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방법 논문

F1의 절연-ATPase 기생 원생 생물 Trypanosoma brucei 에서

7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58334

⸱

2019년 1월 22일

 , 
1Biology Centre, Czech Academy of Science, Institute of Parasitology, 2Faculty of Science, University of South Bohemia

이 논문에서

요약

이 프로토콜 설명 F1의 정화- Trypanosoma brucei의 교양된 곤충 단계에서 ATPase. 프로시저 생성 매우 순수한, 균질, 고 활성 복잡 한 구조상과 효소 연구에 적합 합니다.

초록

F1-ATPase는 F 형 ATP synthase, 생물 막에 걸쳐 양성자 동기 힘을 사용 하 여 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 생산 하는 효소의 막 외부 촉매 subcomplex. 그대로 F1의 절연-ATPase는 네이티브 소스에서 효소의 단백질 구성, 운동, 변수와 감도 억제제를 특성화 하는 필수적인 전제 조건입니다. 매우 순수 하 고 균질 F1-ATPase는 ATP 합성과 가수분해의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하는 구조 연구에 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 설명 합니다 F1의 정화에 대 한 절차- Trypanosoma brucei, 아프리카 trypanosomiases의 원인이 되는 대리인에서에서 ATPase. F1-ATPase는 침투성 세포에 생체 외에서 배양 trypanosomes에서 여는 미토 콘 드 리아 vesicles에서 격리 됩니다. 소포는 기계적으로 쥡니다와 F1에 의해 조각-ATPase는 클로 프롬 적 출에 의해 내부 미토 콘 드 리아 멤브레인에서 발표. 효소 복합물은 추가 연속 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정화 된다. 중요 한 질량 분석 기술을 보여주었다는 순화 된 복잡 한 거의 모든 단백질 오염 물질 없는 이며, 따라서, 엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법에 의해 구조 결심을 위한 적당 한 물자를 나타냅니다. 격리 된 F1-ATPase 전시 ATP 가수분해 활동, 나트륨 아 지 드, F 형 ATP synthases의 강력한 억제제에 의해 완전히 저해 될 수 있습니다. 순화 된 복잡 한 실내 온도에 적어도 3 일에 대 한 안정적이 고 활성 남아 있습니다. 황산 암모늄에 의해 강 수는 장기 저장을 위해 사용 됩니다. 유사한 절차는 F1의 정화 사용 되었습니다-ATPases 포유류 및 식물 조직, 효 모, 또는 박테리아. 따라서, 제시 프로토콜 F1에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다-다른 유기 체에서 ATPase 격리.

서론

F 타입 ATP synthases는 막 도약 ATP 형성 박테리아와 미토 콘 드리 아, 엽록체의 에너지 시험 막 걸쳐 multiprotein 단지 그 몇 양성자 전 좌를 회전. ATP 합성의 회전 메커니즘의 분자 세부 정화 박테리아와 미토 콘 드리 아 ATP synthases 및 그들의 subcomplexes1의 구조 연구 때문에 주로 알려져 있습니다. F 형 ATP synthase 막 내장 고 막 외부 moieties로 구성 됩니다. F1막 외부 부분-ATPase, 포함 ATP 또는 역방향 반응은 아데노신 diphosphate (ADP)의 인 산화 발생 3 촉매 사이트. F1-ATPase 공개 될 수 있는 실험적으로 막 내장 moiety에서은, 하지만 하지, ATP를 합성 하는 기능을 유지 하면서. Fo, 라고 막 도약 분야 중재 단백질 전 좌, 효소의 중앙 부분의 회전 드라이브. F1 과 Fo 분야 중앙과 주변 줄기로 연결 된다.

첫 번째는 F1을 정화 하려고-1960 년대에 다시 싹 트는 효 모 및 소 심장 미토 콘 드리 아에서 ATPase. 이러한 프로토콜 사용 추출 쥡니다, 암모늄 또는 protamine 황산 염 강 수, 옵션 크로마토그래피 단계 및 열 처리2,3,4로 분류 한에 의해 중단 되었다 미토 콘 드리 아 ,,56. 정화는 크게 개선 하 고 클로 프롬, F1를 쉽게 해제 사용 하 여 단순화-미토 콘 드 리아 멤브레인에서 ATPase 조각7. 클로 프롬 추출 했다 다음 F1을 추출 하는 데 사용 됩니다-ATPases 다양 한 동물, 식물 및 세균성 원본 (예를 들어, 쥐 간8, 옥수수9, 식물 maculatum10및 병원 성 대장균 11). 더 클로 프롬 발표 F1의 정화-ATPase 선호도 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 굴복 했다 엑스레이 결정학에 의해 고해상도 구조 결정을 위해 적당 한, 매우 순수한 단백질 복잡 한로 F1의 구조에 의해 문서화-소 심장12,13 를 Saccharomyces cerevisiae14ATPase. F1-ATPase 구조 또한 육성 하기 어려운 유기 체에서 결정 하 고, 따라서, 초기 생물 학적 물질의 양을 제한 했다. 이 경우에는 F1에서-ATPase subunits 인위적으로 표현 되었고, 대장균에 복잡 한에 조립 및 전체 분리 효소 태그 소 단위 친화성 크로마토그래피 를 통해 에 의해 순화 되었다. 이러한 접근 방식은 F1의 결정을 주도-ATPase 구조 두 thermophilic 박테리아 종, Geobacillus stearothermophilus15 Caldalkalibacillus thermarum16, 에서 그러나 17.,이 방법론은 오히려 진 핵 F1에 적합 하지 않습니다-ATPases 이후 간결한 protheosynthetic 장치, posttranslational 처리 및 복잡 한 어셈블리에 의존.

클로 프롬 기반 추출은 이전 F1을 분리 하는 데 사용 됩니다-ATPases 단 세포 digenetic 기생충 Trypanosoma cruzi18 와 토니 brucei19, 미국인을 일으키는 중요 한 포유류 병원 균 및 아프리카 trypanosomiases, 각각, 그리고 monogenic 곤충 기생충 Crithidia fasciculata20에서. 이 담긴 F1의 간단한 설명만 이끌어-ATPases, 다운스트림 응용 프로그램 완전히 구성, 구조, 및 복합물의 효소 속성을 특성화 하는 데 사용 했다. 이 문서에서는 설명 합니다 F1에 대 한 최적화 된 방법- 토니 brucei의 교양된 곤충 라이프 사이클 단계에서 ATPase 정화. 메서드는 소 및 효 모 F1-ATPases21,22의 격리에 대 한 설립된 프로토콜에 따라 개발 된다. 절차는 매우 순수 하 고 동종 효소 적합 체 외에서 효소 그리고 금지 분석 실험, 질량 분석23, 및 구조 결정24상세한 proteomic 특성화를 생성합니다. F1의 지식과 정화 프로토콜-ATPase 구조 원자 수준에서 화면 작은 분자 억제제, 식별 하 고 아프리카 trypanosomiases에 대 한 새로운 약물의 개발에 도움을 설계 하는 가능성을 엽니다. 또한, 프로토콜 정화 F1을 적용할 수 있습니다-다른 유기 체에서 ATPase.

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프로토콜

1. 버퍼 및 솔루션

  1. 아래에 나열 된 솔루션을 준비 합니다. 액체 크로마토그래피에 대 한 모든 버퍼 드 그냥 사용 하기 전에 ADP, benzamidine, 및 프로 테아 제 억제제를 추가 합니다.
    1. Aminocaproic 산 (ACA), 그리고 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A) 염 산 (Tris HCl) ph 8.0, 0.25 M 자당 5 m m benzamidine, 5mm 버퍼 a: 50 mM Tris 버퍼를 준비 합니다.
    2. 버퍼 b: 50 mM Tris HCl pH 8.0, 0.25 M 자당, 4 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 5mm benzamidine, 5mm ACA, 1mm ADP, 및 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A)를 준비 합니다.
    3. Q 열 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10mm MgSO4, 5 mM benzamidine, 5mm ACA, 및 1mm ADP.
    4. Q 열 차입 버퍼 준비: 1 M NaCl와 Q-열 버퍼.
    5. 초 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl pH 8.0, 10mm MgSO4, 100 m m NaCl, 1 mM ADP.
    6. 클로 프롬 2 M Tris HCl ph 8.5 포화를 준비 합니다. 클로 프롬을 믹스 2 M Tris HCl ph 8.5 스크류 캡 병에 약 1:1 비율에서, 흔들, 유기와 수성 단계 분리 시키고 pH 지시자 종이 스트립 위 수성 층에서 pH를 측정. 실내 온도에 상점. 그냥 사용 하기 전에, 다시 동요 하 고 별도 단계를 보자. 낮은 클로 프롬 레이어를 사용 합니다.
      주의: 클로 프롬은 휘발성과 눈과 피부에 자극. 증기 두건에서 작동 합니다. 안전 안경 흔들어 사용 합니다.

2입니다. 하위 미토 콘 드리 아 입자의 준비

  1. 침투성 세포25 에서 1 x 1011 procyclic T. brucei 얼음 버퍼 A. 유지 샘플 단계 3.2까지 냉장의 5 ml의 2 x 1011 셀에 의해 고립 된 미토 콘 드리 아 소포 (mitoplasts) resuspend
  2. Bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과26 제조업체의 지침에 따라에 의해 정지에 단백질 농도 결정 합니다.
    1. 초순에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 희석 시리즈를 사용 하 여 표준 곡선을 건설 하기 위하여. 적은 양의 샘플 BSA의 범위는 표준에 맞게 초순 물으로 20-100 배 희석.
    2. 샘플에서 총 단백질 양을 계산 하 고 추가 버퍼 A. 그것을 diluting 하 여 16 mg/ml 단백질 농도가지고
  3. 서 스 펜 션 7의 쥡니다 여 mitoplasts 거꾸로 소포 막 조각으로 조각 15 x 3.9 m m의 직경을 가진 70 ~ 100 J는 microtip와 충 동 당의 총 에너지와 s. 초음파 균질 화기는 에너지 출력을 표시 하지 않으면, 최대 전력의 50%에서 최적화를 시작 합니다. 30 대 한 얼음 샘플을 품 어 충 동 사이 s. 쥡니다, 후 정지가 된다 약간 어두운.
  4. 토사는 막 ultracentrifugation 54000 x g 16 h 또는 98000 x g 5 h 4 ° c.에 의해 조각 가만히 따르다는 상쾌한 클로 프롬 추출 진행 또는 플래시 동결 액체 질소에는 토사와-80 ° c.에 그것을 저장합니다

3. F1의 릴리스-클로 프롬에 의해 막에서 ATPase

  1. 작은 Dounce 균질 화기의 도움으로 버퍼 B에에서 미토 콘 드리 아 막의 펠 릿을 resuspend. 버퍼 B의 볼륨에 따라 총 버퍼의 사용 단계 2.1과 2.2를 사용 하 여 다음 수식에서 계산: 볼륨 (버퍼 B) = 볼륨 (버퍼 A) x 12/21. 15 또는 50 mL 원뿔 튜브에 정지를 전송.
  2. 얼음에서 샘플을 제거 하 고, 지금부터, 샘플 및 실 온에서 사용 될 모든 솔루션을 유지.
  3. 클로 프롬 2 M Tris HCl ph 8.5; 포화를 추가합니다 클로 프롬을 추가할 수의 현 탁 액의 절반 볼륨을 같습니다. 단단히 뚜껑을 닫습니다. 흔들어 적극적으로 정확히 20 s. 8400 x g 실 온에서 5 분에서 그것을 즉시 원심.
  4. 1.6 mL microtubes 이동 상단 흐린 수성 단계. 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A) 클로 프롬 치료에 의해 제거 억제제를 대체를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 13000 x g 에서 샘플 원심 신선한 microtubes는 상쾌한 전송 하 고 모든 불용 성 재료를 제거 하는 원심 분리를 반복 합니다.

4. 음이온 교환 크로마토그래피

  1. Equilibrate 280에서 흡 광도까지 5 mL/min의 유량에 Q 열 버퍼와 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 부착 된 5 mL 음이온 교환 (Q) 열 전도도 및 안정화 (버퍼의 약 50 mL).
  2. 280에서 흡수도 될 때까지 대기를 1 mL/분의 유량에 equilibrated 열에 3.3 단계에서는 상쾌한 로드 nm 안정화는 배경에서. 0.5 mL/분 수집 1 mL 분수의 흐름 속도에서 100 %0 %에서 Q-열 차입 버퍼의 25 mL 선형 그라데이션이 적용 됩니다.
  3. PH 8.0에 풀 먼 ATPase 분석 결과2 ATP 가수분해 활동에 대 한 주요 차입 피크에 해당 하는 개별 분수 시험 반응 혼합물의 1 mL 당 각 분수의 10 µ L을 사용 합니다. ATPase 활동 하는 분수를 풀. 선택적으로, 나트륨 라우릴 인산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE)에 각 분수의 10 µ L 고 Coomassie 파란 개별 F1을 시각화 하 여 젤 얼룩-ATPase 소 단위 및 오염 단백질.
  4. 막 한 200-500 µ L. 100000 MWCO PES 필터 스핀 열을 사용 하 여 풀링된 샘플 초 또는 게 실 온에서 하룻밤 샘플 진행 하는 집중.

5. 크기 배제 크로마토그래피

  1. SEC 열 0.5 mL/min의 유량에 SEC 버퍼의 적어도 48 mL (2 개의 열 볼륨)와 액체 크로마토그래피 시스템에 연결 된 equilibrate
  2. 열에 샘플을 적용 하 고 수집 0.25-mL 분수 0.25 mL/분의 유량에서 크로마토그래피를 실행 합니다.
  3. SDS 페이지에 UV280nm 흡수도 추적의 봉우리에 해당 하 고 Coomassie 블루 얼룩 분수의 10 µ L를 실행 합니다. F1을 포함 하는 첫 번째 주요 피크-ATPase. 풀 먼 ATPase 분석 결과 의해 ATP 가수분해 활동 및 아 지 드 감도 대 한이 피크에 해당 하는 분수 시험 BCA 분석 결과 의해 단백질 농도 결정 합니다.
  4. 순화 된 F1유지-실내 온도에 ATPase 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 정화 후 3 일 이내 사용 하 고. 또는 100000 MWCO PES 필터 > 1.5 mg/ml, 촉진 그것 포화 황산 암모늄을 혼합 하 여 pH 8.0 (볼륨 x 1.2), 조정 회전 열을 사용 하 여 샘플을 집중 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다

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결과

일반적인 정화 (그림 1) T. brucei 셀25 표준에서 양식 2 x 1011 procyclic hypotonically lysed 1 x 1011 Percoll 그라데이션에 고립 된 미토 콘 드 리아 소포 (mitoplasts)로 시작 포도 당-풍부한 SDM-79 중27. mitoplasts 쥡니다, 돌 다에 의해 조각화 되 고 포함 하는 매트릭스 상쾌한 삭제 됩니다. 미토 콘 드리 아 막 클로 프롬 F1을 출시와 함께 처리 됩니다-ATPase. 원심, 후 유기 단계 및 침전 된 interphase는 삭제 됩니다. 수성 단계는 분류 한 4 급 암모늄, 강한 음이온 교환기 (그림 2A)에 이온-교환 크로...

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토론

F1에 대 한 프로토콜-ATPase 정화 T. brucei 에서 개발한 F1의 분리에 따라 이전에 게시 방법-ATPase 단지 다른 종13,14에서. 메서드에 유전 수정 필요 하지 않습니다 (예를 들어, 태그) 하 고 현재 모든 소 단위와 완전히 활성화 단지 생성. 중요 한 단계는 F1의 클로 프롬 촉진 릴리스-ATPase 효소의 막 연결 부분에서. 지금까지 설명 된 모든 진 핵 종에서 purifications, 출시 subcomplex subunits α, β, γ, δ, 및 3:3:1:1:1의 산출할에서 ε 포함 되어 있습니다. T. brucei, F1에서-ATPase 소 단위 p18, euglenozoan 원생23제한 소설 구성의 3 개의 복사본을 추가...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 교육 ERC CZ의 내각에 의해 투자 되었다 LL1205, 체코 공화국의 부여 기관 보조금 18-17529S, 부여 그리고 ERDF/ESF에 의해 프로젝트 pathogenicity의 기생충 (No.의 독성 연구를 위한 센터 CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759)입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)ApplichemA0948
Amastatin HydrochlorideGlantham Life SciencesGA1330
Aminocaproic AcidApplichemA2266
BCA 단백질 분석 키트ThermoFischer Scientific/Pierce23225
Benzamidine HydrochlorideCalbiochem199001
Bestatin HydrochlorideSigma Aldrich/MerckB8385
클로로포름모든 공급업체
cOmplete 정제, Mini EDTA 무함유Roche4693159001프로테아제 억제제 칵테일 정제
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)Any supplier
염산pH 조정을 위한모든 공급업체
Ile-Pro-Ile시그마 Aldrich/MerckI9759별칭 Diprotin A
LeupeptinSigma Aldrich/MerckL2884
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트모든 공급업체
펩스타틴 A시그마 Aldrich/MerckP5318
단백질 전기 영동 시스템모든 공급 업체
염화나트륨모든 공급 업체
설탕모든 공급 업체
Tris모든 공급 업체
< 강한> 이름 < / 강한>< 강한> 회사 < / 강>< 강한>카탈로그 번호 < / strong>Comments< / strong>
소모품
SW60Ti용 원심분리기 튜브, 폴리알로머Beckman Coulture328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL모든 공급업체
유리 진공 여과 장치Sartorius516-7017액체 크로마토그래피용 탈기 솔루션
HiTrap Q HP, 5 mLGE Healthcare Life 과학17115401음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼
Regenaretad 셀룰로오스 멤브레인 필터, 기공 크기 0.45 μ m, 직경 47 mmSartorius18406--47------N액체 크로마토그래피용 탈기 솔루션
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences29091596Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PESSartoriusVS0641
NameCompany 카탈로그 번호Comments
Equipment
AKTA Pure 25GE Healthcare Life Sciences29018224또는 유사한 FPLC 시스템
분광 광도계 Shimadzu UV-1601Shimadzu또는 운동 분석 모드가 있는 유사한 분광 광도계
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti 로터벡크만 쿨처또는 유사한 초원심분리기 및 로터
얇은 프로브가 있는 초음파 균질화기, 모델 3000BioLogics0-127-0001또는 유사한 초음파 균질화기

참고문헌

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