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Biochemistry

Isolamento de F1-ATPase do Protista parasita Trypanosoma brucei

doi: 10.3791/58334 Published: January 22, 2019

Summary

Este protocolo descreve a purificação de F1-ATPase do palco inseto cultivado de Trypanosoma brucei. O procedimento produz um complexo altamente puro, homogêneo e ativo adequado para estudos estruturais e enzimáticos.

Abstract

F1-ATPase é uma membrana-extrínseco subcomplex catalítico de F-tipo ATP sintase, uma enzima que utiliza a força motriz protónica através das membranas biológicas para produzir adenosina trifosfato (ATP). O isolamento do intacta F1-ATPase da sua nascente nativo é um pré-requisito essencial para caracterizar a enzima composição de proteína, parâmetros cinéticos e sensibilidade aos inibidores. Um altamente pura e homogênea F1-ATPase pode ser usada para estudos estruturais, que fornecem a introspecção do mecanismo molecular da síntese de ATP e hidrólise. Este artigo descreve um procedimento para a purificação do F1-ATPase de Trypanosoma brucei, o agente causador da trypanosomiases africanos. A F-1-ATPase é isolada de vesículas mitocondriais, que são obtidas por lise hipotónica de tripanosomas em vitro cultivadas. As vesículas são mecanicamente fragmentadas por sonication e o F1-ATPase é liberada a partir da membrana mitocondrial interna pela extração de clorofórmio. O complexo enzimático é mais purificado por aniões consecutivos e cromatografia de exclusão de tamanho. Técnicas de espectrometria de massa sensível mostraram que o complexo purificado é desprovido de praticamente qualquer contaminantes de proteína e, portanto, representa o material adequado para a determinação de estrutura por cristalografia de raios x ou microscopia cryo-elétron. O isolado F1-ATPase apresenta atividade hidrolítica de ATP, que pode ser totalmente inibida por azida sódica, um inibidor potente do F-tipo ATP sintases. O complexo purificado permanece estável e ativo pelo menos três dias à temperatura ambiente. Precipitação de sulfato de amônio é usada para o armazenamento a longo prazo. Procedimentos semelhantes têm sido utilizados para a purificação de F1- ATPase de tecidos de mamíferos e vegetais, leveduras ou bactérias. Assim, o protocolo apresentado pode servir como uma diretriz para a F-1-isolamento de ATPase de outros organismos.

Introduction

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Os F-tipo ATP sintases estão ligados a membrana rotativa complexos Multiproteicos translocação de prótons que casal entre energia-transducing membranas de cloroplastos, mitocôndrias e bactérias com a formação de ATP. Detalhes moleculares do mecanismo rotacional da síntese de ATP são conhecidos principalmente por causa de estudos estruturais de purificado bacteriana e mitochondrial ATP sintases e seus subcomplexes1. F-tipo ATP sintase está organizado em partes da membrana-intrínsecos e extrínsecos-membrana. A parte da membrana-extrínseco, conhecida como F1-ATPase, contém três sites catalíticos, onde ocorre a fosforilação de difosfato de adenosina (ADP) para ATP ou a reação inversa. F1-ATPase pode ser libertada experimentalmente o moiety intrínsecas da membrana mantendo sua capacidade de hidrolisar, mas não sintetizar, ATP. O setor de membrana-limite, chamado Fó, Medeia a translocação da proteína, que leva a rotação da parte central da enzima. Os setores deó de F e F1 são conectados pelos talos centrais e periféricos.

O primeiro tenta purificar o F1-ATPase do fermento de brotamento e coração bovinos mitocôndrias data voltar à década de 1960. Estes protocolos usados extraído de mitocôndrias, que foram interrompidas pelo sonication, fracionado por precipitação de sulfato de amônio ou protamina, seguida da execução opcional cromatografia e tratamento térmico2,3,4 ,5,6. A purificação foi grandemente melhorada e simplificada pelo uso de clorofórmio, que prontamente libera o F1-ATPase da membrana mitocondrial fragmentos7. A extração de clorofórmio foi então usada para extrair F1- ATPase de vários animal, vegetal e bacterianas fontes (por exemplo, fígado de ratos8, milho9, Arum maculatum10e Escherichia coli 11). Mais purificação do clorofórmio-lançado F1-ATPase por cromatografia de afinidade ou tamanho-exclusão (SEC) rendeu uma proteína altamente pura complexa, que era adequada para a determinação da estrutura de alta resolução por cristalografia de raios x, como documentado pelas estruturas de F1-ATPase de coração bovino12,13 e Saccharomyces cerevisiae14. F1-estruturas de ATPase determinaram-se também de organismos que são difíceis de cultivar e, assim, a quantidade de matéria biológica inicial foi limitada. Neste caso, a F-1-subunidades ATPase foram artificialmente expressa e montados para o complexo em e. coli, e a enzima heteróloga toda foi purificada por afinidade cromatografia através de uma subunidade marcada. Tal abordagem levou à determinação de F1-estruturas de ATPase de duas espécies de bactérias termofílicas, Geobacillus stearothermophilus15 e Caldalkalibacillus thermarum16, 17. no entanto, esta metodologia é bastante inadequada para eucariontes F1- ATPase desde que baseia-se no aparelho protheosynthetic procarióticas, processamento pós-traducional e montagem complexa.

A extração baseado em clorofórmio foi usada anteriormente para isolar F1- ATPase de digenetic unicelulares parasitas Trypanosoma cruzi18 e T. brucei19, importantes patógenos mamíferos causando americano e Trypanosomiases africanos, respectivamente e de monogénicas inseto parasita Crithidia fasciculata20. Estas purificações levaram apenas para uma simples descrição do F1- ATPase, desde que não há aplicações a jusante foram usadas para caracterizar plenamente a composição, estrutura e propriedades enzimáticas do complexo. Este artigo descreve um método otimizado para F1-purificação ATPase desde a fase do ciclo de vida de inseto culta de T. brucei. O método é desenvolvido com base em protocolos estabelecidos para isolamento de bovinos e levedura F1- ATPase21,22. O procedimento produz altamente pura e homogênea enzima apropriada para em vitro enzimática e inibitórios ensaios, caracterização detalhada proteomic por espectrometria de massa23e de determinação de estrutura24. O protocolo de purificação e o conhecimento da F1-estrutura ATPase do nível atômico abre uma possibilidade para a concepção de telas para identificar inibidores da pequeno-molécula e ajuda no desenvolvimento de novas drogas contra trypanosomiases africanos. Além disso, o protocolo pode ser adaptado para purificar F1-ATPase de outros organismos.

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Protocol

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1. buffers e soluções

  1. Prepare as soluções listadas abaixo. Desgaseifica todos os buffers para cromatografia líquida. Adicione inibidores da protease, Benzamidina e ADP imediatamente antes da utilização.
    1. Prepare o tampão de tampão a: 50 mM Tris com ácido clorídrico (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M de sacarose, Benzamidina de 5 mM, 5 mM aminocaproico ácido (ACA) e protease inibidores (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A).
    2. Prepare o tampão b: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M de sacarose, ácido de 4mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), Benzamidina 5 mM, 5 mM ACA, 1mm ADP e ao inibidores de protease (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A).
    3. Preparar o tampão de Q-coluna: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM de EDTA, 10 mM de MgSO4, 5mm benzamidina, 5mm ACA e 1 mM ADP.
    4. Preparar o tampão de eluição de Q-coluna: buffer de Q-coluna com 1 M de NaCl.
    5. Preparar o tampão do SEC: pH 20 mM Tris-HCl 8.0, 10 mM de MgSO4, 100 mM de NaCl, 1 mM ADP.
    6. Prepare o clorofórmio saturado com 2 M Tris-HCl pH 8,5. Misture o clorofórmio com 2 M Tris-HCl pH 8,5 em aproximadamente a proporção 1:1 em um frasco de tampa de rosca, agitar, deixar as fases orgânicas e aquosas separadas e medir o pH na camada aquosa superior com uma tira de papel indicador de pH. Armazenar em temperatura ambiente. Imediatamente antes da utilização, agitar novamente e deixe as fases separadas. Use a camada inferior de clorofórmio.
      Cuidado: Clorofórmio é volátil e irritante para os olhos e pele. Trabalho em uma coifa. Use óculos de segurança quando a tremer.

2. preparação de partículas submitocondrial

  1. Resuspenda vesículas mitocondriais (mitoplasts) isoladas por lise hipotónica25 de 1 x 1011 a 2 x 1011 células de procyclic T. brucei em 5 mL de tampão gelada r. manter a amostra refrigerada até o passo 3.2.
  2. Determine a concentração de proteína na suspensão pelo bicinchoninic ácido (BCA) proteína ensaio26 de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Use uma série de diluições de albumina de soro bovino (BSA) em água ultrapura para construir a curva padrão. Dilua uma pequena quantidade de amostra 20 - 100 vezes com água ultrapura para encaixar nos padrões da gama de BSA.
    2. Calcular a quantidade de proteína total na amostra e trazer a concentração de proteína de 16 mg/mL, diluindo-lo com buffer adicionais A.
  3. Fragmentar mitoplasts em vesículas invertidas e pedaços de membrana por sonication da suspensão 7 x 15 s com uma energia total de 70 a 100 J por impulso com um microtip de 3,9 mm de diâmetro. Se o homogenizador Ultrassônico não exibir a saída de energia, comece a otimização em 50% da potência máxima. Incubar a amostra em gelo por 30 s entre impulsos. Após o sonication, a suspensão torna-se um pouco mais escura.
  4. Fragmentos de sedimentos da membrana por ultracentrifugação a 54.000 x g, durante 16 h ou a 98.000 x g, durante 5 h a 4 ° C. Decante o sobrenadante e prosseguir com a extração de clorofórmio, ou congelam o sedimento em nitrogênio líquido e armazená-lo a-80 ° C.

3. liberação de F1-ATPase de membrana por clorofórmio

  1. Resuspenda o pellet de membranas mitocondriais em buffer B com o auxílio de um pequena homogenizacao homogenizador. Calcular o volume de tampão B com base no montante total do buffer de um usado na fórmula de passos 2.1 e 2.2, usando o seguinte: volume (tampão B) = volume (tampão A) x 12/21. Transferi a suspensão para um tubo cônico de 15 ou 50 mL.
  2. Retire a amostra de gelo e, de agora em diante, manter a amostra e todas as soluções para ser usado em temperatura ambiente.
  3. Adicionar clorofórmio saturado com 2 M Tris-HCl pH 8,5; o volume de clorofórmio a ser adicionado é igual a metade do volume da suspensão. Feche a tampa firmemente. Agitá-lo vigorosamente para exatamente 20 s. centrifugá-lo imediatamente a 8.400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
  4. Transferi a fase aquosa superior nublada para microtubos de 1,6 mL. Adicione inibidores de protease (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A) para substituir os inibidores removidos pelo tratamento clorofórmio. Centrifugar as amostras a 13.000 x g durante 30 min à temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante para microtubos frescos e repetir a centrifugação para remover qualquer material insolúvel.

4. permutadora cromatografia

  1. Equilibrar a coluna de troca (Q) 5 mL ânion conectada a um sistema de cromatografia líquida de rápido-proteína com o buffer Q-coluna a uma taxa de fluxo de 5 mL/min até a absorbância em 280 nm e a condutividade estabilizar (aproximadamente 50 mL de tampão).
  2. Carregar o sobrenadante da etapa 3.3 na coluna equilibrada em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. espere até a absorbância em 280 nm estabiliza em segundo plano. Aplica um gradiente linear de 25 mL do buffer Q-coluna eluição de 0% a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. coletar frações de 1 mL.
  3. Ensaio as frações individuais correspondente ao pico de eluição principais para a atividade hidrolítica de ATP pelo ensaio Pullman ATPase2 em pH 8.0. Use 10 µ l de cada fração por 1 mL da mistura de reação. As frações que apresentam atividade ATPase do pool. Opcionalmente, separe 10 µ l de cada fração em eletroforese em gel de poliacrilamida fosfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE) e manchar o gel por Coomassie Blue Visualizar individual F1-subunidades ATPase e proteínas contaminantes.
  4. Concentre-se as amostras por ultrafiltração de membrana com uma coluna de rotação com um filtro de PES MWCO 100.000 de 200-500 µ l. proceder à SEC ou loja da amostra durante a noite em temperatura ambiente.

5. tamanho-exclusão cromatografia

  1. Equilibrar a coluna SEC conectada a um sistema de cromatografia líquida pelo menos 48 mL (dois volumes de coluna) do buffer SEC com um caudal de 0,5 mL/min.
  2. Aplique a amostra na coluna e executar cromatografia com um caudal de 0,25 mL/min. coletamos frações de 0,25 mL.
  3. Execute 10 µ l das frações que correspondem aos picos do rastreamento absorvância UV280nm em SDS-PAGE e manchá-las por Coomassie Blue. O primeiro pico principal contém o F1-ATPase. Ensaio as frações correspondentes a este pico para o ATP hidrolítica atividade e azida sensibilidade por ensaio de Pullman ATPase. Determine a concentração de proteína, o ensaio BCA.
  4. Manter o purificada F1-ATPase em temperatura ambiente e usá-lo dentro d 3 após a purificação para aplicações a jusante. Como alternativa, concentrar a amostra com uma coluna de rotação com um filtro de PES MWCO 100.000 > 1,5 mg / ml, precipitado, misturando-o com sulfato de amônio saturado ajustou a pH 8.0 (1.2 x volume) e armazená-lo em 4 ° C.

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Representative Results

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Uma purificação típica (Figura 1) começa com vesículas mitocondriais (mitoplasts) isoladas do gradiente de Percoll de hypotonically lisados 1 x 1011 para 2 x 1011 procyclic T. brucei células25 cultivadas no padrão rico em glicose SDM-79 médio27. Os mitoplasts são fragmentados por sonication, fiado, e o matriz contendo sobrenadante é Descartado. As membranas mitocondriais são tratadas com clorofórmio para liberar o F1-ATPase. Após a centrifugação, a fase orgânica e precipitado interfase são descartadas. A fase aquosa é fracionada por cromatografia de troca iônica em quaternário de amônio, um trocador de ânion forte (Figura 2A). As frações que correspondem a eluição maior pico e conter o F1-ATPase são agrupados e concentrada. Este material serve como a entrada para a SEC, que elimina as impurezas residuais. O principal contaminante é dihydrolipoyl desidrogenase, que elutes da coluna SEC como um pico discreto, marcado pela barra verde escura na Figura 2B. A F-1-ATPase elutes no primeiro pico dominante, em grande parte simétrico (Figura 2B).

O progresso da purificação é seguido o ensaio da proteína BCA (ou outro ensaio comum de proteína), SDS-PAGE e o acompanhamento da atividade ATPásica. A taxa de hidrólise de ATP é medida pelo ATP de Pullman regenerando ensaio2, baseada o decréscimo de absorbância do NADH na reação de acoplamento. Azida sódica, um inibidor estabelecido de F1-ATPase, é usado em uma concentração de 2 mM para determinar a proporção do F1-ATPase-específico hidrólise de ATP. Normalmente, o material de entrada contém cerca de 150-300 mg de proteína mitocondrial, dependendo do número de células utilizadas como fonte de vesículas mitocondriais. A proporção de azida sensíveis da atividade ATPásica total é cerca de 30% a 40% nesta fase. Após a extração de clorofórmio, mais de 90% da atividade da ATPase na amostra contribuiu para a F-1-ATPase. A purificada F1- ATPase é virtualmente completamente sensível para o tratamento de azida sódica (a ATPase residual mínima atividade pode ser atribuída à autólise fundo ATP) e representa cerca de 1% da massa entrada, com um rendimento aproximado de 1 - 1,5 mg de F-1-ATPase por 1 x 1011 células (tabela 1). Um padrão típico de banda após a separação do purificada F1-ATPase em gel de SDS-PAGE seguido de coloração de azul de Coomassie é mostrado na Figura 2. As proteínas foram identificadas pela massa do peptide recolha de impressões digitais e caracterizado em detalhe por várias abordagens de espectrometria de massa23. Esporádicas fracas bandas visíveis acima da faixa de subunidade beta representam subcomplexes do α3β3 capacete (dímeros e oligómeros de subunidades α e β) e são desprovidas de quaisquer contaminantes detectáveis por técnicas de espectrometria de massa sensível. A purificada F1-ATPase pode ser armazenada por até vários dias no buffer SEC à temperatura ambiente. Alternativamente, o F1-ATPase concentrado para ≥2 mg/mL pode ser precipitado por um volume igual de sulfato de amônio saturado no buffer SEC, com pH ajustado para 8,0 e armazenado a 4 ° C. Pelo menos seis meses após a precipitação, a enzima activa com nenhuma degradação óbvia de qualquer subunidade pode ser obtida por redissolving o material precipitado no SEC buffer ou solução semelhante. No entanto, mais de um mês de armazenamento não é adequado para cristalização, conforme determinado empiricamente.

Figure 1
Figura 1 : Esquema do processo de purificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Purificação de duas etapas do clorofórmio-lançado F1-ATPase por cromatografia líquida de. (A) perfil de eluição da cromatografia de troca aniónica (painel superior) e selecionadas frações separadas sobre o gel de SDS-PAGE de Tris-glicina 10% - 20% corado com o corante azul de Coomassie (painel inferior). Azul de rastreamento: absorção UV em 280 nm; traço vermelho: concentração de NaCl no buffer de eluição; Entrada: a F1-ATPase lançado pelo clorofórmio; FT: de passagem. (B) perfil de eluição da SEC (painel superior) e selecionadas frações separadas sobre o gel de SDS-PAGE, corado com tintura de azul de Coomassie (painel inferior). Entrada: pool frações da cromatografia de troca aniónica contendo F1-ATPase. As barras de código de cores em painéis A e B marcam as frações nos perfis de eluição que foram analisadas por SDS-PAGE e as vias correspondentes no gel respectivo. (C) as identidades das proteínas individuais do isolado F1-ATPase identificados por espectrometria de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Concentração de proteínas (mg/mL) Proteína total (mg) Proporção de material de entrada (%) Atividade
(ΜmolATP x mg-1 x min-1)
Sensibilidade de azida sódica (%)
Mitocondriais vesículas em tampão A 16.2 170 100 1.3 25-35
Membranas mitocondriais no buffer B 18,6 97 57 2.4 35-45
Fracções de clorofórmio extraído 2.5 7,9 4.7 12 91-95
F1-ATPase depois Q-coluna - 2.2 1.3 23 92-96
F1-ATPase após filtração de gel - 1.6 0.93 48 93-98

Tabela 1: Exemplo do progresso típico e rendimento do F1-purificação da ATPase de mitocôndrias isoladas de 1 x 1011 procyclic pilhas de T. brucei .

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Discussion

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O protocolo para F1-purificação da ATPase de T. brucei foi desenvolvido com base em métodos publicados anteriormente para o isolamento de F1-complexos de ATPase de outras espécies de13,14. O método não requer qualquer modificação genética (por exemplo, marcação) e produz um complexo totalmente ativo com subunidades de todos os presentes. A etapa crucial é o lançamento de clorofórmio-facilitada do F1-ATPase da membrana-anexado parte da enzima. Em purificações de todas as espécies eucarióticas descritas até agora, o subcomplex lançado contido subunidades α, β, γ, δ e ε em uma estequiometria da 3:3:1:1:1. Em T. brucei, o F-1-ATPase contém um adicional de três cópias da subunidade p18, um romance componente restrito a euglenozoan protistas23. Além disso, o euglenozoan α-subunit proteoliticamente é dividido em dois fragmentos, ambos estàvel associada com o complexo24,28,29. A subunidade OSCP (oligomicina-sensibilidade-conferindo proteína), que liga o F1-agrupamento para o talo periférica30, está ausente do complexo lançado, que está de acordo com a F-1-purificações ATPase pelo clorofórmio extração de outras espécies de13,14.

O clorofórmio-lançado F1-ATPase é mais purificada por cromatografia líquida. No caso de bovinos F1-ATPase, apenas uma cromatografia, cromatografia de exclusão de tamanho, é suficiente para obter um complexo altamente puro e ativo31. No entanto, o único set-up SEC foi insuficiente para a purificação do T. brucei F1-ATPase, como as frações enriquecidas por F1-ATPase contidos contaminantes adicionais de proteína, principalmente delta-1-pyrroline-5-carboxilato desidrogenase. Portanto, cromatografia de troca aniónica foi introduzida antes da SEC, como o primeiro e grande passo purificante e a SEC serve como o processo de polimento subsequente. Para experimentos de cristalização, o uso da coluna Superdex 200 aumentar provou para ser essencial, desde que esta coluna fornecida material que permitiu o crescimento de cristais de boa qualidade. É provável que a resolução da coluna habilitado a separação de uma pequena proporção de complexos incompletas que interferiu com a cristalização. No entanto, para aplicativos que não sejam a cristalização, a separação usando a coluna de 200 Superdex foi igualmente satisfatória.

Para proteger o F1-ATPase complexo de proteólise parcial pelo desconhecido protease(s) presente no mitocondrial lisado, buffers de inicial A e B continham uma vasta gama de inibidores de protease. O impacto dos inibidores individuais sobre a proteólise de F1-subunidades ATPase não foi testado e, provavelmente, a presença de alguns dos inibidores é redundante. Para a etapa da SEC, os inibidores não são adicionados mais, como as proteases contaminantes são removidas do F1-amostra de ATPase a extração de clorofórmio ou a primeira análise cromatográfica.

O protocolo de várias etapas, inevitavelmente, leva a perdas parciais da F1-ATPase. A perda mais significativa (25% - 45% do montante total) ocorre durante a etapa de concentração por ultrafiltração de membrana em uma coluna de centrifugação após a cromatografia de troca aniónica. A F-1-ATPase provável adere à membrana da coluna de rotação. Assim, para algumas aplicações a jusante que não exigem uma altamente pura e concentrada amostra (por exemplo, ensaios enzimáticos e telas inibitórias), o F1-ATPase pode ser usada imediatamente após a cromatografia de troca aniónica (veja a figura de 2B, pista de entrada).

Embora a purificação de F1-ATPase de diferentes organismos varia em detalhes, o fluxo de trabalho geral permanece o mesmo. Portanto, este protocolo pode servir como uma diretriz para o desenvolvimento do F1-protocolo de isolamento ATPase de outras fontes abundantes, tais como tecidos ou células cultivável em grande escala.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Ministério da educação ERC CZ conceder LL1205, o grant Grant agência de República Checa 18-17529S e pelo FEDER/FSE projeto centro de investigação de patogenicidade e virulência de parasitas (n. º CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
  2. Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
  3. Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2552-2560 (1967).
  4. Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2547-2551 (1967).
  5. Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140, (1), 257-266 (1970).
  6. Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246, (23), 7328-7336 (1971).
  7. Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148, (3), 533-537 (1975).
  8. Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178, (2), 289-297 (1979).
  9. Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2, (10), 1783-1789 (1983).
  10. Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225, (3), 821-824 (1985).
  11. Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142, (3), 768-776 (1980).
  12. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370, (6491), 621-628 (1994).
  13. Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229, (3), 787-790 (1993).
  14. Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25, (22), 5433-5442 (2006).
  15. Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282, (15), 2895-2913 (2015).
  16. Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152, (2), 140-145 (2005).
  17. Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (39), 10860-10865 (2016).
  18. Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65, (1), 103-109 (1980).
  19. Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43, (1), 125-132 (1990).
  20. Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3, (6), 357-367 (1981).
  21. Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184, (4), 677-701 (1985).
  22. Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37, (2), 479-485 (2004).
  23. Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285, (3), 614-628 (2018).
  24. Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (9), 2102-2107 (2018).
  25. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, (1), 76-85 (1985).
  27. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99, (1), 89-101 (1999).
  28. Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85, (2), 171-186 (1997).
  29. Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135, (2), 221-224 (2004).
  30. Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368, (2), 310-318 (2007).
  31. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282, (19), 14238-14242 (2007).
Isolamento de F<sub>1</sub>-ATPase do Protista parasita <em>Trypanosoma brucei</em>
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Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).More

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

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