Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Isolatie van F1-ATPase van de parasitaire Protist Trypanosoma brucei

doi: 10.3791/58334 Published: January 22, 2019

Summary

Dit protocol beschrijft de zuivering van F1-ATPase van de gekweekte insecten fase van Trypanosoma brucei. De procedure levert een zeer zuivere, homogene en actieve complex geschikt voor structurele en enzymatische studies.

Abstract

F1-ATPase is een membraan-extrinsieke katalytische subcomplex van F-type ATP-synthase, een enzym dat de proton motive force over biologische membranen gebruikt voor de productie van adenosine trifosfaat (ATP). Het isolement van de intact F1-ATPase van de inheemse bron is een essentiële voorwaarde voor het karakteriseren van het enzym eiwit samenstelling, kinetische parameters en gevoeligheid voor inhibitoren. Een zeer zuivere en homogene F1-ATPase kan worden gebruikt voor structurele studies, die inzicht geven in de moleculaire mechanismen van de ATP-synthese en hydrolyse. Dit artikel beschrijft een procedure voor de zuivering van de F-1-ATPase van Trypanosoma brucei, de verwekker van Afrikaanse trypanosomiasen. De F-1-ATPase is geïsoleerd van mitochondriale blaasjes, die zijn verkregen door hypotone lysis van trypanosomen in vitro gekweekt. De blaasjes zijn mechanisch gefragmenteerd door ultrasoonapparaat en de F-1-ATPase vrijkomt uit het binnenste van de mitochondriale membraan door de chloroform extractie. De enzymatische complex wordt verder gezuiverd door opeenvolgende anion uitwisseling en grootte-uitsluiting chromatografie. Gevoelige massaspectrometrie technieken bleek dat het gezuiverde complex verstoken van vrijwel elk eiwit contaminanten is en daarom geschikt materiaal voor structuurbepaling door middel van röntgendiffractie of cryo-elektronenmicroscopie vertegenwoordigt. De geïsoleerde F1-ATPase vertoont ATP Hydrolytische activiteit, die volledig kan worden geremd door natriumazide, een krachtige remmer van F-type ATP synthases. Het gezuiverde complex blijft stabiel en actief gedurende ten minste drie dagen bij kamertemperatuur. Neerslag door ammonium sulfaat wordt gebruikt voor langetermijnopslag. Soortgelijke procedures zijn gebruikt voor de zuivering van F1- ATPasen van zoogdier- en plantaardige weefsels, gisten of bacteriën. Dus, het voorgestelde protocol kan dienen als richtsnoer voor de F-1-ATPase los van andere organismen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De F-type ATP synthases zijn membraan-gebonden roterende multiprotein complexen die paar proton translocatie over energie-transducing membranen van bacteriën, mitochondria en chloroplasten met de vorming van ATP. Moleculaire gegevens van het roterende mechanisme van de ATP-synthese bekend zijn voornamelijk vanwege structurele studies van gezuiverde bacteriële en mitochondriale ATP synthases en hun subcomplexes1. F-type ATP-synthase is onderverdeeld in de membraan-intrinsieke en extrinsieke membraan wordt. Het membraan-extrinsieke deel, bekend als F1-ATPase, bevat drie katalytische sites, waar de fosforylatie van adenosinedifosfaat (ADP) naar ATP of de omgekeerde reactie optreedt. F1-ATPase kan worden vrijgegeven experimenteel van de membraan-intrinsieke groep met behoud van haar vermogen om te hydrolyseren, maar niet synthetiseren, ATP. De sector van de membraan-gebonden, genaamd Fo, bemiddelt eiwit translocatie, die de rotatie van het centrale deel van het enzym drijft. De F-1 en Fo sectoren zijn verbonden door de centrale en perifere stengels.

De eerste pogingen om te zuiveren van de F-1-ATPase van ontluikende gist en boviene hart mitochondriën datum terug naar de jaren 1960. Deze protocollen gebruikt geëxtraheerd mitochondriën, die werden verstoord door ultrasoonapparaat, gespreide door ammonium of tijdje sulfaat neerslag, gevolgd door een optionele chromatografie stappen en warmtebehandeling2,3,4 ,5,6. De zuivering is sterk verbeterd en vereenvoudigd door het gebruik van chloroform, die gemakkelijk de versies van de F-1-ATPase van de mitochondriale membraan fragmenten7. De chloroform winning werd vervolgens gebruikt om te uittreksel van F1- ATPasen van diverse dier, plant en bacteriële bronnen (bijvoorbeeld, rat lever8, maïs9, Gevlekte aronskelk10en Escherichia coli 11). Verdere zuivering van de chloroform-vrijgegeven F1-ATPase door affiniteit of grootte-uitsluiting chromatography (SEC) leverde een zeer zuivere eiwit complex, die geschikt voor hoge resolutie structuurbepaling door middel van röntgendiffractie was, als gedocumenteerd door de structuren van F1-ATPase van boviene hart12,13 en14van de Saccharomyces cerevisiae. F1-ATPase structuren werden ook bepaald op basis van organismen die moeilijk te cultiveren en, dus, het bedrag van het eerste biologisch materiaal was beperkt. In dit geval, de F-1-ATPase subeenheden kunstmatig werden uitgedrukt en samengevoegd tot het complex in E. coli, en het hele heterologe enzym werd gezuiverd door affiniteit chromatografie via een gecodeerde subeenheid. Dergelijke aanpak heeft geleid tot de vaststelling van F1-ATPase structuren uit twee thermofiele bacteriesoorten, Geobacillus stearothermophilus15 en Caldalkalibacillus thermarum16, 17. deze methode is echter nogal ongeschikt voor eukaryotische F1- ATPasen aangezien zij beroept zich op de prokaryote protheosynthetic toestellen, posttranslationele verwerking en complexe assemblage.

De winning van chloroform gebaseerde werd eerder gebruikt om te isoleren F1- ATPasen van digenetic van eencellige parasieten Trypanosoma cruzi18 en T. brucei19, belangrijke zoogdieren ziekteverwekkers, waardoor Amerikaanse en Afrikaanse trypanosomiasen, respectievelijk, en van monogeen insect-parasiet Crithidia fasciculata20. Deze zuivering leidde slechts tot een eenvoudige beschrijving van de F-1- ATPasen, aangezien geen downstream toepassingen werden gebruikt om de samenstelling, structuur en enzymatische eigenschappen van het complex volledig te karakteriseren. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde methode voor F1-ATPase zuivering van de fase van de levenscyclus van de gekweekte insecten van T. brucei. De methode is ontwikkeld op basis van de vastgestelde protocollen voor isolatie van runderen en gist F1- ATPasen21,22. De procedure levert zeer zuiver en homogene enzym geschikt voor in vitro enzymatische en remmende testen, gedetailleerde proteomic karakterisering door massaspectrometrie23en structuur vastberadenheid24. Het protocol van de reiniging en de kennis van de F-1-ATPase structuur op het atomaire niveau opent een mogelijkheid voor het ontwerpen van de schermen te identificeren kleine-molecuul remmers, steun bij de ontwikkeling van nieuwe medicijnen tegen Afrikaanse trypanosomiasen. Bovendien, het protocol kan worden aangepast aan het zuiveren van F1-ATPase van andere organismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. buffers en oplossingen

  1. Het bereiden van de oplossingen die hieronder vermeld. Ontgas alle buffers voor vloeistofchromatografie. Toevoegen van ADP, benzamidine en protease remmers vlak voor gebruik.
    1. Bereiden buffer A: 50 mM Tris buffer met zoutzuur (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M sacharose, benzamidine 5 mM, 5 mM aminocaproic zuur (ACA) en protease remmers (10 µM amastatin, 50 µM bestatin 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin en 50 µM diprotin A).
    2. Buffer B: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M sacharose, 4 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), benzamidine van 5 mM, 5 mM ACA, 1 mM ADP, en proteaseinhibitors (10 µM amastatin, 50 µM bestatin 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin en 50 µM diprotin A) voorbereiden.
    3. Q-kolom buffer bereiden: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO4, 5 mM benzamidine, 5 mM ACA en 1 mM ADP.
    4. Bereiden van Q-kolom-elutie-buffer: Q-kolom buffer met 1 M NaCl.
    5. SEC buffer bereiden: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgSO4, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
    6. Chloroform verzadigd met 2 M Tris-HCl pH 8,5 voor te bereiden. Meng chloroform met 2 M Tris-HCl pH 8,5 in ongeveer 1:1 verhouding in een fles met schroefdop, schudden, laat de organische en waterige fase afzonderlijk en meten van de pH in het bovenste waterige laag met een strook papier van de pH-indicator. Bewaren bij kamertemperatuur. Vlak voor gebruik, schud opnieuw en laat de afzonderlijke fasen. Gebruik de onderste chloroformlaag.
      Let op: Chloroform is vluchtig en irriterend voor de ogen en de huid. Werken in een zuurkast. Gebruik veiligheid bril wanneer schudden.

2. voorbereiding van de sub-mitochondriale deeltjes

  1. Resuspendeer mitochondriale blaasjes (mitoplasts) geïsoleerd door hypotone lysis25 van 1 x 1011 tot en met 2 x 1011 cellen van T. brucei procyclische in 5 mL ijskoud buffer A. Houd het monster gekoeld tot stap 3.2.
  2. Bepaal de concentratie van de eiwitten in de opschorting door de bicinchoninic zuur (BCA) eiwit assay26 volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Gebruik een verdunningsreeks bovien serumalbumine (BSA) in ultrazuiver water voor de bouw van de standaard curve. Verdun een kleine hoeveelheid monster 20 - 100 keer met ultrazuiver water om te passen in het bereik van de BSA-normen.
    2. Berekenen van het bedrag van de totale proteïne in de steekproef en de eiwitconcentratie tot 16 mg/mL te brengen door verder verdunnen het met extra buffer A.
  3. Fragment van de mitoplasts in omgekeerde blaasjes en membraan stukken met het ultrasoonapparaat van de schorsing 7 x voor 15 s met een totale energie van 70 tot 100 J per impuls met een microtip met een diameter van 3.9 mm. Als de ultrasone homogenizer het energetisch rendement niet wordt weergegeven, beginnen de optimalisatie op 50% van de maximale kracht. Incubeer het monster op het ijs voor 30 s tussen impulsen. Na het ultrasoonapparaat wordt de schorsing iets donkerder.
  4. Sediment het membraan fragmenten door ultracentrifugatie bij 54.000 x g voor 16 h of bij 98.000 x g gedurende 5 uur bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof decanteren en doorgaan met de chloroform extractie, of flash-freeze het sediment in vloeibare stikstof en opslaan bij-80 ° C.

3. vrijgave van F1-ATPase van membraan door Chloroform

  1. Resuspendeer de pellet van mitochondriale membranen in buffer B met behulp van een kleine Dounce homogenizer. Bereken het volume van de buffer B op basis van het totale bedrag van de buffer een gebruikte in stap 2.1 en 2.2 met behulp van de volgende formule: volume (buffer B) = volume (buffer A) x 12/21. Spoel de suspensie aan een 15 - of 50-mL conische buis.
  2. Verwijder het monster uit ijs en, van nu af aan, houden van het monster en alle oplossingen worden gebruikt bij kamertemperatuur.
  3. Toevoegen van chloroform verzadigd met 2 M Tris-HCl pH 8,5; het volume van chloroform worden toegevoegd is gelijk aan de helft van het volume van de schorsing. Sluit het GLB strak. Het schudden voor precies 20 s. Centrifugeer het onmiddellijk bij 8.400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. De bovenste bewolkt waterfase overbrengen 1.6-mL slangen. Voeg proteaseinhibitors (10 µM amastatin, 50 µM bestatin 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin en 50 µM diprotin A) ter vervanging van de remmers verwijderd door de chloroform behandeling. Centrifugeer de monsters bij 13.000 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Het supernatant overbrengen in verse slangen en herhaal het centrifugeren om te verwijderen van de onoplosbare materiaal.

4. anion-uitwisseling chromatografie

  1. Equilibreer de 5 mL anion (Q) wisselingskolom aangesloten op een snel-eiwit vloeistofchromatografie-systeem met de buffer van de Q-kolom op een debiet van 5 mL/min tot de absorptie bij 280 nm en de geleidbaarheid stabiliseren (ongeveer 50 mL buffer).
  2. Laden van de bovendrijvende substantie uit stap 3.3 op de equilibrated kolom op een debiet van 1 mL/min. wachten tot de extinctie op 280 nm stabiliseert op de achtergrond. Toepassing van een lineair verloop van 25 mL van de buffer van de Q-kolom-elutie van 0% tot 100% op een debiet van 0,5 mL/min. verzamelen 1 mL breuken.
  3. De individuele fracties die overeenkomt met de grote elutie piek voor ATP Hydrolytische activiteit door de Pullman ATPase assay2 op pH 8,0 assay. Gebruik 10 µL van elke breuk per 1 mL reactiemengsel. Zwembad de breuken die ATPase activiteit vertonen. Desgewenst scheiden 10 µL van elke fractie op elektroforese fosfaat polyacrylamidegel van natrium dodecyl (SDS-pagina) en de gel door Coomassie Blue te visualiseren van individuele F1vlek-ATPase subeenheden en contaminerende eiwitten.
  4. Concentraat de gepoolde monster door membraan ultrafiltratie met behulp van een draai-kolom met een 100.000 MWCO PES filter 200-500 µL. Ga door naar SEC of winkel het monster 's nachts bij kamertemperatuur.

5. size-exclusion Chromatography

  1. Equilibreer de kolom van de SEC aangesloten op een systeem van de vloeibare chromatografie met ten minste 48 mL (twee volumes van de kolom) van de buffer van de SEC op een debiet van 0,5 mL/min.
  2. Het monster van toepassing op de kolom en draaien van chromatografie op een debiet van 0,25 mL/min. verzamelen 0,25 mL breuken.
  3. Voer 10 µL van de breuken die overeenkomen met de toppen van de UV280nm extinctie trace op SDS-pagina en vlekken hen door Coomassie Blue. De eerste grote piek bevat de F-1-ATPase. Assay de breuken die overeenkomt met deze piek voor het ATP Hydrolytische activiteit en azide gevoeligheid door de Pullman ATPase-bepaling. Bepaal de eiwitconcentratie de BCA-bepaling.
  4. Houden van de gezuiverde F1-ATPase bij kamertemperatuur en gebruik het binnen 3 d na zuivering voor downstream toepassingen. Anderzijds concentreren van het monster met behulp van een draai-kolom met een 100.000 MWCO PES filter > 1,5 mg / mL, overhaaste het door het te mengen met verzadigde ammoniumsulfaat aangepast op pH 8,0 (1.2 x het volume) en sla het bij 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een typische zuivering (Figuur 1) begint met mitochondriale blaasjes (mitoplasts), geïsoleerd op het verloop van de Percoll van hypotonically lysed 1 x 1011 moet 2 x 1011 procyclische T. brucei cellen25 gekweekt in standaard glucose-rijke SDM-79 middellange27. De mitoplasts met het ultrasoonapparaat, gesponnen, zijn gefragmenteerd en wordt het matrix-bevattende supernatant verwijderd. Mitochondriale membranen zijn behandeld met chloroform om vrij van de F-1-ATPase. Na het centrifugeren, de organische fase en geprecipiteerde interfase teruggegooid. De waterige fase is gefractioneerde door ionenwisselingschromatografie op quaternaire ammoniumzouten, een sterke anionenwisselaar (figuur 2A). De breuken die met de grote elutie corresponderen piek en bevatten de F-1-ATPase worden gebundeld en geconcentreerd. Dit materiaal dient als invoer voor de SEC, die resterende onzuiverheden elimineert. De grote verontreiniging is dihydrolipoyl dehydrogenase, die als een discrete piek, gekenmerkt door de donkere groene balk in figuur 2Bvan de SEC-kolom GC. De F-1-ATPase GC in de eerste dominant, grotendeels symmetrische piek (figuur 2B).

De voortgang van de zuivering wordt gevolgd door de BCA eiwit bepaling (of een andere gemeenschappelijke eiwit assay), SDS-pagina en de monitoring van ATPase activiteit. Het tempo van de ATP-hydrolyse wordt gemeten door de Pullman ATP regenereren assay2, gebaseerd op de daling van de extinctie van NADH in de gekoppelde reactie. Natriumazide, een gevestigde remmer van F1-ATPase, wordt gebruikt bij een concentratie van 2-mM om te bepalen van het aandeel van de F-1-ATPase-specifieke ATP-hydrolyse. Het uitgangsmateriaal bevat meestal ongeveer 150-300 mg van mitochondriale eiwit, afhankelijk van het aantal cellen die worden gebruikt als de bron van mitochondriale blaasjes. De azide-gevoelige deel van de totale ATPase activiteit is ongeveer 30% tot 40% in dit stadium. Na de extractie van chloroform, meer dan 90% van ATPase activiteit in het monster wordt bijgedragen aan de F-1-ATPase. De gezuiverde F1- ATPase vrijwel volledig gevoelig is voor de behandeling van azide (de minimale residuele ATPase activiteit kan worden toegeschreven aan de achtergrond ATP autolyse) en vertegenwoordigt ongeveer 1% van de invoer eiwit massa, met een geschatte opbrengst van 1 - 1,5 mg F1-ATPase per 1 x 1011 cellen (tabel 1). Een typische band patroon na de scheiding van de gezuiverde F1-ATPase op SDS-pagina gel gevolgd door Coomassie Blue kleuring wordt weergegeven in figuur 2C. De eiwitten zijn geïdentificeerd door peptide massa vingerafdrukken en gekenmerkt in detail door verschillende massaspectrometrie benaderingen23. Sporadische zwakke bands zichtbaar boven de β-subunit band vertegenwoordigen subcomplexes van de α3β3 zendspoel (Dimeren en oligomeren van α - en β-subunits) en zijn verstoken van eventuele verontreinigingen aantoonbaar met gevoelige massaspectrometrie technieken. De gezuiverde F1-ATPase kan worden opgeslagen voor tot meerdere dagen in de buffer van de SEC bij kamertemperatuur. U kunt ook de F-1-ATPase aan ≥2 mg/mL geconcentreerd kan worden versneld door een gelijk volume verzadigde ammoniumsulfaat in de buffer van de SEC, met pH aangepast aan de 8.0, en opgeslagen bij 4 ° C. Gedurende ten minste zes maanden na de neerslag, kan het actieve enzym met geen voor de hand liggende afbraak van elke subeenheid worden verkregen door het redissolving van de neergeslagen materiaal in de SEC buffer of gelijkaardige oplossing. Opslag langer dan een maand is echter niet geschikt voor kristallisatie, zoals empirisch bepaald.

Figure 1
Figuur 1 : Regeling van de procedure zuivering. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : In twee stappen zuivering van de chloroform-vrijgegeven F1-ATPase door vloeistofchromatografie. (A) elutie Profiel van anion-uitwisseling chromatografie (bovenste deelvenster) en geselecteerde breuken gescheiden op de 10% - 20% Tris-glycine SDS-pagina gel bevlekt met Coomassie Blue kleurstof (lagere paneel). Blauwe trace: UV-absorptie bij 280 nm; rode trace: concentratie van NaCl in de elutie buffer; Input: de F1-ATPase uitgebracht door chloroform; FT: doorstroom. (B) elutie Profiel van SEC (bovenste deelvenster) en geselecteerde breuken gescheiden op de SDS-pagina gel bevlekt met Coomassie Blue kleurstof (lagere paneel). Ingang: gebundeld breuken uit anion-uitwisseling chromatografie met F1-ATPase. De gekleurde balken in panelen A en B markeren de breuken in de elutie profielen die werden geanalyseerd door SDS-PAGE en de bijbehorende rijstroken in de respectieve gel. (C) identiteiten van individuele eiwitten van de geïsoleerde F1-ATPase zoals aangegeven door de Spectrometrie van de massa. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Eiwitconcentratie (mg/mL) Totaal eiwit (mg) Aandeel van uitgangsmateriaal (%) Activiteit
(ΜmolATP x mg-1 x min-1)
Azide gevoeligheid (%)
Mitochondriale blaasjes in buffer A 16.2 170 100 1.3 25-35
Mitochondriale membranen in buffer B 18.6 97 57 2.4 35-45
Chloroform geëxtraheerd breuken 2.5 7,9 4.7 12 91-95
F1-ATPase na Q-kolom - 2.2 1.3 23 92-96
F1-ATPase na gel filtratie - 1.6 0.93 48 93-98

Tabel 1: Een voorbeeld van het typische verloop en het rendement van de F-1-ATPase zuivering van mitochondria van 1 x 1011 cellen T. brucei procyclische geïsoleerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het protocol voor F1-ATPase zuivering van T. brucei werd ontwikkeld op basis van eerder gepubliceerde maatregelen voor de isolering van F1-ATPase complexen van andere soorten13,14. De methode vereist geen genetische wijzigingen (bijvoorbeeld, tagging) en levert een volledig actieve complex met alle subeenheden aanwezig. De cruciale stap is de chloroform-vergemakkelijkt release van de F-1-ATPase uit het membraan-ingeschrevenen deel van het enzym. In de zuivering van alle eukaryotische soorten tot dusver beschreven, bevatte de vrijgegeven subcomplex subeenheden α, β, γ, δ en ε in een stoichiometrie van 3:3:1:1:1. In T. brucei, de F-1-ATPase bevat een extra drie exemplaren van de subeenheid p18, een nieuwe component beperkt tot euglenozoan protisten23. Bovendien is de euglenozoan α-subunit proteolytically gesplitst in twee fragmenten, beide stabiel gekoppeld aan de complexe24,28,29. De subeenheid OSCP (oligomycin-gevoeligheid-overdracht van het eiwit), die links van de F-1-groep tot de perifere stengel30, afwezig is van het vrijgegeven complex, is die in overleg met F1-ATPase zuivering door chloroform winning van andere soorten13,14.

De chloroform-vrijgegeven F1-ATPase is verder gezuiverd door vloeistofchromatografie. In het geval van de bovine F1-ATPase, slechts één chromatografie stap, grootte-uitsluiting chromatografie, volstaat om het verkrijgen van een zeer zuivere en actieve complexe31. De enkele SEC set-up was echter onvoldoende voor de zuivering van de T. brucei F1-ATPase, als de breuken verrijkt voor F1-ATPase bevatte extra eiwit contaminanten, hoofdzakelijk delta-1-pyrroline-5-carboxylaat dehydrogenase. Daarom anion-uitwisseling chromatografie geïntroduceerd voordat de SEC als de eerste en belangrijke stap in de zuiverende en de SEC fungeert als de vervolgprocedure polijsten. Voor kristallisatie experimenten, het gebruik van de kolom Superdex 200 verhogen gebleken dat, aangezien deze kolom verstrekte materiaal waardoor het groeien van kristallen van goede kwaliteit. Het is waarschijnlijk dat de resolutie van de kolom ingeschakeld de scheiding van een klein deel van onvolledige complexen die bemoeid met kristallisatie. Echter was de scheiding met behulp van de kolom Superdex 200 voor andere toepassingen dan kristallisatie, even bevredigend.

Ter bescherming van de F-1-ATPase complex van gedeeltelijke proteolyse door onbekende protease(s) aanwezig in de mitochondriale lysate, de eerste buffers A en B bevatte een breed scala aan proteaseinhibitors. Het effect van afzonderlijke remmers op de proteolyse van F1-ATPase subeenheden is niet getest en, waarschijnlijk, de aanwezigheid van enkele van de remmers is overbodig. Voor de stap van de SEC, de remmers worden niet toegevoegd meer, zoals de besmettende proteasen worden verwijderd uit de F-1-ATPase monster door de chloroform extractie of de eerste stap van de chromatografie.

Het meerstaps protocol leidt onvermijdelijk tot gedeeltelijke verlies van de F-1-ATPase. De meest significante verlies (25-45% van het totaalbedrag) treedt op tijdens de stap van de concentratie door membraan ultrafiltratie op een spin kolom na de chromatografie anion-uitwisseling. De F-1-ATPase waarschijnlijk houdt zich aan het membraan van de spin-kolom. Dus voor enkele downstream-toepassingen die niet een zeer zuivere en geconcentreerde steekproef (b.v., enzymatische tests en remmende schermen), de F-1 eisen-ATPase onmiddellijk na de anion-uitwisseling chromatografie (zie figuur kan worden gebruikt 2b, Input lane).

Hoewel de zuivering van F1-ATPase van verschillende organismen varieert in detail, de algemene workflow blijft hetzelfde. Daarom dit protocol kan dienen als richtsnoer voor de ontwikkeling van de F-1-ATPase protocol van de isolatie van andere overvloedige bronnen, zoals weefsels of cellen gemend op grote schaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door het ministerie van onderwijs ERC CZ verlenen van LL1205, de toekenning van de subsidie Agentschap van Tsjechië 18-17529S, en door het EFRO/ESF project centrum voor onderzoek van de pathogeniteit en de virulentie van parasieten (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
  2. Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
  3. Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2552-2560 (1967).
  4. Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2547-2551 (1967).
  5. Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140, (1), 257-266 (1970).
  6. Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246, (23), 7328-7336 (1971).
  7. Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148, (3), 533-537 (1975).
  8. Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178, (2), 289-297 (1979).
  9. Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2, (10), 1783-1789 (1983).
  10. Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225, (3), 821-824 (1985).
  11. Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142, (3), 768-776 (1980).
  12. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370, (6491), 621-628 (1994).
  13. Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229, (3), 787-790 (1993).
  14. Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25, (22), 5433-5442 (2006).
  15. Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282, (15), 2895-2913 (2015).
  16. Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152, (2), 140-145 (2005).
  17. Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (39), 10860-10865 (2016).
  18. Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65, (1), 103-109 (1980).
  19. Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43, (1), 125-132 (1990).
  20. Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3, (6), 357-367 (1981).
  21. Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184, (4), 677-701 (1985).
  22. Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37, (2), 479-485 (2004).
  23. Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285, (3), 614-628 (2018).
  24. Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (9), 2102-2107 (2018).
  25. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, (1), 76-85 (1985).
  27. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99, (1), 89-101 (1999).
  28. Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85, (2), 171-186 (1997).
  29. Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135, (2), 221-224 (2004).
  30. Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368, (2), 310-318 (2007).
  31. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282, (19), 14238-14242 (2007).
Isolatie van F<sub>1</sub>-ATPase van de parasitaire Protist <em>Trypanosoma brucei</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).More

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter