Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

C. elegans Germline timidin Analog EdU ile hücre döngüsü analizi

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/58339
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 2
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Summary

Bir görüntüleme tabanlı yöntemi anlatılan S fazlı tanımlamak ve timidin kullanarak C. elegans hermafrodit germline hücre döngüsü dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir analog EdU. Bu yöntem yok transgenes gerektirir ve immünfloresan boyama ile uyumludur.

Abstract

Ökaryotlarda hücre döngüsü analizi sık kromozom morfolojisi, ifade ve/veya hücre döngüsünün çeşitli aşamalarında veya nükleozit analogları ve eklenmesi için gereken gene ürünlerin yerelleştirme kullanır. S-aşamasında DNA polimerazlar timidin analogları EdU veya BrdU gibi kromozom DNA analizi için hücreleri işaretleme, dahil. C. elegans, nükleozit analog EdU için solucanlar sırasında düzenli kültür besleniyor ve immünfloresan teknikleri ile uyumludur. C. elegans germline, şeffaf, genetik olarak facile, çünkü bu ve segregasyonun profaz ve hücresel farklılaşma/gametogenesis ortaya çıkan yollar, kök hücre, mayoz ve hücre döngüsü sinyal bir güçlü modeli etütler sistemdir bir Doğrusal derleme gibi moda. Bu özellikler EdU mitotically Bisiklete binme hücreleri ve germline geliştirme dinamik özellikleri çalışma için harika bir araç olun. Bu iletişim kuralı başarıyla EdU bakteri hazırlamak, onları vahşi-türü için yem açıklar C. elegans Hünsa, hermafrodit erbezi incelemek, EdU birleşme için içine DNA, leke leke çeşitli hücre döngüsü algılamak için antikorlar ile ve gelişimsel işaretleri, erbezi görüntü ve sonuçları çözümleyebilirsiniz. Protokol yöntemi ve S-faz Dizin, M-faz Dizin, G2 süresi, hücre döngüsü süresi, segregasyonun giriş oranı ve segregasyonun profaz progresyon oranı ölçümü için analysis değişimler açıklar. Bu yöntem hücre döngüsü veya hücre tarihinin diğer dokulara, aşamaları, genetik arka planlar ve fizyolojik şartlarda çalışmaya adapte edilebilir.

Introduction

Hayvan gelişmede, yüzlerce, binlerce, milyonlarca, milyarlarca veya hatta trilyonlarca hücre bölünmeler yetişkin organizma oluşturmak için gereklidir. Hücre döngüsü, G1 hücresel olaylar kümesi oluşur (gap), S (sentez), G2 (gap) ve M (mitoz) tanımlayan bir dizi olaylar yürütülen her hücre bölünmesi. Hücre döngüsü dinamik ve teknik olarak zor olabilir gerçek zamanlı olarak en iyi takdir. Bu protokol için sunulan teknikleri aşamaları ölçümleri ve hareketsiz görüntüler üzerinden hücre döngüsünün zamanlama yapmak izin.

5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) veya 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) gibi nükleozit analogları ile etiketleme S-faz hücre döngüsü dynamics Caenorhabditis elegans (C. elegans) Yetişkin çalışmalarda tanımlamak için altın standart olduğunu hermafrodit germline1,2,3,4,5. Onlar herhangi bir genetik yapı üzerinde güvenmeyin gibi EdU ve BrdU neredeyse herhangi bir genetik arka planda kullanılabilir. BrdU görüntülenmesi için sık sık işbirliği ile ek antikor boyama tarafından görüntülenmiştir diğer hücresel işaretleri değerlendirilmesi ile uyumsuz olan anti-BrdU antikor boyama, antijen ortaya çıkarmak için sert kimyasal tedavi gerektirir. Buna karşılık, EdU görselleştirme hafif koşullar altında tıklayın Kimya tarafından oluşur ve böylece ortak6,7boyama antikor ile uyumludur.

Çekirdek sadece timidin (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) analogları DNA'ya S-aşamasında dahil beri etiket özgüllük açıktır. Görselleştirme sabit dokusunda yer alır. EdU etiket başına bir azid içeren boya kadar görünmez veya fluorophore kovalent bakır katalize tıklayın Kimya8tarafından EdU, alkin ile tepki verir. EdU etiketleme çekirdeği maddelerinin etiketlenmesi kısa bir darbe kullanarak S-aşamasında olduğunuz hemen bilgi sağlayabilir. EdU da nabız-chase veya sürekli etiketleme kullanarak dinamik bilgi sağlayabilir; Örneğin, bir darbe-chase deneyinde etiket her hücre bölünmesi seyreltilmiş veya olarak nondividing hücreleri ilerleme geliştirilmesi yoluyla yayılır.

C. elegans hermafrodit germline sinyal yolları, kök hücre, mayoz ve hücre döngüsü, bir güçlü modeli için çalışmalar sistemidir. Yetişkin germline ardından giriş ve ilerleme daha proksimale gametogenesis aşamaları ile koordine segregasyonun profaz, (Şekil 1) aracılığıyla distal uçta bulunan kök hücreleriyle polarize bir montaj hattı var. Proksimal sonunda yumurta Olgun, ovulated ve döllenmiş ve embriyo rahim9,10,11' deki yönergeleri başlayabilirsiniz. ~ 20 cep-çapı uzun bölge mitotically Bisiklete binme germline kök, progenitor hücreler ve segregasyonun S fazlı hücreleri ama hücreleri segregasyonun profaz içerir, distal ucu hücre yakınındaki progenitör bölge2,4 denir , 9 , 12. hücre zarlarında distal germline çekirdekler arasında eksik ayrılık sağlar, ancak yaratıcı bölgesi hücreleri Mitotik hücre büyük ölçüde bağımsız olarak Bisiklete binme tabi. Medyan Mitotik hücre döngüsü süresinin Genç Yetişkin Hünsa germline progenitör bölge hücrelerinin ~6.5 h olduğunu; G1 aşamasıdır kısa ya da yok, ve sendika değil1,2,13görülmektedir. Germline kök hücre farklılaşması ile aslında doğrudan farklılaşma oluşur ve böylece transit yükseltecek bölümler4yoksun. Sırasında farklılaşma pachytene aşamasında, yaklaşık 4 5 çekirdeği yumurta oluşturacak değil ama bunun yerine geçmesi apoptosis, sitoplazmik içeriklerini gelişmekte olan oosit12,14 bağışlayarak hemşire hücreler olarak hareket , 15.

Nükleozit analogları ile S-aşamasında etiketleme hücreleri ek olarak bir hücre mitoz ve mayoz antikor boyama kullanarak tanımlayabilirsiniz. Mitoz çekirdeği anti-Fosfo-histon H3 immunoreactive (Ser10) (pH3 denir) antikor7,16. Mayoz çekirdeği anti-onu-3 antikor (segregasyonun kromozom eksen protein)17' ye immunoreactive. Çekirdeklerin progenitör bölgedeki hım-3, nucleoplasmic REC-818varlığı veya WAPL-119varlığı yokluğunda tarafından tespit edilebilir. WAPL-1 yoğunluğu en yüksek somatik erbezi progenitör bölge'de, yüksek ve düşük sırasında erken segregasyonun prophases19yaşında. Protokol, bazı farklılıklar nedeniyle birkaç hücre döngüsü ölçümleri mümkündür: Ben) çekirdeği S-aşamasında tanımlamak ve ölçmek S fazlı Dizin; II) tanımlamak çekirdeği M-aşamasında ve M-faz Dizin ölçmek; III) çekirdeği mitotik veya segregasyonun S-aşamada edildi olup olmadığını belirlemek; IV) G2 süresi ölçün; V) ölçümü duartion G2 + M + G1 aşamaları; VI) ölçümü segregasyonun giriş oranı; VII) segregasyonun ilerleme hızını tahmin ediyoruz.

Bir ıslak-laboratuvar deneyleri sadece birkaç tür birden çok hücre döngüsü ölçümleri yapabilirsiniz. Bakteri ve ortak etiketleme M fazlı hücreleri ile anti-WAPL-1 antikor boyama tarafından bölge hücreleri boyama anti-pH3 antikor ve yaratıcı tarafından etiketli EdU ile C. elegans yetişkin Hünsa besleyerek etiketleme bir 30 dk darbe aşağıdaki protokolünü açıklar. Tek yem EdU (adım 2.5), tipi antikorların süresi değişimler (adım 5) istihdam ve analizleri (adım 8.3) ek ölçümler için gereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. EdU etiketli bakteri hazırlanması

  1. MG1693 starter kültürü büyümek. Escherichia coli (E. coli) MG1693 thyA içinde bir mutasyon taşır.
    1. 120 mm lysogeny suyu (LB) agar Petri kabına üzerine donmuş gliserol stoktan çizgi E. coli MG1693 dışarı. Kültür gecede 37 ° C'de.
    2. İki bireysel E. coli aşılamak MG1693 kolonileri iki yinelenen 4 mL tüpler 37 ° c ~ 16 h için sıvı LB. kültürünün.
      Not: MG1693 LB içinde iyi timin veya timidin ile ilave olmadan büyür.
  2. E. coli MG1693 EdU ile takıma en az medyada büyümek.
    1. Otoklav 500 mL konik cep şişesi.
    2. Steril tekniği 5 mL % 20 glikoz, tiamin 10 mg/mL, 5 mM timidin 120 μL, 1 M MgSO4, 10 mM EdU, M9 arabelleği 100 mL ve 4 mL taze yetiştirilen gecede MG1693 kültürünün 200 μL 100 μL 50 μL eklemek için kullanın.
      Not: Son EdU bu kültür1,720 mikron bölgedir. Bu konsantrasyon kültür20memeli hücreleri doğrudan uygulanan Eğer DNA hasarı ve hücre döngüsü tutuklanması için açar. Ancak, yalnızca bir kısmını bu EdU E. coli ve böylece C. elegansiçin kullanılabilir kurulmuştur. Genç Yetişkin Hünsa EdU tedaviden sonra hücre döngüsü tutuklama izine rastlanmadı ve yaratıcı bölge veya M-faz dizin boyutunu bir değişiklik yok olduğunu.
    3. Gecede, ama artık 200 devir / dakikada sallayarak ile 24 h 37 ° C'de daha kültür.
  3. EdU etiketli E. coli konsantre ve M9 agar Petri yemekler için geçerlidir.
    1. Masa üstü bir santrifüj ile 4 ° c önceden serin
    2. Steril tekniği kültür 2 – 4 steril 50 mL konik tüpler içine aktarmak için kullanın.
    3. 3000 x g EdU etiketli E. colicips 30 dk için 4 ° C'de, kültürler santrifüj kapasitesi.
      Not: EdU içeren süpernatant yerel ve kurumsal esaslarına göre atın.
    4. Granül 4 mL taze M9 ile resuspend. Steril 1 mL damlalıklı bahşiş veya steril 5 mL serolojik damlalıklı kullanın. Granül resuspending birkaç dakika sürebilir.
    5. Aynı damlalıklı uygulayıp ~ 8 damla resuspended EdU etiketli E. coli yaymak için kullanın MG1693 oda sıcaklığında 60 mm M9 agar Petri yemekler ortasına. Tek bir toplu ~ 16 yemekleri verir.
    6. Birkaç saat için kuru veya oda sıcaklığında bir gecede sonra her yemeğin laboratuvar film şeridi ile mühür yemekleri izin. Yemekleri 15 ° c ~ 2 hafta ve 4 ° c ~ 2 ay saklanabilir. EdU yemekleri aynı toplu iş her deneyler için kullanın.

2. C. elegans için EdU besleme

  1. Zamanlanmış yumurta yatıyordu, alkalin hipoklorit tedavisi kolesterol ile S-orta içine tarama veya uygun sahne21seçerek takip tarafından nüfus eşitleyin. İstenen (burada, 24 saat mesaj-L4) sahne alanı'nda Yuvarlak solucanlar büyüme E. coli OP50 20 ° C'de ile seribaşı orta hayvanlar büyümeye
    Not: deney, başına 50-100 hayvanlar gibi bazı iyi incelemek değil, diğerleri yıkama ve aktarılması sürecinde kayıp olacaktır hazırlamak.
  2. 20 ° C (veya deney için gerekli sıcaklık) ısıtmak EdU yemekleri izin.
  3. M9 veya fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 1,5 mL tüp içine kullanarak NGM yemekleri hayvanlardan yıkayın. Hayvanlar kısaca yerçekimi veya bir microcentrifuge kısa bir tur yerleşmek izin verir.
  4. Süpernatant kaldırmak ve hayvanlar M9 veya PBS ~ 1 mL 1 – 2 kez yıkayın. Süpernatant kaldırın.
  5. Bir cam Pasteur pipet M9 veya PBS küçük bir damla EdU çim ortasına üzerine hayvanlarda aktarmak için kullanın. Sıvı absorbe sonra 20 ° (S-faz tarihinin ölçmek için) C (için doğrudan S-faz ölçümü) 30 dakika veya daha uzun kuluçkaya birkaç dakika bekleyin, gerektiği gibi.
    Not: EdU sinyal1besleme EdU 15 dk kadar az sonra germline çekirdeği algılanabilir.
  6. EdU tabak çanak anatomi bir bardak içine ~ 2 mL M9 veya PBS ile kapalı solucanlar yıkayın.

3. diseksiyon ve C. elegans Germline fiksasyonu

Not: Diseksiyon, fiksasyon ve antikor C. elegans hermafrodit germline boyama için bu protokolü için hemen hemen aynı 1 mL Cam tüpler hızlandırmak için centrifuged dışında Gervaise ve Arur tarafından (2016)22, yayınladılar adımlar ve Pasteur pipet sıvı 1 mL Cam tüpler daha etkili bir şekilde kaldırmak için kullanılan bir süzgün cam yıkama.

  1. Yıkama ve C. elegans germlines incelemek.
    1. Hayvanlar diseksiyon çanak, Merkez, hayvanlarda toplamak için girdap altına yerleşmek izin ve uzun bir Pasteur pipet PBS kaldırmak için kullanın. 1-2 kez ~ 2 mL PBS ile yıkayın.
    2. PBS 2 mL ve 100 mM levamisole hayvanlar hareketsiz 4 μL ekleyin. Tekrar yemeğin ortasına hayvanlarda toplamak için çanak girdap.
      Not: İmmobilizasyon birkaç saniye ile birkaç dakika arasında sürebilir. Tam immobilizasyon başarılı diseksiyon için gerekli değildir. Eksik olarak dissekan hayvanlar immobilize zaman bazı insanların daha iyi başarı vardır.
    3. Hayvanlar (yaklaşık arasında iki faringeal ampuller) başında keserek 25G 5/8" iğne çifti ile incelemek veya kuyruk. Germline döngü kesmemeye dikkat çekmek. Bağırsak ve germline "iç basınç nedeniyle vücut boşluğu, dışarı pop" ama bağlı kalır. Bu iletişim kuralı daha önce yayımlanmış Gervaise ve Arur benzer (2016)22.
      Not: almak belgili tanımlık diseksiyon zaman ~ 5 min için kesinlikle en fazla 15 dk. daha uzun diseksiyon süreleri antikor boyama sinyal (Sudhir Nayak, kişisel iletişim) kaybına neden olabilir ve PBS açlık-ebilmek tesir etmek belgili tanımlık hayvan fizyolojisi. Öğrenme hızlı ve doğru incelemek için biraz pratik alabilir.
    4. Gerekirse, merkezi disseke hayvanlarda toplamak için girdap ve mümkün olduğu kadar PBS kaldırmak için uzun bir Pasteur pipet kullanın.
  2. Düzeltmek ve doku kurutmak
    1. 2 mL % 3 paraformaldehyde (PFA) PBS çözümde ekleyin. Laboratuvar film ve mağaza bir banka veya 10 min için bir çekmecede ile gevşek çanak kapağı.
      Not: Çözülme PFA çözüm 37 ° c su banyo ve oda sıcaklığında germlines anatomi önce serin.
      Dikkat: PFA çözüm orta derecede zehirlidir ve olası kanserojen ve teratogen. Paraformaldehyde çözümlerinden yayan buharlar yanıcı. Nitril eldiven giymek. İngiltere'de yılın %16 kimyasal duman başlıklı % 3 oranında seyreltin. Duman hood dışında çalışırken, tüm kapsayıcılara kapalı tutun.
    2. Gonads dikkatle temiz 5 mL Cam santrifüj tüpü aktarın.
    3. PBSTw ~ 3 mL ekleyin (PBS % 0.1 ile ara-20) gonads kalan gonads almak ve İngiltere'de yılın çözüm sulandırmak için bulunan çanak.
    4. Spin aşağı ~ 1 dk. Younger 870 x g , santrifüj klinik ya da küçük hayvan uzun spin zamanlar daha büyük veya daha büyük hayvanlar gerektirir.
    5. Uzun cam pipet kullanarak, süpernatant istenmeyen malzeme şişe kimyasal başlıklı nihai atma için istenmeyen malzeme kabı aktarın.
    6. Yüksek dereceli metanol-20 ° c için önceden soğutulmuş 2 mL ekleyin Santrifüj tüpü sıkıca laboratuvar film ile kapak.
      Not: Altın etiket taze"yüksek kalite" metanol kullanımı belirli antikorlar ile uygun morfoloji gereklidir.
      Dikkat: Metanol son derece yanıcı sıvı ve zehirli buharı, Yutulması halinde inhale veya cilt başvurun için izin. Eldiven ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek. Bir dondurucu flammables küçük birimler için uygun kullanın.
    7. -20 ° C-dondurucu 1 h, hatta gece için deposunda veya hatta birkaç ay.
      Not: Protokol burada duraklatılmış.

4. Germlines suyla temasa

  1. Cam santrifüj tüpü dön metanol sulandırmak ve gonads suyla temasa PBSTw ile doldurun. Spin aşağı ~ 1 dk klinik bir santrifüj 870 x g de içinde.
  2. Uzun cam Pasteur pipet kullanarak, süpernatant istenmeyen malzeme şişe kimyasal başlıklı nihai atma için istenmeyen malzeme kabı aktarın.
  3. PBSTw, iplik aşağı 870 x g de klinik bir santrifüj ~ 1 dk içinde her zaman ~ 5 mL 3 kez kullanarak gonads yıkayın. Süpernatant kaldırın.
  4. Bir küçük 1 mL borosilikat cam tüp ve uzun cam Pasteur pipet PBSTw ile yıkayın.
  5. PBSTw ~ 700 μL ekleyip uzun cam Pasteur pipet gonads küçük tüp aktarmak için kullanabilirsiniz. PBSTw birkaç ek damla tüm gonads aktarılmasını sağlamak için kullanın.
  6. Spin aşağı ~ 1 dk. süzgün uzun cam Pasteur pipet kullanılarak klinik bir santrifüj 870 x g de içinde gonads bozmadan mümkün olduğu kadar sıvı kaldırın. 50'den fazla μL bırakın.
    Not: antikor algılama gerekmiyorsa, adım 6'atlayın.

5. antijenleri antikorlar ile tespit

  1. PBS % 30 serumda birincil antikorlar sulandırmak. Mevcut örnekte, anti-WAPL-1 antikor seyreltilmiş 1:2,000 ve anti-pH3 antikor seyreltilmiş 1:500. Bir microfuge 20.000 x g 4 ° C'de parçacıklar kaldırmak için de 10 min için taze çözdürülen serum santrifüj kapasitesi. 4 ° C'de birkaç gün için saklama süpernatant, kullanın. İkincil antikorlar (keçi serum burada kullanılır) konak organizmanın eşleştirmek için uygun serum kullanın. İsteğe bağlı bir engelleme adım birincil antikorlar ek Önce eklenebilir.
  2. Seyreltilmiş birincil antikor 100 μL her küçük cam tüp için geçerlidir. 4 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    Not: Kuluçka kez antikor tarafından değişir. Bazı antikorlar için oda sıcaklığında 2 h yeterli olur. Uzun incubations (Örn., gecede) mümkündür, ama arka plan artabilir.
  3. PBSTw ile top ve 870 x g de klinik bir santrifüj ~ 1 dk içinde spin aşağı tüplere doldurun.
  4. 3 kez PBSTw. Incubate ~ 1 mL ~ 5 dakika başına yıkama yıkama yaygın fazla birincil antikor izin vermek için kullanarak gonads yıkayın. Bir süzgün kullanarak uzun cam Pasteur pipet, gonads bozmadan mümkün olduğu kadar sıvı kaldırın. 50'den fazla μL bırakın.
  5. PBS içinde % 30 keçi serumda ikincil antikorlar sulandırmak. Mevcut örnek, keçi-anti-tavşan-594 ve keçi-anti-fare-647 her-seyreltilmiş 1: 400.
    Not: ikincil antikorlar dikkatle boya boya EdU seti farklıdır emin olmak için seçin. Mevcut örnek, EdU kiti 488 nm uyarma boya içeriyordu.
  6. Seyreltilmiş ikincil antikor 100 μL her küçük cam tüp için geçerlidir. Oda sıcaklığında 2 h karanlıkta kuluçkaya.
    Not: Kuluçka kez antikor tarafından değişir. Bazı ikincil antikorlar için oda sıcaklığında 1 h yeterli olur. Uzun incubations (Örn., gecede) mümkündür, ama arka plan artabilir.
  7. 3 kez PBSTw. Incubate ~ 1 mL ~ 5 dakika başına yıkama yıkama yaygın fazla ikincil antikor izin vermek için kullanarak gonads yıkayın. Bir süzgün kullanarak uzun cam Pasteur pipet, gonads bozmadan mümkün olduğu kadar sıvı kaldırın. 50'den fazla μL bırakın.
    Not: bu sinyali azaltabilir, ancak Gonads PBS 100 μL içinde bu adımdan sonra gerekli ise, depolanabilir. PBS devam etmeden önce kaldırın.

6. gerçekleştirmek EdU algılamaya EdU tıklayın tepki

Not: EdU gerçekleştirme adımları (adım 6 adım 5 önce gerçekleştirmek) boyama antikor önce tıklayın tepki bağlı olarak kullanılan antikor7mümkündür. Ancak, tıklama reaktifler belirli antijenleri ile girişime neden olabilir (Örn., REC-8 antikor fiksasyon ve permeabilization duyarlı). Burada sunulan sipariş parlak antikor REC-8 ile boyama verimleri WAPL-1, hım-3, pH3, bayrak ve CYE-1 antikorlar, diğerleri arasında kullanılır.

  1. Belgili tanımlık tıkırtı EdU kokteyl8 taze temiz 1.5 mL tüp aşağıdakileri ekleyerek hazırlayın. Eklemeler sırası önemlidir. Işıktan korumak ve buz üzerinde tüm reaktifler korumak. Bu tarif verimleri yeterli bir örnek (100 μL); tarifi gerektiği gibi çarpın.
    1. 2 mL Ultrasaf Su arabelleğe katkı ekleyin. Bu 10 x 1 x seyreltilmiş arabellek katkı kullanmak için hemen önceki yapar.
    2. 10 x arabelleği 8,5 μL Ultrasaf Su 76,5 μL için ekleyin. İyice karıştırın.
    3. 100 mm CuSO4 (bileşen E etiketli) 4 μL ekleyin. İyice karıştırın.
    4. 488 nm boya azid 0,25 μL ekleyin. Onun solvent, dimetil sülfoksit, 4 ° C'de sağlam olduğundan oda sıcaklığında çözdürülen gerekir Mix iyi ve ışıktan korumak.
    5. 1 μL tampon tüp kap içinde katkı maddesi ile mix 9 μL Ultrasaf Su. Damlalıklı kapağı için kalan kokteyl ekleyip karıştırın de yukarı ve aşağı pipetting için gelen.
  2. EdU tıklayın tepki yapar.
    1. ~ 100 μL tıklayın EdU kokteyl küçük tüp gonads ekleyin. Laboratuvar film ile kapak ve 30-60 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    2. Bir kez tepki durulama arabellek 100 μL ile yıkayın.
    3. 4 kez PBSTw. Incubate ~ 1 mL ~ 15 dakika başına yıkama yıkama yaygın aşırı EdU kokteyl bileşenleri izin vermek için kullanarak gonads yıkayın. Bir süzgün kullanarak uzun cam Pasteur pipet, gonads bozmadan mümkün olduğu kadar sıvı kaldırın. 50'den fazla μL bırakın.

7. DNA leke ve slaytlar hazırlayın

  1. 1 damla (~ 25 μL) ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, DNA görselleştirmek için kullanılan) antifade montaj orta gonads için ekleyin. Yerleşmek böylece gonads ile karıştırmak birkaç dakika bekleyin.
    Not: Alternatif olarak, bir 1:1,000 seyreltme PBS içinde (0.1 mg/mL stoktan) DAPI, 1,4-diazabicyclo [2.2.2] oktan (DABCO) % 90 gliserol veya başka bir antifade montaj orta 20 μL ardından 5 min için uygulanabilir.
  2. Standart cam mikroskop slayt üzerindeki büyük bir % 2.5 özel yastık hazırlayın.
  3. Kullanım bir yeni temiz tozsuz uzun cam özel yastık gonads aktarmak Pasteur pipet. Tüm sıvı ve gonads gonads kaybını en aza indirmek için pipet dar alt tutun.
    Not: Gonads küçük cam tüpe sıkışmış veya uzun bardakta Pasteur pipet "PBSTw ile durulama, parçalanmış bir tabak içinde sıvı toplama ve bireysel hayvanlar bir kirpik ile slayt üzerine toplama tarafından kurtarıldı".
  4. Bir kirpik kullanımı (veya ince saç döngüsü) gonads özel yastık üzerinde dağıtmak ve toz parçacıkları kaldırmak için kürdan yapıştırılmış.
  5. Bir dikdörtgen cam coverslip uygulayın. Hava kabarcıklarını önlemek için yavaş yavaş bir taraftan daha düşük. Böylece coverslip serbestçe hareket etmesini engelleyen aşırı çözüm kaldırmak için bir doku kullanın.
    Not: kullanılacak mikroskop maç coverslips seçin. #1 ve #1.5 coverslips iyi çalışır.
  6. Slaytların yerleşmek ve biraz gecede oda sıcaklığında veya 4 ° c kuru izin Bu biraz gonads düzleştirmek için yardımcı olur. Slaytlar 4 ° C'de muhafaza edilmelidir
  7. İsteğe bağlı: tırnak cilası veya başka bir slayt mühürleyen slaytla kenarlarını kapatın. Köşeleri ilk, o zaman taraf mühürleme, coverslip değişen gelen engeller.

8. confocal görüntüleme ve çözümleme

  1. Görüntü dönen disk confocal floresan mikroskop ile distal erbezi yüksek enerji ışık kaynağı, planı apochromatic amaçları ve yüksek verim mikroskop kamera ile donatılmıştır. Esir alma imge 1 mikron veya z-yığınlar arasındaki sıkı aralığı ile. Tüm kanallar için lazer gücü, ışık hassasiyeti ve pozlama zaman dikkat edin.
    1. Aşağıdakileri kullanın: 405 nm lazer çizgi uyarma 485 nm (W60) emisyon filtre ile DAPI için 488 nm lazer çizgi uyarma 527 nm (W55) emisyon filtre ile EdU, 561 nm lazer çizgi uyarma WAPL-1 için 615 nm (W70) emisyon filtre ve 640 nm lazer çizgi excita için Tion pH3 için 705 nm (W90) emisyon filtre ile.
      Not: Sinyal şiddeti ve arka plan şiddeti değişir. Aynı şekilde, gerekli pozlama süreleri büyük olasılıkla ilâ 10 kat değişir.
  2. Hücre sayaç eklentisi23 Fiji24,25 ' el ile her çekirdek için kullanın. Her bireysel çekirdeği varlığı ve yokluğu pH3, EdU ve WAPL-1 göre etiket. Bunlar tüm ana hatlar aşağı hesaplamaları kolaylaştıracak olarak açıklanan Tablo 1 ve Şekil 2, çekirdek sınıflarını kullanın.
    Not: Yetenekli experimentalists doğru çift sayma veya herhangi bir çekirdek eksik olmadan 3D yansıma dosyasındaki tüm çekirdeklerin sayabilirsiniz. Alternatif olarak, bir z-uçağın her çekirdeğinde sayabiliriz ve işaretleri hücreleri R komut dosyası3 çarpma-sayılan çekirdek kaldırmak için kullanılabilir.
  3. Hücre sayıları ve frekanslar üzerinden gerekli hücre döngüsü ölçüm türüne bağlı olarak yukarıdaki sayıları hesaplamak. Çekirdeklerin türleri Tablo 1 ve Şekil 2içinde tanımlanır. Hesaplamaları tablo 2'de özetlenmiştir.
    1. (Varyasyon ben) S-aşamasında çekirdeklerin tanımlamak için 30 dk için EdU hayvan besleme. EdU etiket görüntüleme herhangi bir çekirdek S fazlı çekirdeği vardır. Hesaplamak için sum A ve C çekirdekleri al, Tablo 1 ve Şekil 2bakın.
      Not: bir 30 dk içinde vahşi-türü yetişkin Hünsa EdU darbe, tüm EdU çekirdeği etiketli ortak progenitör bölge işaretleri1ile etiketlenmiş.
    2. Yaratıcı bölgesi ölçmek için REC-8 veya WAPL-1 antikor gibi bir yaratıcı bölge marker ile leke. Yaratıcı bölgesi tanımlanır burada bütün nucleoplasmic REC-818 veya WAPL-1 immunoreactive germline çekirdeği olarak. Hesaplamak için tüm WAPL-1 immunoreactive çekirdeği toplamı (A + B + C + D, Tablo 1 ve Şekil 2bakın).
      Not: WAPL-1 de DTC ve yok sayılması somatik erbezi çekirdeği Etiketler. Somatik hücre çekirdeği son derece yoğun WAPL-1 sinyal, pozisyon biraz dışında germline ve çekirdekleri bir "kızarmış yumurtalı" morfoloji tarafından tespit etmek kolaydır.
    3. S-faz Dizin ölçmek için 30 dk EdU deney gerçekleştirmek ve REC-8 veya WAPL-1 antikor ile ortak etiket. S-faz Dizin S-aşamasında progenitör bölge oranı olarak tanımlanır. Hesaplamak için tüm S fazlı çekirdeği saymak ve sonra dede bölge çekirdeği toplam sayıya bölme (A + C / A + B + C + D, Tablo 1 ve Şekil 2bakın).
    4. (Varyasyon II) M-aşamasında çekirdeklerin tanımlamak için pH3 antikor ile leke. Herhangi bir pH3 immunoreactive çekirdeği M fazlı çekirdeği vardır. Bu yem EdU süresi bağımsız olarak çalışır. A toplamı hesaplamak için almak ve B hücre çekirdeği, Tablo 1 ve Şekil 2bakın.
      Not: WAPL-1 de DTC ve yok sayılması somatik erbezi çekirdeği Etiketler. Somatik hücre çekirdeği son derece yoğun WAPL-1 sinyal, pozisyon biraz dışında germline ve çekirdekleri bir "kızarmış yumurtalı" morfoloji tarafından tespit etmek kolaydır.
    5. M-faz Dizin ölçmek için pH3 ve REC-8 veya WAPL-1 antikorlar ile ortak etiket. M-faz Dizin M-aşamasında progenitör bölge oranı olarak tanımlanır. Hesaplamak için tüm M-faz çekirdeği saymak ve sonra dede bölge çekirdeği toplam sayıya bölme (A + B / A + B + C + D, Tablo 1 ve Şekil 2bakın).
    6. (Varyasyon III) Çekirdek aşamasında mitotik ve segregasyonun S-her ikisi de EdU ile etiketleyin. İki popülasyonun ayrı söylemek gerekirse, S-evre mitoz veya mayoz izledi belirlemek. Çekirdeklerin mitotik veya segregasyonun S-aşamasında olup olmadığını belirlemek için EdU 4 h ve pH3 için ortak etiket için yem (bir M-faz işaretleyici) ve hım-antikor boyama tarafından 3 (segregasyonun kromozom eksen protein). EdU ve pH3 görüntülemek çekirdeklerin kayıt (A tipi, Tablo 1 ve Şekil 2bakınız) mitotik S-faz EdU ve hım-3 görüntüleyen hücre çekirdeği süre olarak (türü E, Tablo 1 ve Şekil 2bakın) segregasyonun S-faz olarak.
    7. (Varyasyon IV) G2 aşamanın süresini hesaplamak.
      Not: G2-faz M-faz S fazlı ayırır. Her ne kadar hiçbir işaret C. elegans germline G2 etiketinde bildirilmiştir, bir etiket M-faz (diseksiyon zamanında) ve S-faz (birkaç s önce başlayan birkaç deney verileri birleştirerek G2 faz süresince hesaplayabilirsiniz diseksiyon). M-faz ve S-faz işaretçileri görüntüler bir hücre G2 fazlı deneme süresince tamamlandı. Sadece M-faz marker ve S-faz imini içermeden görüntüleyen bir hücre S-aşamasında deneme sırasında değildi.
      1. G2-aşamanın süresini hesaplamak için 2 h ve pH3 antikor ile ortak etiket için EdU besleme. (M-faz diseksiyon esnasında bunlar) pH3 (bunlar S-aşamada 2 h EdU etiket önce diseksiyon sırasında edildi) EdU varlığı ile etiket tek çekirdek inceleyin. G2-aşama tamamlandı M fazlı çekirdek kısmını hesaplamak (A / A + B, bkz: Tablo 1 ve Şekil 2).
      2. 3 h EdU etiketi içeren ve tekrar bir 4 h EdU etiket (ve isteğe bağlı olarak bir 5 h EdU etiket) ile bu denemeyi tekrarlamak. EdU y ekseni üzerinde pozitif olan pH3 pozitif hücre çekirdeği yüzde ve EdU etiket x ekseni, süresi içinde Şekil 3Agösterildiği gibi arsa.
      3. Grafikteki nokta bağlanma ve % 50, yolun hangi noktada keseceğini Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi belirleme G2 fazlı ortanca süresi hesaplayın.
      4. Grafikteki nokta bağlanma ve % 99, yolun hangi noktada keseceğini Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi belirleme G2 fazlı en uzun kalma süresini hesaplayın.
    8. (Varyasyon V) G2 + M + G1 duraion hesaplayın.
      Not: C. elegans germline G1 evresi alışılmadık derecede kısadır. Her ne kadar hiçbir işaret G1 C. elegans germline etiketlemek için rapor edildi, bir G2, M ve G1 evresinin toplam süresini tahmin ve sonra bu sefer yukarıda açıklanan G2 fazlı zamanla karşılaştırın. G2 + M + G1 maksimum süresi (S-faz geçmesi değil) EdU negatif EdU birkaç saat için etiketleme sonra kalır tüm yaratıcı bölge çekirdek (WAPL-1 immunoreactive) yüzdesini tahmin edilmektedir.
      1. G2 + M + G1 süresini hesaplamak için 2 h ve REC-8 veya WAPL-1 antikor ile ortak etiket EdU beslemesi. Bu süre içinde S-faz uygulandı progenitör bölge kısmını belirlemek (A + C / A + B + C + D, Tablo 1 ve Şekil 2bakın).
      2. 3 h EdU etiketi içeren ve tekrar bir 4 h EdU etiket (ve isteğe bağlı olarak bir 5 h EdU etiket) ile bu denemeyi tekrarlamak. REC-8 veya EdU y ekseni üzerinde pozitif olan WAPL-1 pozitif hücre çekirdeği yüzde ve x ekseni, EdU etiket süresi Şekil 3B' gösterildiği gibi arsa.
      3. Grafikteki nokta bağlanma ve % 99, yolun hangi noktada keseceğini Şekil 3B' gösterildiği gibi bulma G2 + M + G1 en uzun kalma süresini hesaplayın.
        Not: G2 + M + G1 ve G2 süresi 2, 3, 4, tek bir küme olarak belirlemek için deneyler ve 5 h EdU deneyler tavşan-anti-WAPL-1 hem de fare-anti-pH3 antikorlar ile birlikte etiketleme tarafından gerçekleştirmek mümkündür.
    9. (Varyasyon VI) Dede bölgesinde çoğaltılan çekirdeklerin tanımlamak ama beri girilen mayoz var için REC-8 veya WAPL-1 antikorlar ile 10 h ve Co etiketi için EdU hayvan besleme. EdU etiket görüntüleme herhangi bir çekirdek sırasında bu 10 h S-aşamada edildi. REC-8 veya WAPL-1 nucleoplasmic boyama görüntüleme herhangi bir hücre çekirdeği içinde mayoz vardı. Sadece yaratıcı bölge marker ile etiketleme görüntülenmez EdU etiketleme ile çekirdekleri saymak (E, bkz. Tablo 1).
      Not: Tersine, gonads hım-3 segregasyonun profaz işaretçisiyle anti-hım-3 antikorlar için lekeli sayısı etiketleme EdU ile çekirdek sayısı olup ayrıca hım-3 için olumlu.
    10. Segregasyonun giriş oranını hesaplamak için yukarıdaki deney EdU 5 h, 10 h ve 15 h etiketi gerçekleştirmek. Y ve x ekseni, EdU etiketinde süresi mayoz girilen çekirdeklerin sayısı Şekil 3 ciçinde gösterildiği gibi ayarlayın. Sonra bir basit doğrusal regresyon kullanın yamaç (h başına çekirdek girilen Mayoz) hesaplamak için y = mx + b.
      Not: Bir doğrusal regresyon segregasyonun giriş oranını hesaplarken kullanmak önemlidir. Y-kesişim noktası sıfır olduğundan sadece mayoz EdU etiket süresi tarafından girilen çekirdeklerin sayısı bölün yanlış olacaktır.
    11. (Varyasyon VII) Segregasyonun ilerleme hızını ölçmek.
      Not: EdU kovalent DNA'ya kurulmuştur, bu farklılaşma ile hücreleri nüfusu izlemek için kullanılabilir. Mayoz, mayoz, ilerlemeyi içine girin ve oogenesis tabi S-dede bölge aşamasında uygulanan hücre EdU etiket saklamanız. EdU ile bir darbe-chase deneyinde segregasyonun ilerleme hızını ölçmek için kullanılabilir.
      1. EdU etiketli bakteri 4 h ("darbe") hayvanlara yem. Hayvanlar 48 h ("chase") için etiketlenmemiş OP50 bakteri transfer sonra incelemek ve isterseniz etiket eş REC-8 veya WAPL-1 gibi bir yaratıcı bölgesi işaretçisi (veya bir segregasyonun profaz marker hım-3 gibi).
      2. Imaging en proksimal EdU etiketli çekirdeği pozisyon için bakın. Segregasyonun progresyon oranı (hücre çapı progenitör bölge sonu) uzaktan çekirdeği 48 h kovalamaca sırasında etiketli en proksimal EdU tarafından gitti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DNA sentezi EdU dahil etmek için gerekli olduğundan, bir EdU etiketli çekirdeği S fazlı EdU-etiketleme zaman penceresi sırasında yapıldı sonucuna varabiliriz. Bir bakteri çekirdeği S-faz olarak etiketlenmiş diseksiyon anda EdU ile bir 30 dk beslenme içinde bu etiketle çekirdeklerin yorumlayabilir. Deney besleme bir artık sürekli EdU içinde etiket çekirdeği erken zaman penceresinde ve sol S fazlı beri etiketli veya EdU zaman penceresi geç parçası olarak etiketlenmiş. EdU sinyal DAPI sinyal ile birlikte yerelleştirir. Diğer çekirdek EdU 1 – 2 parlak puncta (Şekil 4) sinyal yerelleştirir iken bazı çekirdek tüm kromozomlar, EdU sinyal kapsar. Bu puncta büyük olasılıkla geç S fazlı13' te çoğaltır x kromozomu vardır.

Burada, hayvanlar olduğunu EdU ile sürekli için 30 dk beslenen ve yukarıda ve Şekil 5' te anlatılan disseke. EdU bir genç yetişkin hayvan ve bir örnek başarısız EdU büyük yetişkin hayvan (aşağıya bakın) boyama boyama başarılı bir örnek Şekil 4' te gösterilmiştir. Çekirdek (etiketleme ama DAPI morfoloji26,27,28tarafından yaklaşık olarak WAPL-1 antikor tarafından tanımlanan) yaratıcı bölgedeki yaklaşık yarısı bir 30 dk etiketleme gelen EdU sinyal yerelleştirir. S-faz Dizin, EdU olumlu, daha önce bildirilen 57 ±5% ve Genç yetişkinler1,2,%370 gibi yüksek progenitör bölge oranı. Yaklaşık 2-%31,29M fazlı dizinidir. Sürekli besleme için 4 saat veya daha uzun, EdU ile yaratıcı bölge etiketindeki tüm çekirdek ve progenitör bölgesinde etiketli bazı çekirdekleri beri segregasyonun profaz1girdiğiniz.

Teknik sürekli vahşi tipli Genç Yetişkin hayvanlarda çalışsa da, şeklindeki 5 gün eski Hünsa (hatta sperm içeren) önemli bir kısmını bir 30 dk içinde EdU darbe (Şekil 4E) etiketlemek başarısız oldu. Ancak, 4 h besleme, neredeyse tüm bu hayvanlar EdU ile etiket. Etiket EdU ve kısa darbeleri ile genetik kadın hayvanlarda sporadik başarısızlığa da bildirilen30olmuştur. Sporadik etiket için neden diğer durumlar olabilir.

Bir hücre döngüsü süresi her etiketleme birkaç EdU-etiketleme ile deneyler pH3 gerçekleştirerek hesaplayabilirsiniz. G2 süresi EdU (Şekil 6) saat boyunca olumlu olduğunu çekirdek M-faz (pH3 immunoreactive) yüzde analiz ederek tahmin edilmiştir. Bu yaklaşım medyan ve G2 en uzun kalma süresini verir (Şekil 3A). Medyan zaman 2,5 h G2 aramanýn Genç Yetişkin Hünsa gösterilen hesaplanan. G2 + M + G1 süresi EdU pozitif (Şekil 6) vardı tüm yaratıcı bölge çekirdek (WAPL-1 immunoreactive) yüzdesi tahmin edilmiştir. G2 + M + G1 yöntemi kombine aşamaları (Şekil 3B) için maksimum süresi ölçü birimi sağlar. 99. yüzde birlik zamanı, 3,4 h G2 + M + G1 aramanýn Genç Yetişkin Hünsa gösterilen hesaplanan. Aynı deneyler verilerden segregasyonun giriş (çekirdek başına h) oranını hesaplamak için kullanılmıştır. Mayoz (EdU pozitif, WAPL-1 negatif veya hım-3 pozitif) EdU etiket (Şekil 3 c) süresi içinde girilen çekirdeklerin sayısı doğrusal regresyon eğimi oranıdır. Vahşi-tipi 1 gün eski yetişkin hermoafroditler için değerler Tablo 2' de gösterilmiştir.

Figure 1
Resim 1: C. elegans germline ve hücre döngüsü diyagramı. (A) Genç Yetişkin hermafrodit germline germ hücrelerinin hücre döngüsü. Sayıları yaklaşık yüzde her hücre döngüsü aşamasında harcanan zamanın olduğunu gösterir. (B) C. elegans Hünsa var iki U şeklinde germlines (kırmızı ve mavi). Spermatheca sarı renk ile gösterilir ve embriyo geliştirmek ile rahim koyu gri renkte gösterilir. Kesikli turuncu çizgi nerede hayvanlar germlines Yükselt için disseke gösterir. (C) diyagramı bir gelişeceğini C. elegans germline. DAPI (mavi) nükleer morfoloji vurgular bir DNA boya var. Mitotically Bisiklete binme kök hücreler, progenitor hücreler ve segregasyonun S fazlı hücrelerde (WAPL-1 antikor boyama üzerinde dayalı kırmızı işaretli) distal progenitör bölge içerir (WAPL-1 de somatik erbezi çekirdeği etiketleri). Mitotik ve segregasyonun S-fazlı hücrelerde bir 30 dk EdU darbe ile etiket ve yeşille gösterilir. M-faz iki hücre pH3 antikor ile etiket ve siyah olarak gösterilir. Distal ucu hücre (DTC) Bu hücreler kök hücre kaderi korumak için GLP-1/çentik ligand sağlar. Hücreleri uzak DTC göç gibi yaratıcı bölge çıkın ve segregasyonun profaz girin. Spermatheca sperm sarı hücrelerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Venn şeması çekirdek sınıfların. Çekirdek üç işaretleri ile gruplanır: WAPL-1 gösterir progenitör bölgesi hücreleri (kırmızı), EdU gösterir S fazlı hücreleri (yeşil) ve pH3 M-faz hücreleri (mavi) gösterir. Hücre tipleri A-Gtanımlanır. Vahşi tipli Genç Yetişkin Hünsa F türden hücreleri bulunmazlar ve hücreleri değil ortak etiket EdU ve pH3 (WAPL-1 pozitif) yaratıcı dışında Not bölge. Distal erbezi diyagram aşağı A-E ve G çekirdekleri bir örneği gösterir. Daha ayrıntılı bilgi için bkz: Tablo 1 . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: hücre döngüsü süresi ve hızı, segregasyonun giriş deneysel verilerin grafik sunumu. (A) faz pH3 hesaplanan G2 ve gri çizgiler, medyan ve oklarla gösterilen en fazla G2 süreleri enterpolasyonla kullanılan 50 ve 99 testlerinde gösterir EdU birlikte etiketleme aşağıdaki çeşitli süreli EdU bakliyat süresi. (B) A hücre G2, M veya G1 aşamasında EdU dahil değil. Böylece, G2 + M + G1 evresi en uzun kalma süresini EdU-negatif hücreleri verimleri EdU etiketi en uzun kalma süresini ölçerek tahmin edilebilir. G2 + M + G1 evresi süresince EdU ve REC-8 takip çeşitli süreli EdU bakliyat işbirliği etiketleme hesaplanan. Gri çizgi 99 bir okla gösterilen en fazla G2 + M + G1 süresi enterpolasyonla kullanılan gösterir. Ortanca G2 + M + G1 süresi getirmek mümkün değildir. (C) segregasyonun giriş oranı (çekirdek başına h- Tablo 2bakınız) regresyon çizgisinin eğimini hesaplanır. Y-kesişim noktası kesme noktası sıfır olmadığından, bir gerileme segregasyonun giriş (C) oranı doğru bir hesaplama için gerekli olduğunu unutmayın. . Hata çubukları standart sapma gösterir. Şekil değiştiren ve Fox ve ark. izni ile yayımlanmaktadır 20111. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: başarılı ve başarısız 30 dk EdU boyama örneği. Confocal mikroskop imge-in 1 gün eski (A-D) ve 5 gün eski (E-H) hermafrodit erbezi (sperm tükenmiş) 30 dk EdU etiketleme deneme sonra. Kesikli beyaz çizgi progenitör bölge sonunu gösterir. Yıldız işareti distal ucu konumunu işaretler. Yeşil işaretleri EdU boyama tarafından görüntülenmiştir Kimya(a)'ıtıklatın. Başarısız EdU etiketleme alt düzey arka plan yok parlak EdU + hücre çekirdeği (E) boyama sonuçlanır. Kırmızı lekeler WAPL-1 ayirt (B, F). Sarı örtüşme (C, G) gösterir. Mavi işaretleri DAPI DNA (D, H) boyama. Tek ok uçları EdU kromatin boyama ile bir çekirdek belirtin. Çift ok uçları EdU puncta üzerinde sadece bir çift kromozom çekirdekle gösterir. Görüntüleri bir 63 X amacı ile elde edilmiştir. Ölçek çubuğu 10 µm (D, H) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: deneysel iş akışı. Bir Özet(a)büyümeye deneysel protokolünden EdU etiket (B), (C) teşrih, antikor leke (D), bir boya EdU (E) eklemek, leke DNA (F), germlines (G), görüntü için tıklayın tepki gerçekleştirmek ve etiketli EdU ve çekirdeği (H) lekeli antikor ölçmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: başarılı 4 h EdU boyama örneği. 4 h EdU etiketleme deneme sonra 1 gün eski yetişkin hermafrodit erbezi confocal mikroskop görüntüleri. Kesikli beyaz çizgi progenitör bölge sonunu gösterir. Yıldız işareti distal ucu konumunu işaretler. Eflatun pH3 ayirt (A, C) işaretler. Yeşil işaretleri EdU boyama tarafından görüntülenmiştir kimya (B, C)'ı tıklatın. Kırmızı lekeler WAPL-1 ayirt (D). Sarı örtüşme EdU ve WAPL-1 (E) gösterir. Mavi işaretleri DAPI DNA (F) için boyama. Tek ok uçları EdU ve pH3 ile birlikte etiketli çekirdekler gösterir. Çift ok ucu bir pH3 + EdU-çekirdek - 4 h EdU etiketleme nadir bir olay işaretler. Oklar EdU + WAPL-1 - mayoz girdiniz çekirdeği işaretleyin. Görüntüleri bir 63 X amacı ile elde edilmiştir. 10 µm ölçek çubuğu (F) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

İşaret: pH3 EdU * WAPL-1 veya REC-8 ONU-3
Yorumu: Mitoz S-faz * Yaratıcı bölgesi Mayoz
Sınıf: Kombine yorumu:
A Symbol 1 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 M-aşamasında yaratıcı bölgesi olarak, mitotik S-aşamada EdU etiket (tamamlanmış G2) sırasında edildi
B Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 M-aşamasında yaratıcı bölgesi olarak, S-aşamasında EdU etiket sırasında değildi
C Symbol 2 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 Interphase progenitör bölgedeki içinde S-aşamada EdU etiket sırasında edildi
D Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 Interphase progenitör bölgedeki içinde S-aşamasında EdU etiket sırasında değildi
E Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 mayoz, segregasyonun S-aşamada EdU etiket (segregasyonun giriş çekirdeği) sırasında edildi.
F Symbol 1 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 mitoz (bazı mutantlar bulunur) veya (Sperma içinde) segregasyonun bölümler geri dönmek
G Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 mayoz, S-aşamasında EdU etiket sırasında değildi
Sum toplam pH3 olumlu; M-faz bulunan bütün hücreler Sum toplam EdU pozitif; S-faz bulunan bütün hücreler Sum toplam WAPL-1 pozitif;  Yaratıcı bölgesi bulunan bütün hücreler Sum toplam hım-3 pozitif; segregasyonun profaz bulunan bütün hücreler

Tablo 1: çekirdek sınıfların. * Not 30 dk ve 4 h EdU deneyler yorumlanmasında farklılık. Daha uzun süre içinde EdU deneyler, hücreler büyük olasılıkla S-faz ilerlemiştir. EdU etiketleme için ilgili deneme süresi için bkz: giriş ve Adım 8 .

Hücre döngüsünün parçası Operasyonel tanımı Hesaplama * Değer **
Yaratıcı bölgesi çekirdeği Tüm WAPL-1 (veya REC-8) olumlu, hım-3 negatif çekirdek A + B + C + D 231 ± 23 çekirdeği
S-faz çekirdeği çekirdeklerin EdU 30 dk EdU etiket ve WAPL-1 olumlu sonra olumlu A + C 133 ± 20 çekirdeği
M-faz çekirdeği pH3 ve WAPL-1 co-positive çekirdeği A + B 5.2 ± 2.3 çekirdeği
S-faz Dizin S-faz çekirdek / Progenitor bölge çekirdeği A + C / A + B + C + D hücre döngüsü, % 57
M-faz Dizin M-faz çekirdek / Progenitor bölge çekirdeği A + B / A + B + C + D hücre döngüsünün % 2'si
Segregasyonun giriş hücreleri Çekirdeklerin mayoz olarak etiketli EdU E EdU etiket süresine göre değişir
Segregasyonun giriş oranı H EdU etiket başına segregasyonun giriş çekirdeği Eğim Şekil 4 C *** h başına 20,3 çekirdeği
G2 süresi (medyan) Figure4A üzerinden % 50 kesişim noktası 2,5 h
G2 süresi (maksimum) Şekil 4A üzerinden % 99 kesişim noktası 3.5 h
G2 + M + G1 süresi (maksimum) Şekil 4B den % 99 kesişim noktası 3.5 h
Hücre döngüsü süresi (medyan) Ortanca G2 süresi / G2-Dizin *** 6.5 h.
Hücre döngüsü süresi (maksimum) en fazla G2 süresi / G2-Dizin *** 8.1 h

Tablo 2: hücre döngüsü hesaplamalar. * Harfler Tablo 1 ve Şekil 3' de tanımlandığı çekirdek sınıfları gösterir. Hesaplamalar Fox ve ark. değiştirilir 20111. ** Değerleri (± Standart sapma) vahşi tipi Hünsa 24 saat sonrası Orta-L4 aşamaya Yaş 20 ° C'de kaldırdı. Y-kesişim noktası kesme noktası sıfır olmadığından, bir gerileme segregasyonun giriş oranı doğru bir hesaplama için gerekli olduğunu unutmayın. G2 dizinin Fox vd. 20111tarafından açıklandığı gibi S fazlı Dizin, M-faz dizin ve yaklaşık G1-dizini (% 2) % 100'den çıkarılarak belirlenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı ve sorun giderme için ilk nokta EdU etiketli bakteri (adım 1) hazırlanması önemlidir. Vahşi tipli Genç Yetişkin Hünsa etiketinde çok güvenilir 4 h EdU-darbe, bu EdU etiketli bakteri yeni her toplu iş için kullanışlı bir denetimi yapma. Ayrıca, bağırsak (büyük hayvanlar veya belirli yutak/taşlama arızalı mutantlar) girin sağlam EdU etiketli bakteri tıklayın kimya ile etiket ve parlak dikdörtgen puncta gut olarak görünür. Hünsa etiketleme için alternatif bir teknik bir "emmek" EdU3yüksek konsantrasyon (1 mM) kullanır. Bu teknik hayvanlar etiketleme süresi için açlık ancak yapım EdU etiketli bakteri fiksasyon giderirken atlayıp Kimya tıklatın için kullanışlı bir yol sağlar. EdU beslemesi değildir, ancak bir EdU "emmek" deneme başarılı olursa, o zaman taze EdU etiketli bakteri hazırlayın. Ayrıca yüksek bir EdU içerik elde ederken yeterli bir bakteri yoğunluğu ulaşmak için bir EdU ve timidin konsantrasyonları ayarlamanız gerekebilir.

S-aşaması etiketleme için bu teknik ana EdU etiketli bakteri hayvanlara yem ihtiyacı kısıtlamadır. (Genotip veya sahne nedeniyle) yem olamaz hayvan ile bu tekniği olarak etiketlenmiş olabilir değil. Sonuçta, nükleozit analogları Şu anda C. elegans germline S fazlı çekirdeği tanımlamak için tek yöntem, ve bunların kullanımı herhangi bir transgenes hayvanlarda bulunması gerektirmez. Ayrıca, bir kez dahil, çekirdeği EdU kalır S-faz, hücre döngüsü, ilerlemeyi inerken bile bölmek veya ayırt etmek. Her hücre bölünmesi ile yarıya sinyal zayıfladı. Bu EdU bir hücrenin geçmişini bile üzerinden birkaç hücre bölünmeler izleme için mükemmel yapar.

EdU kararlılığını nabız-chase deneyler basit yapar; Sadece hayvanların aşırı EdU bakterilerden istenen süre nabız tamamlandıktan sonra durulama ve hayvanlar için etiketlenmemiş bakteri transfer. EdU DNA içinde kalır ve sonra bile birden çok hücre bölümler görünür kalır. Ancak, deneyler S fazlı etiket (EdU tek bir darbe) tek bir türü için sınırlıdır. EdU ve BrdU ile birlikte etiketleme memeli hücreleri31 ' de mümkündür ama C. elegansiçinde rapor değil. Etiketleme IdU ve CldU ortak memeliler32 kullanılır ancak aynı zamanda C. elegansiçinde rapor değil.

EdU etiketleme ana avantajları yok transgenes bildiriyi, EdU C. elegans için sırasında düzenli kültür beslenebilir, kimya immünfloresan teknikleri ile uyumludur ve EdU DNA'besleme sonra uzun süre devam ederse vardır durdu. Bu özellikler EdU hücre döngüsü ve germ hücre dinamiği birçok açıdan incelemek için harika bir araç olun.

Hücre döngüsü ve germ hücre dinamiği Analizi EdU ile araştırma soruları çeşitli için uygulanabilir. Daha fazla uygulama bu yöntemin sadece birkaç örnekleri: nasıl hücre döngüsünün dinamiklerini değiştirmek hücre döngüsü gen mutasyonlarının ile hayvanlarda? Fizyolojik şartlarda hücre döngüsü kök hücreler, segregasyonun profaz girdiği germ hücre oranı ve segregasyonun profaz aracılığıyla germ hücreli progresyon oranı nasıl etkiler? Nasıl hücre döngüsünün larva geliştirme sırasında değişir mi? Büyük sinyal yolu kesintileri değişiklikleri (örneğin, ektopik yayılması) hücre kader ek olarak hücre döngüsünün nasıl etkiler? Bu sistem hücreleri birçok farklı koşullarda ne arıyorsunuz çalışmaya değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

MG1693 için E. coli stok merkezi için minnettarız; Wormbase; Ulusal kurumları, sağlık Office of araştırma altyapı programlar tarafından (P40OD010440) suşlar için finanse Caenorhabditis genetik Merkezi; Zach Pincus istatistiksel tavsiye için; Aiping Feng reaktifler için; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar ve John Brenner eğitim, danışmanlık, destek ve yardımcı tartışma; ve bu el yazması geri bildirimler Kornfeld ve Schedl labs. Bu eser kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen [R01 AG02656106A1 KK, R01 GM100756 TS için] ve bir Ulusal Bilim Vakfı HGUGM dostluk [DGE-1143954 ve DGE-1745038 ZK için]. Ne Ulusal Sağlık Enstitüleri ne de Ulusal Bilim Vakfı çalışma, toplanması, Analizi ve yorumu veri tasarım, ne de el yazması yazılı herhangi bir rolü vardı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. Click-iT EdU Imaging Kits. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. De Cell Counter Plugin. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. ImageJ. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
  31. Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 140 C. elegans EdU S-faz hücre döngüsü Germline segregasyonun S fazlı M-faz G2 fazlı
<em>C. elegans</em> Germline timidin Analog EdU ile hücre döngüsü analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kocsisova, Z., Mohammad, A.,… More

Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU. J. Vis. Exp. (140), e58339, doi:10.3791/58339 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter