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Developmental Biology

Thymidine अनुरूप EdU के साथ C. एलिगेंस Germline में कक्ष चक्र विश्लेषण

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/58339
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 2
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Summary

एक इमेजिंग-आधारित पद्धति वर्णित है कि S-चरण पहचानने और thymidine अनुरूप EdU का उपयोग कर C. एलिगेंस द्विलिंग germline में कक्ष चक्र गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । इस विधि कोई transgenes की आवश्यकता है और immunofluorescent धुंधला के साथ संगत है ।

Abstract

सेल साइकिल विश्लेषण eukaryotes में अक्सर गुणसूत्र आकृति विज्ञान, अभिव्यक्ति और/या जीन उत्पादों के स्थानीयकरण सेल चक्र के विभिंन चरणों के लिए आवश्यक का उपयोग करता है, या nucleoside अनुरूप के शामिल । एस-चरण के दौरान, डीएनए polymerases गुणसूत्र डीएनए में ऐसे EdU या BrdU के रूप में thymidine अनुरूप शामिल, विश्लेषण के लिए कोशिकाओं अंकन । C. एलिगेंसके लिए, nucleoside एनालॉग EdU नियमित रूप से संस्कृति के दौरान कीड़े को खिलाया जाता है और immunofluorescent तकनीकों के साथ संगत है । C. एलिगेंस के germline संकेत रास्ते के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है, स्टेम सेल, अर्धसूत्रीविभाजन, और कोशिका चक्र क्योंकि यह पारदर्शी है, आनुवंशिक रूप से सतही, और meiotic दौर और सेलुलर भेदभाव/gametogenesis में होते हैं रैखिक विधानसभा-फैशन की तरह । ये सुविधाएं mitotically सायक्लिंग कोशिकाओं और germline विकास के गतिशील पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक महान उपकरण बनाने के लिए । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे सफलतापूर्वक EdU जीवाणुओं को तैयार करने के लिए, उंहें जंगली-प्रकार सी एलिगेंस hermaphrodites, काटना द्विलिंग gonad, डीएनए में EdU के लिए दाग, एंटीबॉडी के साथ दाग के लिए विभिंन सेल चक्र का पता लगाने के लिए फ़ीड और विकास मार्करों, छवि gonad और परिणामों का विश्लेषण । प्रोटोकॉल पद्धति और एस के माप के लिए विश्लेषण में बदलाव का वर्णन चरण सूचकांक, एम चरण सूचकांक, G2 अवधि, सेल चक्र अवधि, meiotic प्रवेश की दर, और meiotic दौर प्रगति की दर । इस विधि के लिए सेल चक्र या अंय ऊतकों, चरणों, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, और शारीरिक स्थितियों में सेल के इतिहास का अध्ययन अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

पशु विकास में, सैकड़ों, हजारों, लाखों, अरबों, या सेल डिवीजनों के भी खरब वयस्क जीव बनाने के लिए आवश्यक हैं । सेल साइकिल, G1 (गैप), एस (संश्लेषण), G2 (गैप), और एम (बँटवारा) से बना सेलुलर घटनाओं के सेट की घटनाओं है कि प्रत्येक कोशिका विभाजन निष्पादित कर रहे हैं की श्रृंखला को परिभाषित । सेल चक्र गतिशील और सबसे अच्छा वास्तविक समय में सराहना की है, जो तकनीकी रूप से मुश्किल हो सकता है । तकनीक इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत एक के चरणों और अभी भी छवियों से सेल चक्र के समय की माप बनाने के लिए अनुमति देते हैं ।

nucleoside एनालॉग के साथ लेबलिंग जैसे 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) या 5-ब्रोमो-2'-deoxyuridine (BrdU) में सेल चक्र गतिशीलता के अध्ययनों में एस चरण की पहचान करने के लिए स्वर्ण मानक है Caenorhabditis एलिगेंस (C. एलिगेंस) वयस्क द्विलिंग germline1,2,3,4,5. दोनों EdU और BrdU लगभग किसी भी आनुवंशिक पृष्ठभूमि में इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में वे किसी भी आनुवंशिक निर्माण पर भरोसा नहीं है । visualizing BrdU कठोर रासायनिक उपचार की आवश्यकता है विरोधी के लिए प्रतिजन-BrdU एंटीबॉडी धुंधला है, जो अक्सर अंय सेलुलर अतिरिक्त एंटीबॉडी के साथ-दाग के द्वारा visualized मार्करों के आकलन के साथ असंगत है बेनकाब । इसके विपरीत, visualizing EdU हल्के शर्तों के तहत क्लिक रसायन विज्ञान द्वारा होता है और इस प्रकार एंटीबॉडी सह के साथ संगत है6,7धुंधला ।

लेबल की विशिष्टता स्पष्ट है, क्योंकि नाभिक केवल thymidine (5-ethynyl-2 '-deoxyuridine) के अनुरूप डीएनए में एस चरण के दौरान शामिल है । विज़ुअलाइज़ेशन निश्चित ऊतक में जगह लेता है । edu लेबल एक azide युक्त डाई या fluorophore द्वारा edu में alkyne के साथ covalently प्रतिक्रिया करता है जब तक स्वयं द्वारा अदृश्य है-catalyzed रसायन विज्ञान8क्लिक करें । EdU लेबलिंग तत्काल जानकारी प्रदान कर सकते हैं, जिस पर नाभिक S-phase, लेबलिंग की एक छोटी नाड़ी का उपयोग कर रहे हैं । EdU भी गतिशील जानकारी प्रदान कर सकते हैं, पल्स चेस या सतत लेबल का उपयोग; उदाहरण के लिए, किसी पल्स-चेस प्रयोग में, लेबल प्रत्येक कोशिका प्रभाग में पतला होता है या विकास के माध्यम से विभाजित कोशिकाओं की प्रगति के रूप में प्रचारित किया जाता है.

सी एलिगेंस द्विलिंग germline संकेत मार्ग, स्टेम सेल, अर्धसूत्रीविभाजन, और कोशिका चक्र के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है । वयस्क germline स्टेम कोशिकाओं के साथ एक ध्रुवीय विधानसभा लाइन है meiotic चरण के माध्यम से प्रवेश और प्रगति के बाद बाहर के अंत में पाया, अधिक समीपस्थ gametogenesis के चरणों के साथ समंवित (चित्रा 1) । समीपस्थ अंत में, अंडाणुओं परिपक्व, ovulation और निषेचित कर रहे हैं और गर्भाशय9,10,11में embryogenesis शुरू करते हैं । ~ 20 सेल व्यास बाहर की नोक सेल है, जो mitotically सायक्लिंग germline स्टेम, जनक कोशिकाओं और meiotic एस चरण कोशिकाओं को शामिल नहीं है, लेकिन meiotic दौर में कोशिकाओं के पास लंबे क्षेत्र, जनक जोन2,4 कहा जाता है , 9 , 12. कोशिका झिल्ली बाहर germline में नाभिक के बीच अधूरा जुदाई प्रदान करते हैं, लेकिन जनक क्षेत्र कोशिकाओं mitotic सेल सायक्लिंग मोटे तौर पर स्वतंत्र रूप से गुजरना । युवा वयस्क hermaphrodites में germline जनक क्षेत्र कोशिकाओं के माध्य mitotic सेल चक्र अवधि ~ ६.५ ज है; G1 चरण संक्षिप्त या अनुपस्थित है, और quiescence1,2,13नहीं मनाया जाता है । Germline स्टेम सेल विभेद अनिवार्य रूप से प्रत्यक्ष भेदभाव के माध्यम से होता है और इस प्रकार पारगमन बढ़ाना विभाजन4का अभाव है । pachytene चरण में भेदभाव के दौरान, लगभग 5 नाभिक से बाहर 4 अंडाणुओं फार्म नहीं होगा, लेकिन इसके बजाय apoptosis से गुजरना, विकासशील cytoplasmic12,14 को उनके oocyte सामग्री दान द्वारा नर्स कोशिकाओं के रूप में अभिनय , 15.

nucleoside अनुरूप के साथ एस चरण में कोशिकाओं लेबलिंग के अलावा, एक बँटवारा और अर्धसूत्रीविभाजन में एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग कर कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं. बँटवारा में नाभिक विरोधी को immunoreactive हैं-phospho-हिस्टोन H3 (Ser10) एंटीबॉडी (आरक्षी pH3)७,१६. अर्धसूत्रीविभाजन में नाभिक विरोधी उसे immunoreactive हैं-3 एंटीबॉडी (एक meiotic गुणसूत्र अक्ष प्रोटीन)17. जनक जोन में नाभिक की अनुपस्थिति से उसकी पहचान की जा सकती है-3, nucleoplasmic आरईसी की उपस्थिति-818, या WAPL की उपस्थिति-119। WAPL-1 तीव्रता दैहिक gonad में सबसे अधिक है, जनक क्षेत्र में उच्च, और जल्दी meiotic19के दौर के दौरान कम । कई कोशिका चक्र माप प्रोटोकॉल में कुछ बदलाव के साथ संभव है: I) एस चरण और माप एस चरण सूचकांक में नाभिक की पहचान; II) एम-फेज में नाभिक की पहचान करना और एम-फेज इंडेक्स को मापने; III) निर्धारित करें कि क्या नाभिक mitotic या meiotic S-चरण में थे; IV) G2 की अवधि को मापने; V) G2 + M + G1 चरणों के duartion को मापने; VI) meiotic प्रवेश की दर को मापने; VII) meiotic प्रगति की दर का अनुमान ।

एक गीला प्रयोगशाला प्रयोगों के केवल कुछ ही प्रकार से कई सेल चक्र माप कर सकते हैं । नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है एक 30 मिनट के साथ एलिगेंस वयस्क hermaphrodites के साथ खिला सी. एम. के. -विरोधी जनक-1 WAPL के साथ दाग से एंटी-pH3 एंटीबॉडी और एंटीबॉडी क्षेत्र कोशिकाओं के साथ दाग द्वारा बैक्टीरिया और सह लेबल M-चरण कोशिकाओं लेबल । केवल EdU फ़ीड की अवधि में परिवर्तन (चरण २.५), कार्यरत एंटीबॉडी के प्रकार (चरण 5), और विश्लेषण (चरण ८.३) अतिरिक्त माप के लिए आवश्यक हैं ।

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Protocol

1. EdU-लेबल वाले बैक्टीरिया तैयार करना

  1. MG1693 की एक स्टार्टर संस्कृति बढ़ती है । ई कोलाई (ई. कोलाई) MG1693 thyA में एक उत्परिवर्तन किया जाता है ।
    1. एक जमे हुए ग्लिसरॉल शेयर से ई. कोलाई MG1693 एक १२० mm lysogeny शोरबा (पौंड) पेट्री डिश पर बाहर लकीर । ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति रातोंरात ।
    2. Inoculate दो व्यक्तिगत ई. कोलाई MG1693 कालोनियों से दो डुप्लिकेट 4 मिलीलीटर में तरल LB. Culture की ट्यूबों के लिए ३७ ° c ~ 16 एच ।
      नोट: MG1693 thymine या thymidine के साथ पूरक के बिना पौंड में ठीक बढ़ता है ।
  2. वृद्धि ई. EdU के साथ पूरक न्यूनतम मीडिया में कोलाई MG1693.
    1. आटोक्लेव एक ५०० मिलीलीटर शंकु कुप्पी ।
    2. उपयोग बाँझ तकनीक 20% ग्लूकोज की 5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, ५० μL के 10 मिलीग्राम/एमएल के thiamine, १२० μL के 5 मिमी thymidine, १०० μL के 1 मीटर MgSO के4, २०० μL के 10 मिमी EdU, १०० एमएल के M9 बफर, और 4 मिलीलीटर रात भर MG1693 संस्कृति के हौसले बढ़े ।
      नोट: EdU के अंतिम एकाग्रता इस संस्कृति1,7में 20 माइक्रोन है । यह एकाग्रता डीएनए क्षति और कोशिका चक्र गिरफ्तारी की ओर जाता है अगर संस्कृति20में स्तनधारी कोशिकाओं को सीधे लागू किया । हालांकि, केवल इस EdU का एक अंश ई. कोलाई में शामिल है और इस प्रकार सी. एलिगेंसके लिए उपलब्ध है । सेल साइकिल गिरफ्तारी का कोई सबूत नहीं है और युवा वयस्क hermaphrodites के EdU उपचार के बाद जनक जोन या एम-फेज इंडेक्स के आकार में कोई बदलाव नहीं हुआ है ।
    3. संस्कृति रातोंरात, लेकिन २०० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे से अधिक नहीं ।
  3. ध्यान EdU- ई. कोलाई लेबल और M9 आगार पेट्री व्यंजन लागू होते हैं ।
    1. पूर्व शांत 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक तालिका के ऊपर केंद्रापसारक ।
    2. 2-4 बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में संस्कृति हस्तांतरण करने के लिए बाँझ तकनीक का प्रयोग करें.
    3. 30 मिनट के लिए 4 ° c पर ३,००० x g पर संस्कृतियों के लिए EdU गोली- ई. कोलाईलेबल ।
      नोट: स्थानीय और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार EdU-युक्त supernatant का निपटारा ।
    4. ताजा M9 के 4 मिलीलीटर के साथ छर्रों resuspend । एक बाँझ का प्रयोग करें 1 मिलीलीटर प्लास्टिक टिप या एक बाँझ 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक प्लास्टिक. छर्रों resuspend कई मिनट लग सकते हैं ।
    5. एक ही प्लास्टिक का प्रयोग करें लागू करने और प्रसार ~ resuspend EdU के 8 बूंदें-लेबल ई. कोलाई MG1693 कमरे के केंद्र-तापमान ६० mm M9 पेट्री व्यंजन आगर । एक बैच पैदावार ~ 16 व्यंजन ।
    6. बर्तन कई घंटे या कमरे के तापमान पर रात भर के लिए शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं, तो प्रयोगशाला फिल्म की एक पट्टी के साथ प्रत्येक डिश सील । व्यंजन ~ 2 सप्ताह और 4 ° c के लिए ~ 2 महीने के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । प्रयोगों के प्रत्येक सेट के लिए EdU व्यंजन के एक ही बैच का उपयोग करें ।

2. C. एलिगेंस को पिलाना EdU

  1. समय पर अंडा देना द्वारा जनसंख्या सिंक्रनाइज़, क्षारीय हाइपोक्लोराइट उपचार एस में सेने के द्वारा पीछा किया, कोलेस्ट्रॉल के साथ मध्यम, या उपयुक्त मंच21उठा द्वारा । निमेटोड विकास मध्यम पर वांछित मंच (यहां, 24 एच पोस्ट-L4) के लिए जानवरों को विकसित 20 डिग्री सेल्सियस पर ई. कोलाई OP50 के साथ वरीयता प्राप्त ।
    नोट: प्रयोग के अनुसार 50-100 पशु तैयार, कुछ अच्छी तरह से काटना नहीं हो सकता है, और दूसरों को धोने और स्थानांतरित करने की प्रक्रिया में खो जाएगा ।
  2. EdU व्यंजन 20 ° c (या प्रयोग के लिए आवश्यक तापमान) को गर्म करने की अनुमति दें ।
  3. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में M9 या फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) का उपयोग कर NGM व्यंजन से जानवरों को धो लें । जानवरों के गुरुत्वाकर्षण या एक microcentrifuge में एक संक्षिप्त स्पिन द्वारा संक्षेप में बसने के लिए अनुमति दें ।
  4. supernatant को हटा दें और जानवरों को 1 – 2 बार M9 या पंजाबियों के ~ 1 मिलीलीटर से धो लें । supernatant निकालें ।
  5. एक ग्लास पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें EdU लॉन के केंद्र पर M9 या पंजाबियों की एक छोटी बूंद में पशुओं के हस्तांतरण के लिए । करने के लिए अवशोषित हो तरल के लिए कुछ मिनट रुको, तो 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर मशीन (प्रत्यक्ष एस चरण माप के लिए) या अब (s-चरण के इतिहास को मापने के लिए), के रूप में की जरूरत है ।
    नोट: edu संकेत germline नाभिक में के रूप में छोटे के रूप में 15 मिनट1खिलाने के बाद detectable है ।
  6. एक गिलास विदारक पकवान में M9 या पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ EdU डिश से कीड़े धो लें ।

3. C. एलिगेंस Germline का विच्छेदन और निर्धारण

नोट: विच्छेदन, निर्धारण, और सी. एलिगेंस द्विलिंग germline के एंटीबॉडी धुंधला के लिए यह प्रोटोकॉल लगभग है कि Gervaise और ारूर (२०१६)22, द्वारा प्रकाशित के अलावा कि 1 मिलीलीटर ग्लास ट्यूबों को गति केंद्रापसारक जा सकता है धुलाई कदम और एक खींचा हुआ कांच पाश्चर पिपेट से तरल निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 1 मिलीलीटर ग्लास ट्यूबों अधिक प्रभावी ढंग से ।

  1. धो व काटना ग. एलिगेंस germlines.
    1. पशु विदारक पकवान के नीचे बसने के लिए, केंद्र में जानवरों को इकट्ठा करने के लिए घूमता है, और एक लंबे पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए पंजाबियों को दूर करने की अनुमति दें । 1-2 बार ~ पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो लें ।
    2. पशुओं को स्थिर करने के लिए पंजाब के 2 मिलीलीटर और १०० mM levamisole के 4 μL जोड़ें । डिश के केंद्र में जानवरों को इकट्ठा करने के लिए फिर से पकवान भंवर ।
      नोट: स्थिरीकरण कुछ सेकंड और कुछ मिनट के बीच ले जा सकते हैं । सफल विच्छेदन के लिए पूर्ण स्थिरीकरण आवश्यक नहीं है । कुछ लोगों को पूर्णतः मैटीरियल पशु विदारक होने पर बेहतर सफलता मिलती है ।
    3. काटना 25G 5/8 की एक जोड़ी के साथ जानवरों को सिर पर काटने से सुई "(लगभग दो ग्रसनी बल्ब के बीच) या पूंछ । ध्यान रखें कि germline के लूप में कटौती न करें । आंत और germline आंतरिक दबाव के कारण शरीर गुहा के "बाहर पॉप" चाहिए, लेकिन संलग्न रहते हैं । यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित Gervaise और ारूर (२०१६)22के समान है ।
      नोट: विच्छेदन समय रखने के लिए ~ 5 मिनट, निश्चित रूप से अधिक से अधिक 15 मिनट. अब विच्छेदन बार एंटीबॉडी धुंधला संकेत (सुधीर नायक, व्यक्तिगत संचार) और पंजाब में भुखमरी के नुकसान में परिणाम हो सकता है जानवरों शरीर विज्ञान को प्रभावित कर सकते हैं । काटना को जल्दी और सही ढंग से सीखना कुछ अभ्यास ले सकता है ।
    4. यदि जरूरत हो तो केंद्र में विच्छेदित पशुओं को इकट्ठा करने के लिए घूमता है, और यथासंभव अधिक से अधिक पंजाबियों को हटाने के लिए एक लंबी पाश्चर पिपेट का उपयोग करें ।
  2. फिक्स और निर्जलीकरण के ऊतकों
    1. पंजाब के समाधान में 3% paraformaldehyde (पीएफए) के 2 मिलीलीटर जोड़ें । कवर एक बेंच पर प्रयोगशाला फिल्म और दुकान के साथ ढीला पकवान या 10 मिनट के लिए एक दराज में ।
      नोट: एक ३७ ° c पानी स्नान में गल पीएफए समाधान और फिर germlines विदारक करने से पहले कमरे के तापमान को शांत ।
      सावधानी: पीएफए समाधान मामूली विषैला और एक संभावित यलो और teratogen है । paraformaldehyde समाधान से उत्सर्जक वाष्प ज्वलनशील होते हैं. nitrile दस्ताने पहनें । एक रासायनिक धुएं हुड में 16% से 3% करने के लिए पीएफए पतला । जब धुएं हुड के बाहर काम कर रहे हैं, सभी कंटेनरों को कवर रखो ।
    2. gonads ध्यान से एक साफ करने के लिए स्थानांतरण 5 मिलीलीटर कांच केंद्रापसारक ट्यूब ।
    3. PBSTw के ~ 3 मिलीलीटर जोड़ें (०.१% के बीच के साथ पंजाब-20) पकवान है कि gonads निहित शेष gonads पुनः प्राप्त करने में मदद करने के लिए और पीएफए समाधान को पतला करने के लिए ।
    4. एक नैदानिक केंद्रापसारक में नीचे स्पिन ८७० x g के लिए ~ 1 मिनट । छोटे या छोटे जानवरों के पुराने या बड़े जानवरों की तुलना में अब स्पिन बार की आवश्यकता है ।
    5. एक लंबे गिलास पिपेट का प्रयोग, रासायनिक हुड में अवांछित सामग्री की बोतल में अंतिम त्याग के लिए अवांछित सामग्री चोंच के लिए supernatant हस्तांतरण ।
    6. उच्च ग्रेड मेथनॉल पूर्व ठंडा करने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस के 2 मिलीलीटर जोड़ें । कवर केंद्रापसारक ट्यूब प्रयोगशाला फिल्म के साथ कसकर ।
      नोट: ताजा उच्च ग्रेड "गोल्ड लेबल" मेथनॉल का उपयोग कुछ एंटीबॉडी के साथ उचित आकृति विज्ञान के लिए आवश्यक है ।
      चेतावनी: मेथनॉल एक अत्यधिक ज्वलनशील तरल और भाप है, कि विषाक्त अगर निगल लिया, सांस, या त्वचा से संपर्क करने की अनुमति दी । दस्ताने और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें । ज्वलनशीलता की छोटी मात्रा के लिए उपयुक्त एक फ्रीजर का उपयोग करें ।
    7. 1 घंटे, यहां तक कि रात या यहां तक कि कई महीनों के लिए-20 ° c फ्रीजर में स्टोर ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।

4. rehydrat Germlines

  1. PBSTw के साथ शीर्ष करने के लिए कांच केंद्रापसारक ट्यूब भरने के लिए मेथनॉल पतला और gonads rehydrat । एक नैदानिक केंद्रापसारक में नीचे स्पिन ८७० एक्स जी में ~ 1 मिनट के लिए ।
  2. एक लंबे ग्लास पाश्चर पिपेट का प्रयोग, रासायनिक हुड में अवांछित सामग्री की बोतल में अंतिम त्याग के लिए अवांछित सामग्री चोंच के लिए supernatant हस्तांतरण ।
  3. gonads 3 बार PBSTw के ~ 5 मिलीलीटर का उपयोग कर धो, एक नैदानिक केंद्रापसारक में नीचे कताई ८७० एक्स जी के लिए ~ 1 मिनट हर बार । supernatant निकालें ।
  4. कुल्ला एक छोटे से 1 मिलीलीटर borosilicate ग्लास ट्यूब और एक लंबे गिलास PBSTw के साथ पाश्चर पिपेट ।
  5. जोड़ें ~ ७०० PBSTw के μL और छोटे ट्यूब के लिए gonads को हस्तांतरित करने के लिए लंबे गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें । सभी gonads स्थानांतरित कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए PBSTw की कुछ अतिरिक्त बूंदों का उपयोग करें ।
  6. एक नैदानिक केंद्रापसारक में नीचे स्पिन ८७० x g के लिए ~ 1 मिनट । एक खींचा बाहर लंबे गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, gonads परेशान बिना संभव के रूप में के रूप में ज्यादा तरल निकालें । कोई ५० से अधिक μL छोड़ दें ।
    नोट: एंटीबॉडी डिटेक्शन आवश्यक नहीं है, तो चरण 6 पर जाएं ।

5. एंटीबॉडी के साथ एंटीजन का पता लगाने

  1. पंजाब में 30% सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला । वर्तमान उदाहरण में, anti-WAPL-1 एंटीबॉडी पतला है 1:2000 और एंटी-pH3 एंटीबॉडी 1:500 पतला है । २०,००० पर एक microfuge में 10 मिनट के लिए हौसले से गल सीरम केंद्रापसारक 4 डिग्री सेल्सियस पर जी कण को दूर करने के लिए । supernatant, जो कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता का उपयोग करें । माध्यमिक एंटीबॉडी के मेजबान जीव से मेल करने के लिए उपयुक्त सीरम का उपयोग करें (बकरी सीरम यहाँ इस्तेमाल किया जाता है). एक वैकल्पिक अवरुद्ध कदम प्राथमिक एंटीबॉडी के अलावा से पहले जोड़ा जा सकता है ।
  2. प्रत्येक छोटे ग्लास ट्यूब के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के १०० μL लागू करें । 4 एच के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    नोट: मशीन बार एंटीबॉडी के अनुसार बदलती हैं । कुछ एंटीबॉडी के लिए, कमरे के तापमान पर 2 ज पर्याप्त है । अब गर्मी (जैसे, रातोंरात) संभव हो रहे हैं, लेकिन पृष्ठभूमि में वृद्धि हो सकती है ।
  3. PBSTw के साथ शीर्ष करने के लिए ट्यूबों भरें और एक नैदानिक केंद्रापसारक में नीचे स्पिन ८७० एक्स जी के लिए ~ 1 मिनट ।
  4. धो gonads 3 बार ~ PBSTw के 1 मिलीलीटर ~ धोने प्रति 5 मिनट के लिए उपयोग करने के लिए अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी धोने में फैलाना करने के लिए अनुमति देते हैं । एक तैयार बाहर लंबे गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, gonads परेशान बिना संभव के रूप में के रूप में ज्यादा तरल निकालें । कोई ५० से अधिक μL छोड़ दें ।
  5. पंजाब में 30% बकरी सीरम में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला । वर्तमान उदाहरण में, बकरी-विरोधी खरगोश-५९४ और बकरी-विरोधी माउस-६४७ प्रत्येक 1:400 पर पतला कर रहे हैं ।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी सावधानीपूर्वक चुनें कि रंजक को EdU किट में डाई से अलग कर रहे हैं । वर्तमान उदाहरण में, EdU किट में ४८८ एनएम उत्तेजना डाई शामिल है ।
  6. पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के प्रत्येक छोटे गिलास ट्यूब के लिए १०० μL लागू करें । कमरे के तापमान पर अंधेरे में मशीन 2 एच ।
    नोट: मशीन बार एंटीबॉडी के अनुसार बदलती हैं । कुछ माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, कमरे के तापमान पर 1 ज पर्याप्त है । अब गर्मी (जैसे, रातोंरात) संभव हो रहे हैं, लेकिन पृष्ठभूमि में वृद्धि हो सकती है ।
  7. धो gonads 3 बार ~ PBSTw के 1 मिलीलीटर ~ धोने प्रति 5 मिनट के लिए उपयोग के लिए अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी धोने में फैलाना करने के लिए अनुमति देते हैं । एक तैयार बाहर लंबे गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, gonads परेशान बिना संभव के रूप में के रूप में ज्यादा तरल निकालें । कोई ५० से अधिक μL छोड़ दें ।
    नोट: Gonads इस कदम के बाद पंजाब के १०० μL में संग्रहित किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो, हालांकि इस संकेत को कम कर सकते हैं । आगे बढ़ने से पहले पंजाबियों को हटा दें ।

6. edu का पता लगाने के लिए edu क्लिक प्रतिक्रिया निष्पादित करें

नोट: एंटीबॉडी धुंधला चरण (चरण 5 से पहले चरण 6 निष्पादित) से पहले EdU क्लिक प्रतिक्रिया कर रहा है संभव है,7इस्तेमाल एंटीबॉडी के आधार पर । हालांकि, कुछ एंटीजन के साथ क्लिक रिएजेंट हस्तक्षेप हो सकता है (उदा, आरईसी-8 एंटीबॉडी निर्धारण और permeabilization के प्रति संवेदनशील है) । आदेश यहां प्रस्तुत की पैदावार उज्ज्वल एंटीबॉडी आरईसी के साथ धुंधला-8, WAPL-1, उसे-3, pH3, झंडा, और CYE-1 एंटीबॉडी इस्तेमाल किया, दूसरों के बीच में ।

  1. क्लिक करें EdU कॉकटेल8 ताजा करने के लिए एक साफ १.५ एमएल ट्यूब निंनलिखित जोड़कर तैयार करते हैं । परिवर्धन का क्रम महत्वपूर्ण है. प्रकाश से रक्षा और बर्फ पर सभी रिएजेंट बनाए रखने के । यह नुस्खा एक नमूना (१०० μL) के लिए पर्याप्त पैदावार; जरूरत के रूप में नुस्खा गुणा ।
    1. ultrapure पानी की 2 मिलीलीटर बफर additive के लिए जोड़ें । यह 10x बफर additive बनाता है, जो 1x को पतला किया जाना चाहिए तुरंत उपयोग करने से पहले ।
    2. ultrapure पानी के ७६.५ μL के लिए 10x बफर के ८.५ μL जोड़ें । अच्छी तरह मिलाएं ।
    3. १०० mM CuSO4 के 4 μL जोड़ें (घटक ई के रूप में चिह्नित किया जा सकता है) । अच्छी तरह मिलाएं ।
    4. ४८८ एनएम डाई Azide के ०.२५ μL जोड़ें । यह कमरे के तापमान पर गल जाना चाहिए, इसके विलायक, dimethyl sulfoxide के रूप में, 4 डिग्री सेल्सियस पर ठोस है । अच्छी तरह से मिलाएं और प्रकाश से रक्षा ।
    5. ट्यूब की टोपी में बफर additive के 1 μL के साथ ultrapure पानी की 9 μL मिश्रण । शेष कॉकटेल में जोड़ने के लिए कैप से प्लास्टिक, और ऊपर और नीचे pipetting करके अच्छी तरह मिलाएं ।
  2. EdU क्लिक करें प्रतिक्रिया करते हैं ।
    1. जोड़ें ~ १०० μL के लिए क्लिक करें EdU कॉकटेल के gonads में छोटे ट्यूब । प्रयोगशाला फिल्म के साथ कवर और कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए मशीन ।
    2. रिएक्शन कुल्ला बफर के १०० μL के साथ एक बार धो लें ।
    3. धो gonads 4 बार ~ PBSTw के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर के लिए ~ 15 मिनट धोने के लिए अतिरिक्त EdU कॉकटेल घटकों की अनुमति के लिए धोने में फैलाना । एक तैयार बाहर लंबे गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, gonads परेशान बिना संभव के रूप में के रूप में ज्यादा तरल निकालें । कोई ५० से अधिक μL छोड़ दें ।

7. दाग डीएनए और स्लाइड तैयार

  1. DAPI के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (gonads, डीएनए कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया) के साथ antifade बढ़ते मध्यम के 1 ड्रॉप (~ 25 μL) जोड़ें । कुछ मिनट रुको तो यह व्यवस्थित और gonads के साथ मिश्रण कर सकते हैं ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक 1:1000 कमजोर पड़ने के DAPI (एक ०.१ मिलीग्राम/एमएल स्टॉक से) में से 5 मिनट के लिए लागू किया जा सकता है, के बाद 20 μL के द्वारा 1, 4-diazabicyclo [ -8] ऑक् सीजन (DABCO) में ९०% ग्लिसरॉल, या किसी अंय antifade बढ़ते माध्यम ।
  2. एक मानक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक बड़े २.५% agarose पैड तैयार करें ।
  3. gonads को agarose पैड पर ट्रांसफर करने के लिए एक नया साफ डस्ट-फ्री लांग ग्लास पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें । gonads के नुकसान को कम करने के लिए पिपेट के संकरे तल में सभी लिक्विड और gonads को रखें ।
    नोट: Gonads छोटे ग्लास ट्यूब या लंबे गिलास पाश्चर पिपेट में फंस "PBSTw के साथ धोने के द्वारा बचाया" हो सकता है, एक विदारक पकवान में तरल इकट्ठा, और एक बरौनी के साथ स्लाइड पर व्यक्तिगत जानवरों उठा ।
  4. एक बरौनी का प्रयोग करें (या पतले बालों की एक पाश) एक दंर्तखोदनी से चिपके को agarose पैड पर gonads वितरित और धूल कणों को हटा दें ।
  5. एक आयताकार ग् coverslip लागू करें । हवा के बुलबुले से बचने के लिए एक तरफ से धीरे कम । एक ऊतक का प्रयोग करें इस प्रकार स्वतंत्र रूप से चलती से coverslip को रोकने अतिरिक्त समाधान को दूर करने के लिए ।
    नोट: coverslips चुनें कि माइक्रोस्कोप है कि इस्तेमाल किया जाएगा करने के लिए मैच । #1 और #1 .5 coverslips काम बखूबी करते हैं ।
  6. स्लाइड्स को व्यवस्थित करने और कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर थोड़ा रात भर सूखने की अनुमति दें । यह gonads को थोड़ा समतल करने में मदद करता है । स्लाइड 4 ° c पर संग्रहित होनी चाहिए ।
  7. वैकल्पिक: नेल पॉलिश या अन्य स्लाइड मुहर के साथ स्लाइड के किनारों को सील करें. पहले कोनों सील, तो पक्षों, स्थानांतरण से coverslip रोकता है ।

8. फोकल इमेजिंग और विश्लेषण

  1. छवि एक कताई डिस्क फोकल फ्लोरोसेंट एक उच्च ऊर्जा प्रकाश स्रोत, योजना apochromatic उद्देश्यों के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप के साथ बाहर gonad, और एक उच्च दक्षता माइक्रोस्कोप कैमरा । z-स्टैक के बीच 1 माइक्रोन या चुस्त रिक्ति के साथ छवियों पर कब्जा. लेजर शक्ति, संवेदनशीलता, और सभी चैनलों के लिए जोखिम समय का ध्यान रखें ।
    1. निंन का उपयोग करें: ४०५ एनएम लेजर लाइन उत्तेजना एक ४८५ एनएम (W60) DAPI के लिए उत्सर्जन फिल्टर के साथ, ४८८ एनएम लेजर लाइन उत्तेजना के लिए ५२७ एनएम (W55) उत्सर्जन फिल्टर के साथ, ५६१ एनएम लेजर लाइन उत्तेजना के लिए ६१५ एनएम (W70) उत्सर्जन फिल्टर के साथ WAPL-1, और एक ६४० एनएम लेजर लाइन excita pH3 के लिए ७०५ एनएम (W90) उत्सर्जन फिल्टर के साथ tion ।
      नोट: सिग्नल तीव्रता और पृष्ठभूमि तीव्रता भिन्न होगा. इसी तरह, आवश्यक जोखिम बार, संभवतः 10 गुना तक भिंन हो जाएगा ।
  2. सेल काउंटर प्लग का प्रयोग करें23 में फिजी24,25 में मैंयुअल रूप से प्रत्येक नाभिक गिनती । pH3, EdU, और WAPL-1 की उपस्थिति और अनुपस्थिति के अनुसार प्रत्येक व्यक्ति नाभिक को लेबल करें । के रूप में इन सभी नीचे उल्लिखित गणना की सुविधा होगी तालिका 1 और चित्रा 2में वर्णित नाभिक की कक्षाओं का उपयोग करें ।
    नोट: कुशल प्रायोगिक तौर पर डबल गिनती या किसी भी नाभिक लापता बिना एक 3 डी छवि में सभी नाभिक गिनती कर सकते हैं । एकांतर से, एक हर z-विमान में हर नाभिक गिनती कर सकते हैं, और अंक के लिए कोशिकाओं को आर स्क्रिप्ट3 गुणा गिने नाभिक हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. आवश्यक कक्ष चक्र माप के प्रकार के आधार पर उपरोक्त गणना से कक्ष संख्याओं और आवृत्तियों की गणना करें । नाभिक के प्रकार तालिका 1 और चित्रा 2में परिभाषित कर रहे हैं । गणना तालिका 2 में संक्षेप हैं ।
    1. (रूपांतर I) एस चरण में नाभिक की पहचान करने के लिए, 30 मिनट के लिए पशु EdU फ़ीड । किसी भी नाभिक प्रदर्शित EdU लेबल S-चरण नाभिक हैं । परिकलित करने के लिए, योग A और C नाभिक लें, तालिका 1 और आकृति 2देखें ।
      नोट: वाइल्ड-टाइप वयस्क hermaphrodites में 30 न्यूनतम edu पल्स में, सभी EdU लेबल नाभिक जनक ज़ोन मार्करों के साथ सह-लेबल किए गए हैं1.
    2. जनक ज़ोन को मापने के लिए, जनक ज़ोन मार्कर जैसे आरईसी-8 या WAPL-1 एंटीबॉडी के साथ दाग । जनक जोन सभी nucleoplasmic आरईसी-818 या WAPL-1 immunoreactive germline नाभिक के रूप में यहां परिभाषित किया गया है । गणना करने के लिए, सभी WAPL-1 immunoreactive नाभिक (A + B + C + D, तालिका 1 और आकृति 2देखें) का योग करें ।
      नोट: WAPL-1 भी डीटीसी और दैहिक gonad नाभिक जो गिना नहीं जाना चाहिए लेबल । दैहिक नाभिक अत्यंत तीव्र WAPL-1 संकेत द्वारा पहचान करने के लिए आसान कर रहे हैं, germline बाहर की स्थिति थोड़ा, और नाभिक के एक "तला हुआ अंडा" आकृति विज्ञान ।
    3. एस-चरण सूचकांक को मापने के लिए, आरईसी-8 या WAPL-1 एंटीबॉडी के साथ एक 30 न्यूनतम EdU प्रयोग और सह-लेबल निष्पादित करें । एस चरण सूचकांक जनक क्षेत्र है कि एस चरण में है के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है । परिकलित करने के लिए, सभी S-phase नाभिक की गणना करें, और फिर जनक ज़ोन नाभिक की कुल संख्या से भाग लें (a + c/a + B + c + D, देखें तालिका 1 और आकृति 2).
    4. (रूपांतर द्वितीय) एम चरण में नाभिक की पहचान करने के लिए, pH3 एंटीबॉडी के साथ दाग । अऩनी pH3 immunoreactive नाभिक हैं M चरण नाभिक । यह EdU फ़ीड की अवधि की परवाह किए बिना काम करता है । परिकलित करने के लिए, A और B नाभिक का योग लें, तालिका 1 और आरेख 2देखें.
      नोट: WAPL-1 भी डीटीसी और दैहिक gonad नाभिक जो गिना नहीं जाना चाहिए लेबल । दैहिक नाभिक अत्यंत तीव्र WAPL-1 संकेत द्वारा पहचान करने के लिए आसान कर रहे हैं, germline बाहर की स्थिति थोड़ा, और नाभिक के एक "तला हुआ अंडा" आकृति विज्ञान ।
    5. एम चरण सूचकांक, pH3 और आरईसी-8 या WAPL-1 एंटीबॉडी के साथ सह लेबल को मापने के लिए । एम चरण सूचकांक जनक क्षेत्र है कि एम चरण में है के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है । गणना करने के लिए, सभी एम चरण नाभिक गिनती, और फिर जनक जोन नाभिक की कुल संख्या से विभाजित (a + b/a + b + C + D, देखें तालिका 1 और आकृति 2) ।
    6. (भिन्नता III) नाभिक में mitotic और meiotic S-चरण दोनों लेबल EdU के साथ । दो आबादियों को अलग बताने के लिए यह तय करें कि एस-फेज का बँटवारा उसके बाद हुआ या अर्धसूत्रीविभाजन द्वारा. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या नाभिक mitotic या meiotic S-phase में हैं, pH3 के लिए 4 एच और सह-लेबल के लिए फ़ीड EdU (एक एम-चरण मार्कर) और उसे-3 (एक meiotic गुणसूत्र अक्ष प्रोटीन) द्वारा एंटीबॉडी धुंधलाना । नाभिक को रिकॉर्ड करें जो edu और pH3 को प्रदर्शित करता है (A, तालिका 1 और आरेख 2देखें) mitotic s-चरण के रूप में, जबकि नाभिक जो edu और उसे प्रदर्शित करते है-3 (प्रकार E, तालिका 1 और आकृति 2देखें) meiotic s-चरण के रूप में ।
    7. (भिन्नता IV) G2 चरण की अवधि की गणना.
      नोट: G2-चरण एम-चरण से S-चरण अलग करता है. हालांकि कोई मार्कर सी एलिगेंस germline में g2 लेबल की सूचना दी गई है, एक कई प्रयोगों से डेटा के संयोजन से g2 चरण की अवधि की गणना कर सकते हैं कि लेबल एम चरण (विच्छेदन के समय में) और एस चरण (से पहले कई एच पर शुरू विच्छेदन) । एम-फेज और एस-फेज मार्कर दोनों को प्रदर्शित करने वाला एक सेल प्रयोग के दौरान G2-चरण को पूरा करता है । केवल एम चरण मार्कर और नहीं एस चरण मार्कर प्रदर्शित करता है कि एक सेल प्रयोग के दौरान एस चरण में नहीं था.
      1. G2-चरण की अवधि की गणना करने के लिए, pH3 एंटीबॉडी के साथ 2 h और सह-लेबल के लिए फ़ीड EdU । नाभिक की उपस्थिति के लिए pH3 (ये एम-चरण में होते हैं) की जांच EdU (इन S-phase 2 h EdU लेबल के दौरान विच्छेदन करने से पहले) । एम-चरण नाभिक के अंश की गणना करें जो G2-चरण को पूरा करता है (a/a + B, देखें तालिका 1 और आकृति 2) ।
      2. इस प्रयोग को 3 एच edu लेबल के साथ और फिर 4 h edu लेबल (और वैकल्पिक रूप से 5 h edu लेबल) के साथ दोहराएं । pH3 धनात्मक नाभिक का प्रतिशत प्लॉट करें जो y-अक्ष पर धनात्मक है और x-अक्ष पर edu लेबल की अवधि, जैसा चित्र 3ए में दिखाया गया है ।
      3. के ग्राफ पर अंक जोड़ने और निर्धारित जहां लाइन ५०% पार, के रूप में चित्र 3ए में दिखाया द्वारा G2-चरण की औसत अवधि की गणना ।
      4. ग्राफ पर अंक जोड़ने और निर्धारित जहां लाइन ९९% पार, के रूप में चित्र 3ए में दिखाया द्वारा G2-चरण की अधिकतम अवधि की गणना ।
    8. (भिन्नता V) G2 + M + G1 के duraion की गणना करें ।
      नोट: C. एलिगेंस germline में, G1 चरण असामांय रूप से कम है । हालांकि कोई मार्कर सी. एलिगेंस germline में g1 लेबल करने के लिए सूचित किया गया है, एक g2, एम, और G1 चरण की राशि की अवधि का अनुमान है, और फिर g2-चरण समय ऊपर वर्णित के साथ इस समय की तुलना कर सकते हैं । G2 + M + G1 की अधिकतम अवधि का अनुमान सभी जनक ज़ोन नाभिक (WAPL-1 immunoreactive) के प्रतिशत से है, जो कई घंटों तक edu लेबलिंग के बाद (S-phase को नहीं बना) ।
      1. G2 + M + G1 की अवधि की गणना करने के लिए, 2 h और आरईसी-8 या WAPL-1 एंटीबॉडी के साथ सह-लेबल के लिए फ़ीड EdU । इस समय (a + c/a + B + c + D, देखें तालिका 1 और आकृति 2) के दौरान S-चरण जनक ज़ोन के अंश निर्धारित करें ।
      2. इस प्रयोग को 3 एच edu लेबल के साथ और फिर 4 h edu लेबल (और वैकल्पिक रूप से 5 h edu लेबल) के साथ दोहराएं । प्लॉट का प्रतिशत आरईसी-8 या WAPL-1 पॉजिटिव नाभिक है जो y-अक्ष पर और edu लेबल की अवधि x-अक्ष पर धनात्मक है, जैसा चित्र 3 बीमें दिखाया गया है ।
      3. ग्राफ़ पर बिंदुओं को कनेक्ट करके G2 + M + G1 की अधिकतम अवधि परिकलित करें और जहां रेखा ९९% को पार कर पा रही है, जैसा चित्र बीमें दिखाया गया है ।
        नोट: यह दोनों खरगोश-विरोधी WAPL-1 और माउस-विरोधी pH3 एंटीबॉडी के साथ सह-लेबल द्वारा 2, 3, 4 और 5 एच EdU प्रयोगों के एक एकल सेट के रूप में g2 और g2 + M + G1 की अवधि निर्धारित करने के लिए प्रयोगों को करने के लिए संभव है ।
    9. (भिन्नता VI) जनक ज़ोन में प्रतिकृति नाभिक की पहचान करने के लिए लेकिन के बाद से दर्ज किया गया अर्धसूत्रीविभाजन, 10 h और सह-लेबल के लिए पशु EdU आरईसी-8 या WAPL-1 एंटीबॉडी के साथ फ़ीड । उन 10 h के दौरान कोई भी नाभिक प्रदर्शन EdU लेबल S-चरण में थे । कोई भी नाभिक जो nucleoplasmic आरईसी-8 या WAPL-1 धुंधला प्रदर्शित न कर अर्धसूत्रीविभाजन में थे । बस EdU लेबलिंग के साथ नाभिक की गणना करें जो जनक ज़ोन मार्कर के साथ लेबलिंग प्रदर्शित न करे (E, तालिका 1देखें).
      नोट: इसके विपरीत, अगर gonads meiotic दौर उसे मार्कर-3 विरोधी उसे के साथ-3 एंटीबॉडी के लिए दाग रहे हैं, EdU लेबल है कि उसके लिए भी सकारात्मक है के साथ नाभिक की संख्या गिनती-3 ।
    10. meiotic प्रविष्टि की दर की गणना करने के लिए, एक 5 h, 10 h, और EdU के 15 h लेबल के साथ उपरोक्त प्रयोग करें । y-अक्ष पर अर्धसूत्रीविभाजन दर्ज किए गए नाभिक की संख्या और x-अक्ष पर EdU लेबल की अवधि, जैसा चित्र 3ए में दिखाया गया है, के रूप में प्लॉट करें । फिर ढलान (नाभिक दर्ज अर्धसूत्रीविभाजन प्रति h) से y = mx + b की गणना करने के लिए एक साधारण रेखीय प्रतीपगमन का उपयोग करें ।
      नोट: यह meiotic प्रविष्टि की दर की गणना करने के लिए एक रेखीय प्रतीपगमन का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह बस नाभिक कि EdU लेबल की अवधि के द्वारा अर्धसूत्रीविभाजन दर्ज की गई संख्या को विभाजित करने के लिए गलत होगा, क्योंकि y-अवरोधन शूंय नहीं है ।
    11. (भिन्नता VII) meiotic प्रगति की दर को मापने ।
      नोट: चूंकि EdU covalently डीएनए में शामिल किया जाता है, यह विभेद के माध्यम से कोशिकाओं की आबादी को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जनक ज़ोन में एस-चरण से गुजरने वाले कक्ष EdU लेबल को बनाए रखते हैं, क्योंकि वे अर्धसूत्रीविभाजन में प्रवेश करते हैं, अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से प्रगति करते हैं, और oogenesis से गुजरते हैं । EdU के साथ एक पल्स चेस प्रयोग meiotic प्रगति की दर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      1. फ़ीड EdU-4 ज ("पल्स") के लिए जानवरों को लेबल वाले बैक्टीरिया । ४८ ज ("चेस") के लिए unlabel्ड OP50 बैक्टीरिया के लिए पशुओं के हस्तांतरण, तो काटना और सह-लेबल ऐसे आरईसी के रूप में एक जनक क्षेत्र मार्कर के साथ-8 या WAPL-1 (या एक meiotic दौर मार्कर जैसे उसे-3) यदि वांछित ।
      2. जब इमेजिंग, सबसे समीपस्थ EdU-लेबल नाभिक की स्थिति के लिए देखो । meiotic प्रगति की दर दूरी (जनक क्षेत्र के अंत से सेल व्यास में) ४८ एच चेस के दौरान नाभिक लेबल सबसे समीपस्थ EdU द्वारा कूच है ।

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Representative Results

चूंकि डीएनए संश्लेषण को शामिल करने के लिए आवश्यक है, तो एक यह निष्कर्ष निकाल सकता है कि edu-लेबल नाभिक edu के समय विंडो के दौरान एस-चरण से गुजरा । एक नाभिक की व्याख्या कर सकते है कि एक 30 मिनट के साथ भोजन में नाभिक के रूप में एस-चरण में लेबल EdU के साथ खिला । लंबे समय तक सतत EdU प्रयोग में नाभिक उस लेबल का लेबल हो सकता है जो कि बार विंडो में है और बाएं S-चरण के बाद से, या हो सकता है कि EdU समय विंडो के उत्तरार्ध भाग में लेबल हो । EdU संकेत सह DAPI संकेत के साथ स्थानीयकरण । कुछ नाभिक में, edu संकेत सभी गुणसूत्रों को शामिल किया गया है, जबकि अन्य नाभिक EdU संकेत में 1 – 2 ब्राइट puncta (चित्रा 4) को स्थानीयकृत करता है । इन puncta की संभावना एक्स-गुणसूत्र है, जो एस-चरण13में देर से दोहराने की है ।

यहाँ, जानवरों के ऊपर और चित्रा 5में वर्णित के रूप में 30 मिनट और विच्छेदित के लिए लगातार EdU के साथ खिलाया गया । एक युवा वयस्क जानवर और एक पुराने वयस्क जानवर में धुंधला होने के असफल edu का एक उदाहरण में एक सफल edu का एक उदाहरण (नीचे देखें) चित्रा 4में दिखाया गया है । EdU संकेत एक 30 मिनट से जनक क्षेत्र में नाभिक के लगभग आधे करने के लिए लेबलिंग स्थानीयकरण (WAPL-1 एंटीबॉडी लेबलिंग द्वारा परिभाषित लेकिन DAPI आकृति विज्ञान26,27,28द्वारा अनुमानित). एस चरण सूचकांक, जनक क्षेत्र है कि सकारात्मक EdU के अनुपात, पहले ५७ ± 5% पर रिपोर्ट और युवा वयस्कों1,2,3में ७०% के रूप में उच्च के रूप में किया गया था । एम चरण सूचकांक लगभग 2-3%1,29है । 4 ज या उससे अधिक समय तक निरंतर खिलाने में, सभी नाभिक को EdU के साथ जनक ज़ोन लेबल में, और जनक ज़ोन में लेबल वाले कुछ नाभिक के बाद से meiotic चरण1दर्ज किया गया है ।

जबकि तकनीक जंगली प्रकार के युवा वयस्क पशुओं में लगातार काम करता है, के एक महत्वपूर्ण अंश 5 दिन पुराने hermaphrodites (यहां तक कि उन शुक्राणु युक्त) एक 30 ंयूनतम EdU पल्स में लेबल करने में विफल (चित्रा 4E) । हालांकि, एक 4 एच EdU खिलाने के साथ, लगभग इन सभी जानवरों लेबल । EdU की अल्प दालों के साथ आनुवंशिक मादा पशुओं में लेबल करने के लिए छिटपुट विफलता भी30बताया गया है । हो सकता है कि अंय स्थितियां लेबल में छिटपुट विफलता का परिणाम हो ।

प्रत्येक में pH3 लेबलिंग के साथ कई EdU-लेबलिंग प्रयोगों का प्रदर्शन करके एक सेल चक्र की अवधि की गणना कर सकते हैं । G2 की अवधि को एम-फेज (pH3 immunoreactive) में नाभिक के प्रतिशत का विश्लेषण करके अनुमान लगाया गया था जो टाइम कोर्स (फिगर 6) के दौरान सकारात्मक EdU थे. यह दृष्टिकोण G2 की औसत और अधिकतम अवधि (चित्रा 3ए) देता है । औसत समय दुओं था, युवा वयस्क hermaphrodites में २.५ एच के एक लगभग G2 अवधि दिखा । G2 + M + G1 की अवधि सभी जनक जोन नाभिक (WAPL-1 immunoreactive) के प्रतिशत से अनुमानित थी जो कि EdU सकारात्मक (चित्रा 6) थे । G2 + M + G1 विधि संयुक्त चरणों (चित्र बी) के लिए एक अधिकतम अवधि उपाय प्रदान करता है । 99th शतमक समय दुओं था, एक अनुमानित G2 + M + G1 अवधि ३.४ h के युवा वयस्क hermaphrodites में दिखा रहा है. उन्हीं प्रयोगों से डाटा meiotic एंट्री (नाभिक प्रति एच) की दर की गणना के लिए किया जाता था. यह दर EdU लेबल (चित्र 3) की अवधि से अधिक अर्धसूत्रीविभाजन (edu धनात्मक, WAPL-1 ऋणात्मक या उसे-3 धनात्मक) दर्ज किए गए नाभिक की संख्या के रेखीय प्रतीपगमन की ढलान है । वाइल्ड-टाइप 1 दिन पुराने वयस्क hermaphrodites के लिए मान तालिका 2में दिखाए जाते हैं ।

Figure 1
चित्र 1: C. एलिगेंस germline और कोशिका चक्र का आरेख । (क) युवा वयस्क द्विलिंग germline में रोगाणु कोशिकाओं का कोशिका चक्र होता है. संख्याएँ प्रत्येक कक्ष चक्र अवस्था में बिताए गए समय का अनुमानित प्रतिशत दर्शाती हैं. (B) C. एलिगेंस hermaphrodites के पास दो U-shaped germlines (लाल और नीला) है । spermatheca पीले रंग में दिखाया गया है और भ्रूण के विकास के साथ गर्भाशय डार्क ग्रे में दिखाया गया है । धराशायी नारंगी रेखा को इंगित करता है, जहां जानवरों germlines बाहर निकालना करने के लिए विच्छेदित कर रहे हैं । (ग) एक सामने आई सी. एलिगेंस germline का आरेख. DAPI (नीला) एक डीएनए डाई कि परमाणु आकृति विज्ञान पर प्रकाश डाला गया है । बाहर का जनक क्षेत्र (WAPL-1 एंटीबॉडी धुंधला के आधार पर लाल रंग में हाइलाइट) mitotically साइकिलिंग स्टेम सेल शामिल हैं, जनक कोशिकाओं, और कोशिकाओं meiotic S-चरण में (WAPL-1 भी शारीरिक gonad नाभिक लेबल) । 30 ंयूनतम EdU पल्स के साथ mitotic और meiotic S-चरण लेबल में कक्ष और हरे रंग में संकेत किए जाते हैं । pH3 एंटीबॉडी के साथ एम चरण लेबल में दो कोशिकाओं और काले रंग में दिखाया गया है । इन कोशिकाओं के स्टेम सेल भाग्य को बनाए रखने के लिए बाहर टिप सेल (DTC) जीएलपी-1/पायदान ligand प्रदान करता है । जैसे ही सेल DTC से दूर माइग्रेट करते हैं, वे जनक ज़ोन से बाहर निकल जाते है और meiotic चरण में प्रवेश करते हैं । spermatheca में पीत कोशिकाओं का शुक्राणु होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: नाभिक की कक्षाओं के वेन आरेख । नाभिक उपस्थिति और तीन मार्करों की अनुपस्थिति के द्वारा समूहीकृत होते हैं: WAPL-1 इंगित करता है कि जनक क्षेत्र कक्ष (लाल), EdU एस-चरण कक्षों (हरा) इंगित करता है, और pH3 M-चरण कक्षों (नीला) इंगित करता है । कक्ष प्रकार एक-Gके रूप में पहचाने जाते हैं । नोट करें कि वाइल्ड-टाइप युवा वयस्क प्रकार के hermaphrodites कक्षों में नहीं पाए जाते हैं, और कक्ष (WAPL-1 धनात्मक) जनक ज़ोन के बाहर EdU और pH3 के साथ सह-लेबल नहीं करते हैं । बाहर का gonad आरेख एक-E और G नाभिक का एक उदाहरण इंगित करता है । अधिक विवरण के लिए तालिका 1 देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल चक्र अवधि और meiotic प्रवेश प्रयोगात्मक डेटा की दर की चित्रमय प्रस्तुति । (A) G2 के चरण की अवधि pH3 और EdU सह-लेबलिंग से दुओं होती है, जो विभिंन-अवधि EdU दालों ग्रे लाइन्स interpolating माध्य और अधिकतम G2 अवधियों में प्रयुक्त 50 वीं और 99th शतमक इंगित करते हैं, जो तीरों द्वारा दर्शाया गया है । (B) G2, M, या G1 चरण में कोई कक्ष EdU को शामिल नहीं करता है । इस प्रकार, G2 + M + G1 चरण की अधिकतम अवधि को edu-ऋणात्मक कक्षों की पैदावार करने वाले edu लेबल की अधिकतम अवधि मापने से अनुमान लगाया जा सकता है । G2 + M + G1 चरण की अवधि edu और आरईसी-8 सह-लेबलिंग के बाद विविध-अवधि EdU दालों से दुओं है । धूसर रेखा एक तीर द्वारा दर्शाई गई interpolating अधिकतम G2 + M + G1 अवधि में उपयोग किए गए 99th शतमक को इंगित करती है. यह औसत G2 + एम + G1 अवधि लगाना करने के लिए संभव नहीं है । (C) meiotic प्रविष्टि की दर (नाभिक प्रति h – देखें तालिका 2) की गणना प्रतीपगमन रेखा के ढलान से की जाती है. ध्यान दें कि चूंकि y-अवरोधन अवरोधन शूंय नहीं है, एक प्रतीपगमन meiotic प्रविष्टि (C) की दर का एक सटीक परिकलन के लिए आवश्यक है । . त्रुटि पट्टियां मानक विचलन इंगित करती हैं । संशोधित आंकड़े और फॉक्स एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित । २०११1. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सफल और असफल 30 मिन EdU धुंधला का उदाहरण । एक 1 दिन पुराने (ए-डी) और एक 5 दिन पुराने (ई एच) द्विलिंग gonad (नहीं शुक्राणु समाप्त) एक 30 मिनट के बाद लेबलिंग प्रयोग के फोकल माइक्रोस्कोप छवियां । धराशायी सफेद लाइन जनक क्षेत्र के अंत के निशान । तारांकन चिह्न बाहर की नोक की स्थिति को चिह्नित करता है । हरे निशान EdU क्लिक रसायन विज्ञान (ए) द्वारा visualized धुंधला । निंन स्तर की पृष्ठभूमि धुंधला लेकिन कोई उज्जवल edu + नाभिक (E) में असफल edu लेबलिंग परिणाम । लाल निशान WAPL-1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस (बी, एफ) । पीला इंगित करता है ओवरलैप (C, G) । नीले निशान DAPI (डी, एच) डीएनए के लिए दाग । एकल ऐरोहेड EdU क्रोमेटिन भर में दाग के साथ एक नाभिक संकेत मिलता है । डबल ऐरोहेड केवल गुणसूत्रों की एक जोड़ी पर EdU puncta के साथ एक नाभिक संकेत मिलता है । छवियां एक 63X उद्देश्य के साथ प्राप्त किया गया । स्केल बार = 10 µm (D, H) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रायोगिक कार्यप्रवाह । प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का सारांश विकसित करने के लिए (a), EdU लेबल (B), काटना (C), एंटीबॉडी दाग़ (D), क्लिक करें प्रतिक्रिया करने के लिए एक डाई संलग्न करने के लिए edu (E), दाग डीएनए (F), छवि germlines (G), और मात्रा EdU लेबल और एंटीबॉडी सना हुआ नाभिक (H) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: सफल 4 एच EdU धुंधला का उदाहरण । 4 एच EdU लेबलिंग प्रयोग के बाद 1 दिन पुराने वयस्क द्विलिंग gonad की फोकल माइक्रोस्कोप छवियां । धराशायी सफेद लाइन जनक क्षेत्र के अंत के निशान । तारांकन चिह्न बाहर की नोक की स्थिति को चिह्नित करता है । रानी निशान pH3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस (ए, सी) । हरे निशान EdU क्लिक रसायन विज्ञान (बी, सी) द्वारा visualized धुंधला । लाल निशान WAPL-1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस (D) । पीला EdU और WAPL-1 (E) के ओवरलैप को इंगित करता है । नीले निशान DAPI (एफ) डीएनए के लिए दाग । एकल ऐरोहेड नाभिक और pH3 के साथ सह-लेबल इंगित करता है । डबल arrowhead एक pH3 + edu-नाभिक-एक 4 एच EdU लेबलिंग में एक दुर्लभ घटना के निशान । तीर मार्क EdU + WAPL-1-नाभिक जो अर्धसूत्रीविभाजन दर्ज किया है । छवियां एक 63X उद्देश्य के साथ प्राप्त किया गया । एक 10 µm स्केल पट्टी (F) दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मार्कर: pH3 EdU WAPL-1 या आरईसी-8 उसे-3
व्याख्या: बँटवारा एस-फेज * जनक जोन अर्धसूत्रीविभाजन
वर्ग: संयुक्त व्याख्या:
ए Symbol 1 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 एम चरण में, जनक क्षेत्र में, EdU लेबल के दौरान mitotic S-चरण में थे (पूर्ण G2)
बी Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 एम चरण में, जनक जोन में, EdU लेबल के दौरान एस चरण में नहीं थे
सी Symbol 2 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 जनक क्षेत्र में, चरण में, EdU लेबल के दौरान एस चरण में थे
डी Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 जनक ज़ोन में, चरण में, EdU लेबल के दौरान एस-चरण में नहीं थे
ई Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 अर्धसूत्रीविभाजन में, EdU लेबल (meiotic entry नाभिक) के दौरान meiotic S-चरण में थे
एफ Symbol 1 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 बँटवारा करने के लिए लौटें (कुछ म्यूटेंट में पाया) या meiotic डिवीजनों (शुक्राणुजनन में)
जी Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 अर्धसूत्रीविभाजन में, EdU लेबल के दौरान एस चरण में नहीं थे
सुँ कुल pH3 धनात्मक; एम-फेज में सभी सेल sum कुल EdU धनात्मक; S-चरण में सभी कक्ष योग कुल WAPL-1 धनात्मक;  जनक जोन के सभी कक्ष योग उसे कुल-3 सकारात्मक; meiotic चरण में सभी कक्ष

तालिका 1: नाभिक की कक्षाएं । * 30 मिनट और 4 एच EdU प्रयोगों व्याख्या में अलग है कि ध्यान दें । लंबी अवधि के प्रयोगों में, कोशिकाओं की संभावना एस चरण से परे प्रगति की है । प्रासंगिक प्रयोग के लिए EdU लेबलिंग की अवधि के लिए परिचय और चरण 8 देखें ।

सेल साइकिल भाग संचालन परिभाषा गणना मान * *
जनक जोन नाभिक सभी WAPL-1 (या आरईसी-8) पॉजिटिव, उसे-3 निगेटिव नाभिक A + B + C + D २३१ ± 23 नाभिक
एस-फेज नाभिक नाभिक edu 30 न्यूनतम edu लेबल और WAPL-1 पॉजिटिव के बाद पॉजिटिव क + ग १३३ ± 20 नाभिक
मी फेज नाभिक pH3 और WAPL-1 सह-पॉजिटिव नाभिक अ + ब ५.२ ± २.३ नाभिक
एस चरण सूचकांक S-phase नाभिक/जनक Zone नाभिक a + c/a + B + c + D सेल चक्र का ५७%
एम चरण सूचकांक M-phase नाभिक/जनक जोन नाभिक a + b/a + b + C + D सेल चक्र का 2%
Meiotic प्रवेश कक्ष EdU त्यसपछि नाभिक अर्धसूत्रीविभाजन ई EdU लेबल की अवधि के अनुसार भिंन होता है
Meiotic एंट्री रेट Meiotic के प्रति ज एंट्री नाभिक आकृति 4c से ढलान * * * २०.३ नाभिक प्रति ज
G2 अवधि (माध्य) ५०% Figure4A से अवरोधन २.५ ज
G2 अवधि (अधिकतम) ९९ आंकड़ा 4a से% अवरोधन ३.५ ज
G2 + M + G1 अवधि (अधिकतम) ९९ आंकड़ा 4B से% अवरोधन ३.५ ज
सेल चक्र अवधि (माध्य) माध्य g2 अवधि/g2-सूचकांक * * * * ६.५ ज
कक्ष चक्र अवधि (अधिकतम) अधिकतम g2 अवधि/g2-सूचकांक * * * * ८.१ ज

तालिका 2: कक्ष चक्र परिकलन । * पत्र तालिका 1 और चित्रा 3में परिभाषित नाभिक की कक्षाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । गणना फॉक्स एट अल से संशोधित कर रहे हैं । २०११1. * * मान (± मानक विचलन) जंगली प्रकार hermaphrodites के लिए उठाया 20 ° c आयु वर्ग के लिए 24 एच पोस्ट मध्य L4 चरण. ध्यान दें कि चूंकि y-अवरोधन अवरोधन शूंय नहीं है, एक प्रतीपगमन meiotic प्रविष्टि की दर का एक सटीक परिकलन के लिए आवश्यक है । G2-सूचकांक एस-चरण सूचकांक, एम चरण सूचकांक, और लगभग G1-सूचकांक (2%) १००% से घटाया द्वारा निर्धारित किया जाता है, के रूप में फॉक्स एट अल २०११1द्वारा वर्णित है ।

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Discussion

EdU-लेबल बैक्टीरिया (चरण 1) की तैयारी इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है, और समस्या निवारण के लिए पहला बिंदु । वाइल्ड-टाइप यंग एडल्ट hermaphrodites लेबल 4 एच EdU-पल्स में बहुत मज़बूती से, यह edu-लेबल वाले बैक्टीरिया के हर नए बैच के लिए उपयोगी नियंत्रण बना रहा है । इसके अतिरिक्त, बरकरार EdU-लेबल वाले बैक्टीरिया जो आंतों में प्रवेश करते हैं (पुराने जानवरों या कुछ ग्रसनी/चक्की दोषपूर्ण म्यूटेंट) पर क्लिक करें रसायन के साथ लेबल और आंत में उज्ज्वल आयताकार puncta के रूप में दिखाई देगा । hermaphrodites लेबलिंग के लिए एक वैकल्पिक तकनीक एक उच्च एकाग्रता (1 मिमी) के EdU3में एक "सोख" का उपयोग करता है । यह तकनीक लेबलिंग की अवधि के लिए जानवरों को भूखा रखती है, लेकिन समस्या निवारण निर्धारण और क्लिक करें रसायन विज्ञान को बनाने के लिए EdU-लेबल वाले बैक्टीरिया को बायपास करने के लिए एक उपयोगी तरीका प्रदान करता है । यदि edu फ़ीड नहीं है, जबकि एक edu "सोख" प्रयोग सफल होता है, तो नए edu-लेबल वाले बैक्टीरिया तैयार करें । एक उच्च edu सामग्री को प्राप्त करते हुए पर्याप्त जीवाणु घनत्व तक पहुंचने के लिए, एक को edu और thymidine की सांद्रता को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।

S-चरण के लेबलिंग के लिए इस तकनीक की मुख्य सीमा पशुओं को EdU-लेबल वाले बैक्टीरिया खिलाने की आवश्यकता है । जानवरों है कि (जीनोटाइप या मंच के कारण) फ़ीड नहीं इस तकनीक के साथ लेबल नहीं किया जा सकता है । फिर भी, nucleoside अनुरूप वर्तमान में सी. एलिगेंस germline में एस चरण नाभिक की पहचान करने के लिए एकमात्र तरीका है, और उनके उपयोग की आवश्यकता नहीं है कि किसी भी transgenes जानवरों में मौजूद हो । इसके अतिरिक्त, एक बार सम्मिलित, EdU नाभिक में भी रहता है क्योंकि वे कक्ष चक्र, विभाजन, या अंतर के माध्यम से एस-चरण, प्रगति से बाहर निकलते हैं । संकेत हर कोशिका विभाजन के साथ आधे से कमजोर है । यह एक सेल के इतिहास पर नज़र रखने के लिए EdU को भी कुछ सेल डिवीजनों के माध्यम से परिपूर्ण बनाता है ।

EdU की स्थिरता नाड़ी-चेस प्रयोगों को सरल बनाती है; बस वांछित अवधि पल्स समाप्त हो गया है के बाद जानवरों से अतिरिक्त EdU बैक्टीरिया कुल्ला और unlabel्ड बैक्टीरिया के लिए जानवरों का हस्तांतरण. EdU डीएनए में रहता है और कई सेल डिवीजनों के बाद भी दिखाई देता है । हालांकि, प्रयोग S-चरण लेबल (EdU की एक एकल पल्स) के एकल प्रकार तक सीमित होते हैं । EdU और BrdU के साथ सह-लेबल करना संभव है स्तनधारी कक्षों में31 लेकिन C. एलिगेंसमें रिपोर्ट नहीं किया गया है । इदु और CldU के सह लेबल स्तनधारी३२ में प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह भी सी एलिगेंसमें रिपोर्ट नहीं किया गया है ।

edu लेबलिंग का मुख्य लाभ यह है कि विधि को transgenes की आवश्यकता नहीं है, EdU को नियमित रूप से संस्कृति के दौरान C. एलिगेंस को खिलाया जा सकता है, रसायन विज्ञान immunofluorescent तकनीकों के साथ संगत है, और EdU भोजन के बाद लंबे समय तक डीएनए में बनी रहती है रोका. इन सुविधाओं को EdU सेल चक्र और रोगाणु कोशिका गतिशीलता के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक महान उपकरण बनाने ।

EdU के साथ सेल चक्र और रोगाणु कोशिका गतिशीलता विश्लेषण कई तरह के शोध प्रश्नों पर लागू किया जा सकता है । बस इस विधि के आगे अनुप्रयोगों के कुछ उदाहरण: कैसे सेल चक्र जीन उत्परिवर्तनों के साथ पशुओं में सेल चक्र परिवर्तन की गतिशीलता करते हैं? कैसे शारीरिक शर्तों स्टेम सेल में कोशिका चक्र को प्रभावित करते हैं, meiotic दौर में रोगाणु कोशिका प्रविष्टि की दर, और meiotic दौर के माध्यम से रोगाणु कोशिका प्रगति की दर? लार्वा विकास के दौरान कोशिका चक्र कैसे बदल जाता है? कैसे प्रमुख संकेतन मार्ग व्यवधान कोशिका चक्र को प्रभावित करते हैं, सेल भाग्य में परिवर्तन के अलावा (जैसे अस्थानिक प्रसार)? इस प्रणाली का अध्ययन करने के लिए क्या कोशिकाओं कई विभिंन स्थितियों में कर रहे है संशोधित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम MG1693 के लिए ई. कोलाई शेयर केंद्र के लिए आभारी हैं; Wormbase; Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र जो अनुसंधान के स्वास्थ्य कार्यालय के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित है अवसंरचना कार्यक्रम (P40OD010440) उपभेदों के लिए; सांख्यिकीय सलाह के लिए Zach Pincus; रिएजेंट के लिए Aiping फेंग; ल्यूक Schneider, Andrea Scharf, संदीप कुमार, और जॉन ब्रेनर प्रशिक्षण, सलाह, समर्थन, और उपयोगी चर्चा के लिए; और इस पांडुलिपि पर प्रतिक्रिया के लिए Kornfeld और Schedl लैब्स । इस काम के भाग में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था [R01 AG02656106A1 to केके, R01 GM100756 टू टीएस] और एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन डॉक्टरेट फैलोशिप [डीजीई-११४३९५४ और डीजीई-१७४५०३८ करने के लिए ZK]. न तो स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों और न ही राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के अध्ययन, संग्रह, विश्लेषण, और आंकड़ों की व्याख्या के डिजाइन में कोई भूमिका थी, और न ही पांडुलिपि लिखने में ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १४० C. एलिगेंस EdU s-चरण सेल चक्र Germline meiotic s-चरण M-चरण G2-चरण
Thymidine अनुरूप EdU के साथ <em>C. एलिगेंस</em> Germline में कक्ष चक्र विश्लेषण
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Kocsisova, Z., Mohammad, A.,… More

Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU. J. Vis. Exp. (140), e58339, doi:10.3791/58339 (2018).

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