Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

F1의 절연-ATPase 기생 원생 생물 Trypanosoma brucei 에서

doi: 10.3791/58334 Published: January 22, 2019

Summary

이 프로토콜 설명 F1의 정화- Trypanosoma brucei의 교양된 곤충 단계에서 ATPase. 프로시저 생성 매우 순수한, 균질, 고 활성 복잡 한 구조상과 효소 연구에 적합 합니다.

Abstract

F1-ATPase는 F 형 ATP synthase, 생물 막에 걸쳐 양성자 동기 힘을 사용 하 여 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 생산 하는 효소의 막 외부 촉매 subcomplex. 그대로 F1의 절연-ATPase는 네이티브 소스에서 효소의 단백질 구성, 운동, 변수와 감도 억제제를 특성화 하는 필수적인 전제 조건입니다. 매우 순수 하 고 균질 F1-ATPase는 ATP 합성과 가수분해의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하는 구조 연구에 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 설명 합니다 F1의 정화에 대 한 절차- Trypanosoma brucei, 아프리카 trypanosomiases의 원인이 되는 대리인에서에서 ATPase. F1-ATPase는 침투성 세포에 생체 외에서 배양 trypanosomes에서 여는 미토 콘 드 리아 vesicles에서 격리 됩니다. 소포는 기계적으로 쥡니다와 F1에 의해 조각-ATPase는 클로 프롬 적 출에 의해 내부 미토 콘 드 리아 멤브레인에서 발표. 효소 복합물은 추가 연속 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정화 된다. 중요 한 질량 분석 기술을 보여주었다는 순화 된 복잡 한 거의 모든 단백질 오염 물질 없는 이며, 따라서, 엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법에 의해 구조 결심을 위한 적당 한 물자를 나타냅니다. 격리 된 F1-ATPase 전시 ATP 가수분해 활동, 나트륨 아 지 드, F 형 ATP synthases의 강력한 억제제에 의해 완전히 저해 될 수 있습니다. 순화 된 복잡 한 실내 온도에 적어도 3 일에 대 한 안정적이 고 활성 남아 있습니다. 황산 암모늄에 의해 강 수는 장기 저장을 위해 사용 됩니다. 유사한 절차는 F1의 정화 사용 되었습니다-ATPases 포유류 및 식물 조직, 효 모, 또는 박테리아. 따라서, 제시 프로토콜 F1에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다-다른 유기 체에서 ATPase 격리.

Introduction

F 타입 ATP synthases는 막 도약 ATP 형성 박테리아와 미토 콘 드리 아, 엽록체의 에너지 시험 막 걸쳐 multiprotein 단지 그 몇 양성자 전 좌를 회전. ATP 합성의 회전 메커니즘의 분자 세부 정화 박테리아와 미토 콘 드리 아 ATP synthases 및 그들의 subcomplexes1의 구조 연구 때문에 주로 알려져 있습니다. F 형 ATP synthase 막 내장 고 막 외부 moieties로 구성 됩니다. F1막 외부 부분-ATPase, 포함 ATP 또는 역방향 반응은 아데노신 diphosphate (ADP)의 인 산화 발생 3 촉매 사이트. F1-ATPase 공개 될 수 있는 실험적으로 막 내장 moiety에서은, 하지만 하지, ATP를 합성 하는 기능을 유지 하면서. Fo, 라고 막 도약 분야 중재 단백질 전 좌, 효소의 중앙 부분의 회전 드라이브. F1 과 Fo 분야 중앙과 주변 줄기로 연결 된다.

첫 번째는 F1을 정화 하려고-1960 년대에 다시 싹 트는 효 모 및 소 심장 미토 콘 드리 아에서 ATPase. 이러한 프로토콜 사용 추출 쥡니다, 암모늄 또는 protamine 황산 염 강 수, 옵션 크로마토그래피 단계 및 열 처리2,3,4로 분류 한에 의해 중단 되었다 미토 콘 드리 아 ,,56. 정화는 크게 개선 하 고 클로 프롬, F1를 쉽게 해제 사용 하 여 단순화-미토 콘 드 리아 멤브레인에서 ATPase 조각7. 클로 프롬 추출 했다 다음 F1을 추출 하는 데 사용 됩니다-ATPases 다양 한 동물, 식물 및 세균성 원본 (예를 들어, 쥐 간8, 옥수수9, 식물 maculatum10병원 성 대장균 11). 더 클로 프롬 발표 F1의 정화-ATPase 선호도 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 굴복 했다 엑스레이 결정학에 의해 고해상도 구조 결정을 위해 적당 한, 매우 순수한 단백질 복잡 한로 F1의 구조에 의해 문서화-소 심장12,13Saccharomyces cerevisiae14ATPase. F1-ATPase 구조 또한 육성 하기 어려운 유기 체에서 결정 하 고, 따라서, 초기 생물 학적 물질의 양을 제한 했다. 이 경우에는 F1에서-ATPase subunits 인위적으로 표현 되었고, 대장균에 복잡 한에 조립 및 전체 분리 효소 태그 소 단위 친화성 크로마토그래피 를 통해 에 의해 순화 되었다. 이러한 접근 방식은 F1의 결정을 주도-ATPase 구조 두 thermophilic 박테리아 종, Geobacillus stearothermophilus15 Caldalkalibacillus thermarum16, 에서 그러나 17.,이 방법론은 오히려 진 핵 F1에 적합 하지 않습니다-ATPases 이후 간결한 protheosynthetic 장치, posttranslational 처리 및 복잡 한 어셈블리에 의존.

클로 프롬 기반 추출은 이전 F1을 분리 하는 데 사용 됩니다-ATPases 단 세포 digenetic 기생충 Trypanosoma cruzi18토니 brucei19, 미국인을 일으키는 중요 한 포유류 병원 균 및 아프리카 trypanosomiases, 각각, 그리고 monogenic 곤충 기생충 Crithidia fasciculata20에서. 이 담긴 F1의 간단한 설명만 이끌어-ATPases, 다운스트림 응용 프로그램 완전히 구성, 구조, 및 복합물의 효소 속성을 특성화 하는 데 사용 했다. 이 문서에서는 설명 합니다 F1에 대 한 최적화 된 방법- 토니 brucei의 교양된 곤충 라이프 사이클 단계에서 ATPase 정화. 메서드는 소 및 효 모 F1-ATPases21,22의 격리에 대 한 설립된 프로토콜에 따라 개발 된다. 절차는 매우 순수 하 고 동종 효소 적합 체 외에서 효소 그리고 금지 분석 실험, 질량 분석23, 및 구조 결정24상세한 proteomic 특성화를 생성합니다. F1의 지식과 정화 프로토콜-ATPase 구조 원자 수준에서 화면 작은 분자 억제제, 식별 하 고 아프리카 trypanosomiases에 대 한 새로운 약물의 개발에 도움을 설계 하는 가능성을 엽니다. 또한, 프로토콜 정화 F1을 적용할 수 있습니다-다른 유기 체에서 ATPase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 버퍼 및 솔루션

  1. 아래에 나열 된 솔루션을 준비 합니다. 액체 크로마토그래피에 대 한 모든 버퍼 드 그냥 사용 하기 전에 ADP, benzamidine, 및 프로 테아 제 억제제를 추가 합니다.
    1. Aminocaproic 산 (ACA), 그리고 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A) 염 산 (Tris HCl) ph 8.0, 0.25 M 자당 5 m m benzamidine, 5mm 버퍼 a: 50 mM Tris 버퍼를 준비 합니다.
    2. 버퍼 b: 50 mM Tris HCl pH 8.0, 0.25 M 자당, 4 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 5mm benzamidine, 5mm ACA, 1mm ADP, 및 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A)를 준비 합니다.
    3. Q 열 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10mm MgSO4, 5 mM benzamidine, 5mm ACA, 및 1mm ADP.
    4. Q 열 차입 버퍼 준비: 1 M NaCl와 Q-열 버퍼.
    5. 초 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl pH 8.0, 10mm MgSO4, 100 m m NaCl, 1 mM ADP.
    6. 클로 프롬 2 M Tris HCl ph 8.5 포화를 준비 합니다. 클로 프롬을 믹스 2 M Tris HCl ph 8.5 스크류 캡 병에 약 1:1 비율에서, 흔들, 유기와 수성 단계 분리 시키고 pH 지시자 종이 스트립 위 수성 층에서 pH를 측정. 실내 온도에 상점. 그냥 사용 하기 전에, 다시 동요 하 고 별도 단계를 보자. 낮은 클로 프롬 레이어를 사용 합니다.
      주의: 클로 프롬은 휘발성과 눈과 피부에 자극. 증기 두건에서 작동 합니다. 안전 안경 흔들어 사용 합니다.

2입니다. 하위 미토 콘 드리 아 입자의 준비

  1. 침투성 세포25 에서 1 x 1011 procyclic T. brucei 얼음 버퍼 A. 유지 샘플 단계 3.2까지 냉장의 5 ml의 2 x 1011 셀에 의해 고립 된 미토 콘 드리 아 소포 (mitoplasts) resuspend
  2. Bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과26 제조업체의 지침에 따라에 의해 정지에 단백질 농도 결정 합니다.
    1. 초순에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 희석 시리즈를 사용 하 여 표준 곡선을 건설 하기 위하여. 적은 양의 샘플 BSA의 범위는 표준에 맞게 초순 물으로 20-100 배 희석.
    2. 샘플에서 총 단백질 양을 계산 하 고 추가 버퍼 A. 그것을 diluting 하 여 16 mg/ml 단백질 농도가지고
  3. 서 스 펜 션 7의 쥡니다 여 mitoplasts 거꾸로 소포 막 조각으로 조각 15 x 3.9 m m의 직경을 가진 70 ~ 100 J는 microtip와 충 동 당의 총 에너지와 s. 초음파 균질 화기는 에너지 출력을 표시 하지 않으면, 최대 전력의 50%에서 최적화를 시작 합니다. 30 대 한 얼음 샘플을 품 어 충 동 사이 s. 쥡니다, 후 정지가 된다 약간 어두운.
  4. 토사는 막 ultracentrifugation 54000 x g 16 h 또는 98000 x g 5 h 4 ° c.에 의해 조각 가만히 따르다는 상쾌한 클로 프롬 추출 진행 또는 플래시 동결 액체 질소에는 토사와-80 ° c.에 그것을 저장합니다

3. F1의 릴리스-클로 프롬에 의해 막에서 ATPase

  1. 작은 Dounce 균질 화기의 도움으로 버퍼 B에에서 미토 콘 드리 아 막의 펠 릿을 resuspend. 버퍼 B의 볼륨에 따라 총 버퍼의 사용 단계 2.1과 2.2를 사용 하 여 다음 수식에서 계산: 볼륨 (버퍼 B) = 볼륨 (버퍼 A) x 12/21. 15 또는 50 mL 원뿔 튜브에 정지를 전송.
  2. 얼음에서 샘플을 제거 하 고, 지금부터, 샘플 및 실 온에서 사용 될 모든 솔루션을 유지.
  3. 클로 프롬 2 M Tris HCl ph 8.5; 포화를 추가합니다 클로 프롬을 추가할 수의 현 탁 액의 절반 볼륨을 같습니다. 단단히 뚜껑을 닫습니다. 흔들어 적극적으로 정확히 20 s. 8400 x g 실 온에서 5 분에서 그것을 즉시 원심.
  4. 1.6 mL microtubes 이동 상단 흐린 수성 단계. 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A) 클로 프롬 치료에 의해 제거 억제제를 대체를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 13000 x g 에서 샘플 원심 신선한 microtubes는 상쾌한 전송 하 고 모든 불용 성 재료를 제거 하는 원심 분리를 반복 합니다.

4. 음이온 교환 크로마토그래피

  1. Equilibrate 280에서 흡 광도까지 5 mL/min의 유량에 Q 열 버퍼와 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 부착 된 5 mL 음이온 교환 (Q) 열 전도도 및 안정화 (버퍼의 약 50 mL).
  2. 280에서 흡수도 될 때까지 대기를 1 mL/분의 유량에 equilibrated 열에 3.3 단계에서는 상쾌한 로드 nm 안정화는 배경에서. 0.5 mL/분 수집 1 mL 분수의 흐름 속도에서 100 %0 %에서 Q-열 차입 버퍼의 25 mL 선형 그라데이션이 적용 됩니다.
  3. PH 8.0에 풀 먼 ATPase 분석 결과2 ATP 가수분해 활동에 대 한 주요 차입 피크에 해당 하는 개별 분수 시험 반응 혼합물의 1 mL 당 각 분수의 10 µ L을 사용 합니다. ATPase 활동 하는 분수를 풀. 선택적으로, 나트륨 라우릴 인산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE)에 각 분수의 10 µ L 고 Coomassie 파란 개별 F1을 시각화 하 여 젤 얼룩-ATPase 소 단위 및 오염 단백질.
  4. 막 한 200-500 µ L. 100000 MWCO PES 필터 스핀 열을 사용 하 여 풀링된 샘플 초 또는 게 실 온에서 하룻밤 샘플 진행 하는 집중.

5. 크기 배제 크로마토그래피

  1. SEC 열 0.5 mL/min의 유량에 SEC 버퍼의 적어도 48 mL (2 개의 열 볼륨)와 액체 크로마토그래피 시스템에 연결 된 equilibrate
  2. 열에 샘플을 적용 하 고 수집 0.25-mL 분수 0.25 mL/분의 유량에서 크로마토그래피를 실행 합니다.
  3. SDS 페이지에 UV280nm 흡수도 추적의 봉우리에 해당 하 고 Coomassie 블루 얼룩 분수의 10 µ L를 실행 합니다. F1을 포함 하는 첫 번째 주요 피크-ATPase. 풀 먼 ATPase 분석 결과 의해 ATP 가수분해 활동 및 아 지 드 감도 대 한이 피크에 해당 하는 분수 시험 BCA 분석 결과 의해 단백질 농도 결정 합니다.
  4. 순화 된 F1유지-실내 온도에 ATPase 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 정화 후 3 일 이내 사용 하 고. 또는 100000 MWCO PES 필터 > 1.5 mg/ml, 촉진 그것 포화 황산 암모늄을 혼합 하 여 pH 8.0 (볼륨 x 1.2), 조정 회전 열을 사용 하 여 샘플을 집중 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

일반적인 정화 (그림 1) T. brucei25 표준에서 양식 2 x 1011 procyclic hypotonically lysed 1 x 1011 Percoll 그라데이션에 고립 된 미토 콘 드 리아 소포 (mitoplasts)로 시작 포도 당-풍부한 SDM-79 중27. mitoplasts 쥡니다, 돌 다에 의해 조각화 되 고 포함 하는 매트릭스 상쾌한 삭제 됩니다. 미토 콘 드리 아 막 클로 프롬 F1을 출시와 함께 처리 됩니다-ATPase. 원심, 후 유기 단계 및 침전 된 interphase는 삭제 됩니다. 수성 단계는 분류 한 4 급 암모늄, 강한 음이온 교환기 (그림 2A)에 이온-교환 크로마토그래피에 의해. 주요 차입에 해당 하는 분수 피크 하 고 F1을 포함-ATPase 풀링된 및 집중. 이 자료는 잔류 불순물을 제거 하는 초에 대 한 입력으로 제공 합니다. 주요 오염 물질은 분리 된 피크, 그림 2B에서 어두운 녹색 막대로 표시로 SEC 열에서 elutes dihydrolipoyl 효소 이다. F1-첫 번째 지배, 크게 대칭 피크 (그림 2B)에 ATPase elutes.

정화의 진행 BCA 단백질 분석 결과 (또는 다른 일반적인 단백질 분석 결과), 다음은 SDS 페이지, 그리고 ATPase 활동의 감시. 분석 결과2, 결합 된 반응에서 NADH의 흡 광도의 감소에 따라 재생 풀 먼 ATP ATP 가수분해의 속도 측정 됩니다. 나트륨 아 지 드, F1의 설립된 억제제-ATPase, F1의 비율을 결정 하는 2 m m 농도에서 사용 됩니다-ATPase-특정 ATP 가수분해. 일반적으로, 입력된 자료에는 미토 콘 드 리아 vesicles의 원본으로 사용 하는 셀의 수에 따라 미토 콘 드리 아 단백질의 약 150-300 밀리 그램 포함 되어 있습니다. 아 지 드-민감한 비율 총 ATPase 활동의이 단계에서 약 30% ~ 40%입니다. 클로 프롬 적 출 후 샘플에 ATPase 활동의 90% 이상이 F1에 기여-ATPase. 순화 된 F1-ATPase는 거의 완전히 아 지 드 치료 (는 최소 잔여 ATPase 활동 배경 ATP autolysis에 기 인할 수 있다)와 약 1의 대략적인 수율 입력된 단백질 질량의 1%를 나타냅니다- F1의 1.5 m g-1 x 1011 셀 (표 1) 당 ATPase. 순화 된 F1의 분리 후 전형적인 밴드 패턴-SDS 페이지 젤 Coomassie 파란 얼룩 뒤에 ATPase 그림 2C에 표시 됩니다. 단백질은 펩 티 드 질량 지문 및 다양 한 질량 분석 접근23자세히 특징에 의해 확인 되었다. Β 소 단위 밴드 위에 보이는 산발적 약한 밴드 α3β3 투구 (이합체 및 올리고의 α-및 β-소 단위)의 subcomplexes를 대표 하 고 어떤 오염 물질의 중요 한 질량 분석 기술에 의하여 발견할 수 없다. 순화 된 F1-ATPase 저장할 수 있습니다 실 온에서 초 버퍼에 몇 일. 또는, F1-ATPase ≥2 mg/ml 농도 ph 8.0으로 조정 하 고 4 ° c.에 저장 된 초 버퍼에서 포화 황산 암모늄의 동일한 볼륨에 의해 침전 수 강 수 후 6 개월 이상, 어떤 소 단위의 분명 한 저하 없이 활성 효소 redissolving 초 버퍼 또는 유사한 솔루션에 침전 된 물질에 의해 얻어질 수 있다. 그러나, 한 달 이상 저장이 아니다 적합 결정 화, 실험적으로 결정.

Figure 1
그림 1 : 정화 절차의 계획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 클로 프롬 발표 F1의 2 단계 정화-액체 크로마토그래피에 의해 ATPase. (A) 음이온 교환 크로마토그래피 (위 패널)와 선택 된 분수의 차입 프로필 Coomassie 파란 염료 (하단 패널)로 얼룩진 10%-20% 트리 스-글리신 SDS 페이지 젤에서 분리. 추적 블루: 280에서 UV 흡 광도 nm; 붉은 추적: 차입 버퍼;에 NaCl의 농도 입력: F1-클로 프롬; 발표 ATPase FT: 흐름-통해. (B) 초 (위 패널)와 선택 된 분수의 차입 프로필 Coomassie 파란 염료 (하단 패널)로 얼룩진 SDS 페이지 젤에서 분리. 입력: 풀링된 F1을 포함 하는 음이온 교환 크로마토그래피에서 분수-ATPase. 패널 AB 에서 색상된 막대 SDS-PAGE로 분석 된 차입 프로필에 분수와 각각 젤에 해당 레인을 표시 합니다. 격리 된 F1의 개별 단백질의 (C) 정체성-ATPase 질량 분석에 의해 확인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

단백질 농도 (mg/mL) 총 단백질 (mg) 입력된 자료 (%)의 비율 활동
(밀리 그램-1-1x x μmolATP )
아 지 드 감도 (%)
버퍼 A에에서 미토 콘 드리 아 소포 16.2 170 100 1.3 25-35
버퍼 B에에서 미토 콘 드리 아 막 18.6 97 57 2.4 35-45
클로 프롬 추출 분수 2.5 7.9 4.7 12 91-95
F1-Q-열 후 ATPase - 2.2 1.3 23 92-96
F1-ATPase 젤 여과 후 - 1.6 0.93 48 93-98

표 1: 전형적인 진보와 F1의 항복의 예-1 x 1011 procyclic T. brucei 세포에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서 ATPase 정화.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

F1에 대 한 프로토콜-ATPase 정화 T. brucei 에서 개발한 F1의 분리에 따라 이전에 게시 방법-ATPase 단지 다른 종13,14에서. 메서드에 유전 수정 필요 하지 않습니다 (예를 들어, 태그) 하 고 현재 모든 소 단위와 완전히 활성화 단지 생성. 중요 한 단계는 F1의 클로 프롬 촉진 릴리스-ATPase 효소의 막 연결 부분에서. 지금까지 설명 된 모든 진 핵 종에서 purifications, 출시 subcomplex subunits α, β, γ, δ, 및 3:3:1:1:1의 산출할에서 ε 포함 되어 있습니다. T. brucei, F1에서-ATPase 소 단위 p18, euglenozoan 원생23제한 소설 구성의 3 개의 복사본을 추가로 포함 되어 있습니다. 또한, euglenozoan α 소 단위 proteolytically 모두 복잡 한24,,2829와 안정적으로 연결 된 두 개의 조각으로 분할 됩니다. OSCP (oligomycin 감도 부여 하는 단백질), F1을 연결 하는 소 단위-주변 줄기30moiety는 결 석 F1와 복잡 한 발표에서-클로 프롬에 의해 ATPase 담긴 다른 종13,14에서 추출.

클로 프롬 발표 F1-ATPase는 액체 크로마토그래피에 의해 순화 추가. 소 F1의 경우-ATPase, 하나만 크로마토그래피 단계, 크기 배제 크로마토그래피, 매우 순수 하 고 활성 복잡 한31를 충분. 그러나, 단일 초 설정 T. brucei F1의 정화에 대 한 충분 한 아니었다-ATPase, F1에 대 한 농축 분수로-ATPase 포함 추가 단백질 오염 물질, 주로 델타-1-pyrroline-5-카복실산 효소입니다. 따라서, 음이온 교환 크로마토그래피 첫번째와 주요 정화 단계 초 전에 소개 되 고 SEC 후속 연마 절차로 제공. 결정 화 실험, Superdex 200 증가 열 사용 입증 필수, 좋은 품질의 결정을 성장 하는 허용 되는 자료를 제공 하는이 칼럼 이후. 그것은 열의 해상도 결정을 방해 하는 불완전 한 단지의 작은 비율의 분리를 사용할 수 있습니다. 그러나, 결정 화 이외의 응용 프로그램, Superdex 200 열을 사용 하 여 분리 동등 하 게 만족 했다.

F1을 보호 하기 위해-ATPase lysate, 초기 버퍼 A와 B protease 억제제의 넓은 범위에 포함 된 알 수 없는 protease(s)는 미토 콘 드리 아에 의해 부분 베이스에서 복잡 한. F1의 베이스에 개별 억제제의 영향-ATPase subunits 테스트 되지 않았습니다 이며, 대부분, 존재는 억제제 들의 중복. 초 단계에 대 한 억제제는 추가 되지 않습니다 더 이상 오염 프로 테아 제 F1에서 제거 됩니다-클로 프롬 추출 또는 첫 번째 크로마토그래피 단계 ATPase 샘플.

다단계 프로토콜 필연적 F1의 부분 손실-ATPase. 가장 중요 한 손실 (25%-45%의 총 금액) 음이온 교환 크로마토그래피 후 스핀 열에 의해 멤브레인 적용 농도 단계 동안 발생합니다. F1-스핀 열의 막에 ATPase 가능성이 준수. 따라서, 매우 순수 하 고 집중 샘플 (예를 들어, 효소 분석 실험 및 금지 화면), F1을 요구 하지 않는 일부 다운스트림 응용 프로그램에 대 한-ATPase 음이온 교환 크로마토그래피 ( 그림 참조 후 즉시 사용할 수 있습니다 2B, 입력 레인).

하지만 F1의 정화-ATPase 다른 유기 체에서 세부 사항에 따라, 일반적인 워크플로 동일에 남아 있다. 따라서,이 프로토콜 F1의 개발에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다-다른 풍부한 소스, 조직 또는 세포 대규모 경작 같은 ATPase 격리 프로토콜.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 교육 ERC CZ의 내각에 의해 투자 되었다 LL1205, 체코 공화국의 부여 기관 보조금 18-17529S, 부여 그리고 ERDF/ESF에 의해 프로젝트 pathogenicity의 기생충 (No.의 독성 연구를 위한 센터 CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759)입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
  2. Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
  3. Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2552-2560 (1967).
  4. Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2547-2551 (1967).
  5. Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140, (1), 257-266 (1970).
  6. Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246, (23), 7328-7336 (1971).
  7. Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148, (3), 533-537 (1975).
  8. Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178, (2), 289-297 (1979).
  9. Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2, (10), 1783-1789 (1983).
  10. Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225, (3), 821-824 (1985).
  11. Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142, (3), 768-776 (1980).
  12. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370, (6491), 621-628 (1994).
  13. Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229, (3), 787-790 (1993).
  14. Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25, (22), 5433-5442 (2006).
  15. Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282, (15), 2895-2913 (2015).
  16. Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152, (2), 140-145 (2005).
  17. Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (39), 10860-10865 (2016).
  18. Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65, (1), 103-109 (1980).
  19. Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43, (1), 125-132 (1990).
  20. Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3, (6), 357-367 (1981).
  21. Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184, (4), 677-701 (1985).
  22. Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37, (2), 479-485 (2004).
  23. Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285, (3), 614-628 (2018).
  24. Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (9), 2102-2107 (2018).
  25. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, (1), 76-85 (1985).
  27. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99, (1), 89-101 (1999).
  28. Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85, (2), 171-186 (1997).
  29. Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135, (2), 221-224 (2004).
  30. Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368, (2), 310-318 (2007).
  31. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282, (19), 14238-14242 (2007).
F<sub>1</sub>의 절연-ATPase 기생 원생 생물 <em>Trypanosoma brucei</em> 에서
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).More

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter