрат + 0,1 мм Mg Учредительный биосенсор + Hg нитрат + 0,1 мм Mg Учредительный биосенсор + Hg + 0,1 мм Mg
c Hg индуцированной биосенсор + Hg + нитрат + 1 мм Mg Hg индуцированной биосенсор + нитрат + 1 мм Mg Учредительный биосенсор + Hg + нитрат + 1 мм Mg Учредительный биосенсор + Hg + 1 мм Mg
d Hg индуцированной биосенсор + Hg + нитрат + 10 мм Mg Hg индуцированной биосенсор + нитрат + 10 мм Mg Учредительный биосенсор + Hg + нитрат + 10 мм Mg Учредительный биосенсор + Hg + 10 мм Mg
e

Таблица 1: Пример пластины макет с помощью биосенсора для тестирования Hg биодоступность (5 Нм) над градиентом магния (0-10 мм)

  1. Настройте сетку 4 x 8 по данным Пробирной пластины макет.
    1. Место 7 мл PTFE стандартных флаконов в трее.
      Примечание: PTFE флаконы должны быть кислоты промывают/тепловой стерилизации перед использованием. Пузырьки должны обрабатываться только манипулирования вне флакона.
    2. Для каждого флакона добавьте экспозиции среднего том, соответствующий каждой лечения.
      Примечание: В экспозиции с общим объемом 2000 мкл (2 мл), будет добавлена среднего воздействия : среднего воздействия мкл = 2000 мкл – лечение (пустой) мкл. (например, воздействие средних мкл = 2000 – 100 мкл (биосенсор) – 40 мкл (нитрат) – 100 мкл (Hg ) – 100 мкл (переменная (например, MgSO4)) = 1660 мкл). Будьте уверены, что объем, добавил протестированных переменной не превышает 5% (100 мкл) заключительного тома.
    3. Для каждого флакона добавьте соответствующий объем раствора химического переменной испытываться согласно структуре плиты.
    4. От шага 1.3 Добавьте нитрата в каждый флакон, чтобы конечная концентрация составляет 200 мкм (40-80 мкл). Исключите этот шаг для учредительного биосенсор обработки заготовок.
    5. С шагом 2.1 или 2.2, добавить Hg (5 Нм при тестировании для переменной) или компакт-диск (300 Нм при тестировании для переменной) для флаконов по структуре плиты. Исключите этот шаг для ртути индуцибельной биосенсор обработки заготовок.
      1. При использовании Hg, подвести 4-8 мкм и хорошо взболтать. Разбавьте раствор в экспозиции среднего в 7 мл во флаконе PTFE до 100-250 Нм сделать рабочий раствор Hg. От этого рабочего раствора добавьте Hg в требуемых флаконов. В этом случае Кривая калибровки Hg, от 0 до 12,5 Нм.
        Примечание: При тестировании переменная влияет на биодоступность Hg или компакт-диск, убедитесь, что [Hg] или [Cd] остается постоянной во всех процедур. При добавлении Hg или Cd, не забудьте использовать один наконечник пипетки, но никогда не прикасайтесь среднего воздействия во флаконах.
  2. Встряхните в орбитальное движение вручную.
    Примечание: Эксперимент может быть приостановлена в настоящее время в зависимости от времени, необходимого для Hg и Cd для speciate в растворе. Если более чем на час, место PTFE шапки на PTFE флаконы для предотвращения испарения/загрязнения.
  3. Аккуратно Пипетка Биосенсор фондовой взад и вперед для обеспечения однородности. Добавьте 100 мкл Биосенсор акций каждого флакона. Встряхните орбитально вручную.
  4. Подготовка читателя пластины для разогрева для чтения со следующими критериями: температура на 37˚с, кинетическая запустить на 10 часов с читает каждые 2,5-5 минут с орбитальной пожимая между читает и измерения флуоресценции с возбуждения флуоресценции 440 Нм и излучение 500 Нм.
  5. Пипетка 200 мкл от каждого PTFE флаконов в сетке 4 x 8 в соответствующий скважины 96 хорошо пластины (черный, 96-а Clear-дно Nonbinding поверхности планшет). Пипетка взад и вперед на 5 раз перед передачей каждой 200 мкл.
    Примечание: Вместо отбрасывания наконечник пипетки, оставьте наконечник пипетки во флаконе PTFE для дозирования прогресса.
  6. Место пластину 96 хорошо в лоток плиты читателя, а затем установите крышку на 96 хорошо пластины и начать assay.

5. Количественная оценка данных

  1. Флуоресценции каждого обращения в каждый момент времени должны быть исправлены для каждого индивидуального хорошо шум и отображаются в лечение пустым.
    1. Флуоресценции для каждой точки времени (t) (T) каждого лечения должны быть переведены на счет для первоначального флюоресценция (t0) в первый раз что суть каждой скважины, то в среднем через 3 процедуры реплицирует (1r - r3 ). Этот средний лечения должны затем отображаются на средний лечения пустой (ТБ) переведен в том же порядке (уравнение 1).

Флуоресценции (t) = средний(Tr1(т) - Tr1(т0), Tr2(т) – Тr2 (т0), Tr3(-t) - Tr3(т0)) – Средняя(ТБ R1 (т) - ТБr1(т0), ТБr2(-t)– ТБr2( ) t0 ), ТБr3(т) - ТБr3(т0)) (1)

Примечание: Это следует сделать как функции электронной таблицы. Надлежащего распространения ошибки также должна рассчитываться для каждой точки времени.

  1. Граф исправленные флуоресценции каждой лечения как функция времени

Figure 2
Рисунок 2: исправлены флуоресценции данных как функция времени. Флуоресценции измеряется как относительный флуоресценции единиц (РФС) испускаемых E. coli NEB5α укрывательство pUC57merR-Pp (индуцибельной штамм) со временем с добавлением HgII (0-12,5 Нм) в анаэробных условиях. Флуоресценции был в среднем 3 технических реплицирует в 37 градусов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Примечание: Значение не существует 0 Нм Hg на графике, и все другие концентрации Hg отображаются 0 Нм Hg для лечения пустой. Таким образом 0 Нм Hg представляет ось x и любых положительных флуоресценции представляет флуоресценции от Hg, учитывая любой переменной. Это необязательно не пустой флуоресценции таким образом, но флуоресцентные кривых даст заблуждение флуоресценции кривых, если переменная тестирование имеет фон флуоресценции (то есть, растворенного органического вещества сам будет флюоресцируют и если есть нет Обработка пустых, содержащие только клетки и растворенного органического вещества, повышение концентрации растворенного органического вещества увеличит флуоресцентного сигнала).

  1. Количественно пика флуоресценции. Количественной оценке флуоресцентным пик будет обычно происходят после 2,5-4 ч, представляющие энергии расходуется от потребления всех 200 мкм нитрата в качестве терминала электрон акцептора. Этот пик должны быть количественно и представляет заключительном флуоресцирования значение этого специального лечения.
    Примечание: В случае не флуоресценции пиковое (то есть, не Hg биодоступность), флуоресценции лечения в момент времени пика флуоресценции элемента управления (т.е. не добавлена переменная или 5 Нм Hg) должны быть количественно. В качестве альтернативы если есть индукции флуоресценции в лечении, но флуоресценции не производят четко пик, существует вероятность загрязнения выше акцептора электронов сходства например O2 , и следует принять меры для удаления следов кислород из всех решений и эксперимент должен выполняться снова.

Representative Results

После пика флуоресценции были количественно согласно шагу 5.3, результат вершины флуоресцирования можно графике согласно переменной концентрации, иллюстрирующие, как эта переменная влияет относительная биодоступность Hg или компакт-диск. К примеру Калибровочная кривая флуоресценции над [HgII] из рисунка 2 даст индуцибельной данные, представленные на рисунке 3A. Для HgII калибровки, кривая будет всегда содержат 3 компоненты для Hg индуцибельной деформации; порог ответ около 1-2 Нм HgII до производства флуоресценции сигнал пропорционален линейно [HgII], линейный Диапазон где 5 Нм HgII надежно всегда будет в центре этого диапазона и плато где увеличение [HgII] больше не ведет к увеличению флуоресценции сигнала. Никаких изменений в производстве сигнала на учредительном штамм показывает, что токсичность от [HgII] не влияет на сигнал производства. Для CdII в рисунке 3Bвсегда есть 2 компоненты для индуцибельной деформации; Линейный диапазон, где 200-300 Нм CdII надежно всегда будет в центре диапазона линейной и плато. Снижение флуоресценции сигнал с увеличением [CdII] показывает, что более высокие концентрации Cd токсичны для клеток и может объяснить снижением производства индуцибельной флуоресценции после плато на 1000 Нм CdII. Таким образом, при тестировании Hg или Cd биодоступность в отношении экологических переменных, мы предлагаем использовать 5 Нм для HgII и 300 Нм для CdII.

В некоторых случаях сигнал производства может надлежащим образом приписывается Hg или Cd биодоступность, но в других случаях сигнал производства могут быть затронуты изменением физиологического состояния биосенсор принимающей ячейки (например, металл интерес или экологические условия испытания являются токсичными). В рисунке 4A, 5 Нм Hg биодоступность был протестирован на градиент Zn (0-10 мкм). В Hg индуцибельной и учредительные штаммов есть аналогичные снижение сигнала с увеличением концентрации Zn. Таким образом один не дискриминирует ли результаты от пониженной биодоступность сигнал или является результатом Zn токсичности. В Рисунок 4B и 4 C, 5 Нм Hg биодоступность был протестирован на градиент мгII (0-10 мм) и MnII (0-10 мкм). Увеличение мгII и MnII концентрации снизилась флуоресценции сигнал индуцибельной штамма. С другой стороны, учредительный штамм не показывают снижение флуоресценции с увеличением мгII и MnII концентрации (мгII и MnII полезны для ячеек в производстве FbFp, как показано на увеличение сигнала флуоресценции). Это показывает, что клетки являются жизнеспособными и сокращение флуоресценции Hg индуцибельной штамма обусловлено снижением Hg биодоступность. Эти данные подчеркивает, насколько важно для всех анализов биосенсор также предоставить учредительные измерения общей пригодности клеток.

Figure 3
Рисунок 3: линейный Диапазон биосенсора с ртутью и кадмием. Максимальная флуоресценции измеряется как относительный флуоресценции единиц (РФС) ± 1 стандартное отклонение, испускаемых E. coli NEB5α укрывательство pUC57merR-Pp (Hg-индуцибельной) и pUC19Balch-Pp (учредительные) с добавлением A) HgII (0-15 Нм) и B) CdII (0-1000 Нм) в анаэробных условиях. Флуоресценции был в среднем 3 технических реплицирует в 37 градусов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: пример неубедительными результат с цинком и окончательного результата с магния и марганца. Максимальная флуоресценции измеряется как относительный флуоресценции единиц (РФС) ± 1 стандартное отклонение, испускаемых E. coli NEB5α укрывательство pUC57merR-Pp (Hg-индуцибельной) и pUC19Balch-Pp (учредительные) с добавлением A) ZnII (0-10 мкм), B) мгII (0-10 мм), и C) MnII (0-10 мкм) в анаэробных условиях. [HgII] было присвоено 5 Нм для всех процедур и флуоресценции был в среднем 3 технических реплицирует на 37 градусов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Микробные биодатчики являются полезными инструментами для выявления механизмов, которыми металлы взаимодействуют с микробами. Здесь мы описываем метод, который может анаэробно количественно HgII и CdII биодоступность грамотрицательные клетки (E. coli) и дают поддающихся количественной оценке результатов в течение нескольких часов. Одна из основных сильных сторон этого протокола является, что она позволяет обширный контроль металла видообразования в средстве воздействия, избегая прочное связывание лигандов или компонентов, которые могут привести к металлической осадков. Металлический видообразования образцу и тестирование в этой среде воздействия, с помощью PHREEQC17, однако другие металлические видообразования программного обеспечения могут быть развернуты. В случае не добавлен лигандов, Hg, видообразования, как ожидается, будет присутствовать как 97% Hg(OH)2 и 3% Hg (NH3)22 +, хотя видообразования Cd будет представлять как 59% Cd-β-метронидазол, 25% Cd2 +и 16% CdSO4. С помощью простой термодинамического моделирования программного обеспечения, пользователь может дизайн экспозиции СМИ и тест на биодоступность металла интерес. Кроме того, клетки-хозяина биосенсора (E. coli NEB5α) является жизнеспособным в широком диапазоне рН (5-8,5) и концентрации NaCl (0-0,55 М)17.

Hg метилирования — анаэробный процесс, и протокола, изложенные в настоящем исследовании не имеют требование для кислорода, что позволяет более точное описание анаэробного метаболизма на металлических биодоступность. Это важно, потому что наличие кислорода изменяет ген выражение профили48,49 , и следовательно, потенциал транспортных путей; Поэтому этот метод предоставляет преимущество над настоящее время чертежей аэробных альтернатив. Biosensing конструкции, представленные здесь, потенциально могут быть использованы с другими анаэробных узлами, которые могут быть более актуальными для метилирования ртути (например, Geobacter, Desulfovibrio), но может быть меньше шансов справиться с возникающими чем E. coli. Текущее ограничение представленный здесь подход состоит, что наш предел обнаружения еще не достигли уровней ТЧ, вопреки существующим аэробные системы4,19,-37. Это, однако, важно отметить, что для достижения этих низкие пределы обнаружения несколько шагов необходимо принять44: я) лигандом дополнение необходима для обеспечения что Hg остается в растворе и не адсорбируются микробной клеточной стенки (Hg будет необратимым граница в ячейку поверхности тиолов, предотвращая его биодоступность25,27; Просмотреть ответ порог для Hg на рисунке 3A), ii) модификации плотность клеток, или iii) изменить генетическую конструкцию включить транспортные белки mer-Оперон (а именно, МЭРТ и merP), увеличение потока Hg внутри ячейки50,51. Эти изменения будет полезным в обнаружении низких концентрациях Hg, но не обязательно является идеальным при оценке экологически соответствующих ситуаций. В то время как предыдущие кадмия биодатчики прежде всего существуют как «доказательство принципа», они были разработаны в сложных средах, которые не позволяют следователю для оценки роли видообразование на биодоступность41,42, 43 , 44.

Биодатчик является невероятно полезным инструментом в определении механизмов, в которых металл видов являются биодоступными. Потому что организм хозяина не Hg-methylator, он может использоваться только для разработки модели как Hg могут ввести грамотрицательных бактерий и не окончательное обоснование как Hg-methylators приобрести Hg. Существуют другие методы для определения Hg биодоступность, например метилирования дна, как результат поглощения или использование45,20,10,15,46с баланса массы подход. Это, как говорится, представленные здесь метод предлагает преимущество данных биодоступность квази реального времени в жизнеспособных клеток. Не рекомендуется использовать этот метод для количественного определения всего Hg или Cd уровней в экологических матрица. Несмотря на предлагаемое применение биодатчиков для определения концентрации металлов в окружающей среде36многие более легко доступны стандартные методы доступны такие как ICP-MS, ФААС (для анализа Cd) или атомной абсорбционной спектроскопии холодного пара (для Hg анализ). Биосенсор, однако, может быть использован для определения, если дана экологических матрица имеет потенциал для повышения или препятствовать биодоступность; Это достигается путем выполнения стандартных дополнений.

PH воздействия средств массовой информации могут быть изменены в любом месте в диапазоне 5 и 8.5, условии MOPS свободной кислоты (буфер) осуществляется обмен с альтернативной свободной кислоты буфера с соответствующим pKa (см. список соответствующих буферов (Феррейра и др. (2015) 47) и скорректирована с Кох соответствующие pH при принятии воздействия средств массовой информации. Кроме того метод не ограничивается Hg и Cd, но может быть распространено на другие металлы, используя другие регуляторы транскрипции.

Анализа воздействия могут быть изменены для изучения влияния других акцепторами электронов как O2 и фумарата на биодоступность Hg или Cd. Незначительные изменения в метод использовать O2 и фумарата качестве акцепторов электронов предоставляются по запросу.

В заключение мы хотели бы подчеркнуть следующие моменты: я) важно, что концентрации Cd и Hg запасов известны на шаге 2, как они будут использоваться для калибровки биодатчик. II) на экспозиции день, рост клеток, должны быть прекращены на од600 0,6 (± 0,1) и что осторожность при resuspending клеточных культур, как биосенсор откалиброван для этого плотность клеток. III) и наконец, важно, что средство воздействия производится тщательно в экспозиции день. Для обеспечения успеха протокола, несколько культур следует выращивать одновременно (чтобы обойти возможность роста неудачи) и среднего роста должны быть переделана еженедельно (обойти metastability СМИ и возможного загрязнения). Следует также отметить, что биологические реплицирует (несколько клеточных культур) Экспресс изменчивости, когда дело доходит до сигнала производства. Хотя флуоресцентные ответы могут варьироваться от культуры к культуре, флуоресцентный тенденции в ответ на данную переменную должен оставаться одинаковым на всей многочисленные биологические реплицирует.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить комментарии рецензентов два анонимных как хорошо членов Пулен лаборатории для глубокие обсуждения на развитие анаэробных биодатчик. Раннего исследователь награду от провинции Онтарио и обнаружения Грант и ускоритель дополнение от естественных наук и инженерных исследований Совет Канады к A.J.P. Финансирование этого исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 ml standard vial, rounded interior Delta Scientific 200-007-20 34 recommended
Vial tray, 21 mm openings Delta Scientific 730-2001 4 for (4 x 8 grid)
24 mm Closure Delta Scientific 600-024-01 32 recommended
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 Corning Corning 3931
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate Corning Corning 3651
Anaerobic Chamber (glovebox) The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %)
Palladium catalyst Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.
Microplate reader
450 (±10) nM filter for the microplate reader
500 (±10) nM filter for the microplate reader
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers
Spectrophotometer Modified for anaerobic culture tubes
MA-3000 (mercury analyzer)
pH probe Any pH probe will work
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe
Sterile/clean glass bottles For growth media and standards
Sterile/clean plastic or PTFE bottles For alkali solutions (NaOH/KOH)
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Sterile Milli-Q water Autoclaved or filter sterilized is fine.
Lysogeny Broth
Analytical grade H2SO4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Futsaeter, G., Wilson, S. The UNEP Global Mercury Assessment: Sources, Emissions and Transport. E3S Web of Conferences. 1, 36001 (2013).
  2. Barkay, T., Gillman, M., Turner, R. R. Effects of dissolved organic carbon and salinity on bioavailability of mercury. Applied and Environmental Microbiology. 63 (11), 4267-4271 (1997).
  3. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  4. Golding, G. R., et al. Evidence for facilitated uptake of Hg(II) by Vibrio anguillarum and Escherichia coli under anaerobic and aerobic conditions. Limnology and Oceanography. 47 (4), 967-975 (2002).
  5. Golding, G. R., Sparling, R., Kelly, C. A. Effect of pH on intracellular accumulation of trace concentrations of Hg(II) in Escherichia coli under anaerobic conditions, as measured using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 74 (3), 667-675 (2008).
  6. Chiasson-Gould, S. A., Blais, J. M., Poulain, A. J. Dissolved Organic Matter Kinetically Controls Mercury Bioavailability to Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (6), 3153-3161 (2014).
  7. Schaefer, J. K., Szczuka, A., Morel, F. M. M. Effect of Divalent Metals on Hg(II) Uptake and Methylation by Bacteria. Environmental Science & Technology. 48 (5), 3007-3013 (2014).
  8. Compeau, G., Bartha, R. Sulfate-reducing bacteria: principal methylators of mercury in anoxic estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 50 (2), 498-502 (1985).
  9. Compeau, G. C., Bartha, R. Effect of salinity on mercury-methylating activity of sulfate-reducing bacteria in estuarine sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (2), 261-265 (1987).
  10. Gilmour, C. C., Henry, E. A., Mitchell, R. Sulfate stimulation of mercury methylation in freshwater sediments. Environmental Science & Technology. 26 (11), 2281-2287 (1992).
  11. Rani, A., Kumar, A., Lal, A., Pant, M. Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity: a review. International Journal of Environmental Health Research. 24 (4), 378-399 (2014).
  12. Liu, F., Fortin, C., Campbell, P. G. C. Can freshwater phytoplankton access cadmium bound to low-molecular-weight thiols? Limnology and Oceanography. 62 (6), 2604-2615 (2017).
  13. Shahid, M., Dumat, C., Khalid, S., Niazi, N. K., Antunes, P. M. C. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. de Voogt, P. 241, Springer International Publishing. 73-137 (2017).
  14. Hsu-Kim, H., Kucharzyk, K. H., Zhang, T., Deshusses, M. A. Mechanisms regulating mercury bioavailability for methylating microorganisms in the aquatic environment: a critical review. Environmental Science and Technology. 47 (6), 2441-2456 (2013).
  15. Szczuka, A., Morel, F. M. M., Schaefer, J. K. Effect of Thiols, Zinc, and Redox Conditions on Hg Uptake in Shewanella oneidensis. Environmental Science and Technology. 49 (12), 7432-7438 (2015).
  16. Schaefer, J. K., et al. Active transport, substrate specificity, and methylation of Hg(II) in anaerobic bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8714-8719 (2011).
  17. Stenzler, B. R., Hinz, A., Ruuskanen, M. O., Poulain, A. J. Ionic strength differentially affects the bioavailability of neutral and negatively charged inorganic Hg complexes. Environmental Science and Technology. , (2017).
  18. Sigel, A. Cadmium: From Toxicity to Essentiality. , Dordrecht : Springer Netherlands : Imprint: Springer (2013).
  19. Barkay, T., Turner, R. R., Rasmussen, L. D., Kelly, C. A., Rudd, J. W. Luminescence facilitated detection of bioavailable mercury in natural waters. Methods in Molecular Biology. 102, Clifton, N.J. 231-246 (1998).
  20. Zhang, T., et al. Methylation of mercury by bacteria exposed to dissolved, nanoparticulate, and microparticulate mercuric sulfides. Environmental Science and Technology. 46 (13), 6950-6958 (2012).
  21. Ndu, U., Mason, R. P., Zhang, H., Lin, S., Visscher, P. T. Effect of inorganic and organic ligands on the bioavailability of methylmercury as determined by using a mer-lux bioreporter. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7276-7282 (2012).
  22. Moreau, J. W., et al. The Effect of Natural Organic Matter on Mercury Methylation by Desulfobulbus propionicus 1pr3. Frontiers in Microbiology. 6 (1389), (2015).
  23. Schaefer, J. K., Morel, F. M. M. High methylation rates of mercury bound to cysteine by Geobacter sulfurreducens. Nature Geoscience. 2 (2), 123-126 (2009).
  24. Dunham-Cheatham, S., Farrell, B., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of chloride on the adsorption of Hg onto three bacterial species. Chemical Geology. 373, 106-114 (2014).
  25. Dunham-Cheatham, S., Mishra, B., Myneni, S., Fein, J. B. The effect of natural organic matter on the adsorption of mercury to bacterial cells. Geochimica et Cosmochimica Acta. 150, 1-10 (2015).
  26. Mishra, B., Shoenfelt, E., Yu, Q., et al. Stoichiometry of mercury-thiol complexes on bacterial cell envelopes. Chemical Geology. 464, 137-146 (2017).
  27. Sara Anne, T., Qing, M., Jean-François, G. Probing changes in Hg(II) coordination during its bacterial uptake. Journal of Physics: Conference. 712 (1), 012078 (2016).
  28. Macek, T. Microbial Biosorption of Metals. , Springer. Netherlands. (2011).
  29. Ledin, M., Pedersen, K., Allard, B. Effects of pH and Ionic Strength on the Adsorption of Cs, Sr, Eu, Zn, Cd and Hg by Pseudomonas Putida. Water, Air, and Soil Pollution. 93 (1-4), 367-381 (1997).
  30. Daughney, C. J., Fein, J. B. The effect of ionic strength on the adsorption of H+, Cd2+, Pb2+ and Cu2+ by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis: A surface complexation model. Journal of Colloid and Interface Science. 198 (1), 53-77 (1998).
  31. Borrok, D. M., Fein, J. B. The impact of ionic strength on the adsorption of protons, Pb, Cd, and Sr onto the surfaces of Gram negative bacteria: testing non-electrostatic, diffuse, and triple-layer models. Journal of Colloid and Interface Science. 286 (1), 110-126 (2005).
  32. Daguené, V., et al. Divalent Base Cations Hamper HgII Uptake. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6645-6653 (2012).
  33. Turner, D. R. Speciation and cycling of arsenic, cadmium, lead and mercury in natural waters. Lead, Mercury, Cadmium and Arsenic in the Environment. , 175-186 (1987).
  34. Liu, G., Cai, Y., O'Driscoll, N. Environmental Chemistry and Toxicology of Mercury. , John Wiley & Sons. (2011).
  35. North, A. E., Sarpong-Kumankomah, S., Bellavie, A. R., White, W. M., Gailer, J. Environmentally relevant concentrations of aminopolycarboxylate chelating agents mobilize Cd from humic acid. Journal of Environmental Sciences. 57, 249-257 (2017).
  36. Van Der Meer, J. R., Belkin, S. Where microbiology meets microengineering: design and applications of reporter bacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (7), 511-522 (2010).
  37. Rasmussen, L. D., Turner, R. R., Barkay, T. Cell-density-dependent sensitivity of a mer-lux bioassay. Applied and Environmental Microbiology. 63 (8), 3291-3293 (1997).
  38. Magrisso, S., Erel, Y., Belkin, S. Microbial reporters of metal bioavailability. Microbial Biotechnology. 1 (4), 320-330 (2008).
  39. Golding, G. R., Kelly, C. A., Sparling, R., Loewen, P. C., Barkay, T. Evaluation of mercury toxicity as a predictor of mercury bioavailability. Environmental Science and Technology. 41 (16), 5685-5692 (2007).
  40. Drepper, T., et al. Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen. Nature biotechnology. 25 (4), 443-445 (2007).
  41. Kumar, S., Verma, N., Singh, A. K. Development of cadmium specific recombinant biosensor and its application in milk samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 240, 248-254 (2017).
  42. Yoon, Y., et al. Simultaneous detection of bioavailable arsenic and cadmium in contaminated soils using dual-sensing bioreporters. Applied and Environmental Microbiology. 100 (8), 3713-3722 (2016).
  43. Kang, Y., Lee, W., Jang, G., Kim, B. G., Yoon, Y. Modulating the sensing properties of Escherichia coli-based bioreporters for cadmium and mercury. Applied and Environmental Microbiology. 102 (11), 4863-4872 (2018).
  44. Hynninen, A., Tõnismann, K., Virta, M. Improving the sensitivity of bacterial bioreporters for heavy metals. Bioengineered Bugs. 1 (2), 132-138 (2010).
  45. Graham, A. M., Bullock, A. L., Maizel, A. C., Elias, D. A., Gilmour, C. C. Detailed assessment of the kinetics of Hg-cell association, Hg methylation, and methylmercury degradation in several Desulfovibrio species. Applied and Environmental Microbiology. 78 (20), 7337-7346 (2012).
  46. Graham, A. M., Aiken, G. R., Gilmour, C. C. Dissolved Organic Matter Enhances Microbial Mercury Methylation Under Sulfidic Conditions. Environmental Science & Technology. 46 (5), 2715-2723 (2012).
  47. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions-a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  48. Salmon, K., Hung, S. P., Mekjian, K., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global gene expression profiling in Escherichia coli K12: the effects of oxygen availability and FNR. Journal of Biological Chemistry. 278 (32), 29837-29855 (2003).
  49. Salmon, K. A., Hung, S. P., Steffen, N. R., Krupp, R., Baldi, P., Hatfield, G. W., Gunsalus, R. P. Global Gene Expression Profiling in Escherichia coli K12 effects of oxygen availability and ArcA. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 15084-15096 (2005).
  50. Larose, C., Dommergue, A., Marusczak, N., Coves, J., Ferrari, C. P., Schneider, D. Bioavailable mercury cycling in polar snowpacks. Environmental Science & Technology. 45 (6), 2150-2156 (2011).
  51. Omura, T., Kiyono, M., Pan-Hou, H. Development of a specific and sensitive bacteria sensor for detection of mercury at picomolar levels in environment. Journal of Health Science. 50 (4), 379-383 (2004).

Tags

Науки об окружающей среде выпуск 142 биосенсор ртуть кадмий анаэробный биодоступность металлические видообразование
Assay анаэробных биосенсора для обнаружения ртути и кадмия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stenzler, B. R., Gaudet, J.,… More

Stenzler, B. R., Gaudet, J., Poulain, A. J. An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium. J. Vis. Exp. (142), e58324, doi:10.3791/58324 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter