Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Cellcykeln analys i den C. elegans könsceller med tymidin Analog EdU

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/58339
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 2
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Summary

En imaging-baserade metoden beskrivs som kan användas för att identifiera S-fas och analysera cellcykeln dynamik i den C. elegans hermafrodit könsceller med hjälp av tymidin analoga EdU. Denna metod kräver ingen transgener och är kompatibel med Immunofluorescerande färgning.

Abstract

Cellcykeln analys i eukaryota organismer använder ofta tredjeparts kromosom morfologi, uttryck och/eller lokalisering av genprodukter som krävs för olika faser av cellcykeln eller införlivandet av nukleosid analoger. Under S-fasen, DNA-polymerases införliva tymidin analoger såsom EdU eller BrdU kromosomala DNA, märkning cellerna för analys. För C. elegans, nucleoside analog EdU matas till maskar under regelbunden kultur och är kompatibel med Immunofluorescerande tekniker. Könsceller av C. elegans är en kraftfull modellsystem för studier av signalering vägar, stamceller, meios och cellen cyklar eftersom det är transparent, genetiskt lättköpt och meiotiska profas och cellulär differentiering/könscellsbildning förekommer i en montering-liknande linjärt. Dessa funktioner gör EdU ett bra verktyg att studera dynamiska aspekter av mitotiskt cykling celler och könsceller utveckling. Det här protokollet beskriver hur man framgångsrikt förbereda EdU bakterier, mata dem till vildtyp C. elegans hermafroditer, dissekera den hermafrodit gonad, fläckar för EdU iblandning i DNA, fläcken med antikroppar att upptäcka olika cellcykeln och utvecklingsmässiga markörer, bild gonad och analysera resultaten. Protokollet beskrivs variationerna i metod och analys för mätning av S-fas index, M-fas index, G2 varaktighet, cellcykelns längd, andelen meiotiska inträde och meiotiska profas progressionshastigheten. Denna metod kan anpassas för att studera cellcykeln eller cell historia i andra vävnader, stadier, genetiska bakgrunder och fysiologiska förhållanden.

Introduction

I djurens utveckling måste hundratals, tusentals, miljoner, miljarder, eller ens biljontals celldelningar bilda den vuxna organismen. Cellcykeln, uppsättningen cellulära händelser sammansatt av G1 (gap), S (syntes), G2 (gap), och M (Mitos) definiera serien av händelser som avrättas varje celldelning. Cellcykeln är dynamisk och bäst uppskattat i realtid, vilket kan vara tekniskt svårt. De tekniker som presenteras i detta protokoll tillåter en att göra mätningar av faser och timing av cellcykeln från stillbilder.

Märkning med nukleosid analoger såsom 5-ethynyl-2'-deoxiuridin (EdU) eller 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU) är den gyllene standarden att identifiera S-fas i studierna av cellcykeln dynamik i den Caenorhabditis elegans (C. elegans) vuxen hermafrodit könsceller1,2,3,4,5. Både EdU och BrdU kan användas i nästan alla genetiska bakgrund, som de inte lita på någon genetisk konstruktion. Visualisera BrdU kräver hård kemisk behandling att exponera antigenet för anti-BrdU-antikropp som färgning, och som ofta är oförenligt med bedömningen av andra cellulära markörer visualiseras genom samtidig färgning med ytterligare antikroppar. Däremot visualisera EdU sker genom att klicka på kemi under milda förhållanden och således är kompatibel med antikropp Co färgning6,7.

Noggrannheten av etiketten är tydlig, eftersom atomkärnor endast införliva de tymidin (5-ethynyl-2'-deoxiuridin) analoger DNA under S-fasen. Visualisering sker i fasta vävnad. EdU etiketten är osynliga i sig fram till en som innehåller natriumazid färgämne eller fluorophore reagerar kovalent med alkynen i EdU av koppar-katalyseras Klicka kemi8. EdU märkning kan ge omedelbar information som kärnorna är i S-fas, med en kort puls av märkning. EdU kan också ge dynamisk information, med puls-chase eller kontinuerlig märkning; till exempel i en puls-chase experiment, etiketten späds vid varje celldelning eller sprids som nondividing celler framsteg genom utveckling.

I C. elegans hermafrodit könsceller är en kraftfull modellsystem för studier av signalering vägar, stamceller, meios och cellcykeln. Den vuxna könsceller är en polariserad montering-line med stamceller som finns på den distala änden följt av intrade och progression genom meiotisk profas, samordnas med stadier av könscellsbildning mer proximalt (figur 1). På den proximala änden, oocyter mogen, är ägglossning och befruktas och påbörja embryogenes i livmodern9,10,11. ~ 20 cell-diameter lång regionen nära cellen distala spets, som omfattar mitotiskt cykling könsceller stammen, stamceller och meiotiska S-fas celler men inte cellerna i meiotiska profas, kallas stamceller zon2,4 , 9 , 12. cellmembranen ge ofullständig separation mellan atomkärnor i den distala könsceller, men de zon stamceller genomgå mitotiska cell cykling till stor del självständigt. Könsceller stamceller zon i unga vuxna hermafroditer varar median mitotiska cellcykelns ~6.5 h; G1-fasen är kort eller frånvarande, och rofylld inte iakttas1,2,13. Könsceller stamcellers differentiering sker genom i huvudsak direkt differentiering och därmed saknar transit-förstärkande divisioner4. Under differentiering i pachytene scenen, cirka 4 av 5 kärnor bildar inte oocyter men istället genomgå apoptos, agerar som sjuksköterska celler genom att donera sina cytoplasmiska innehållet till utveckla äggcellen12,14 , 15.

Förutom märkning celler i S-fas med nukleosid analoger, kan man identifiera cellerna i Mitos och meios använder antikropp färgning. Kärnorna i Mitos är immunreaktiva till anti-phospho-Histon H3 (Ser10) antikropp (kallas pH3)7,16. Kärnorna i meios är immunreaktiva till anti-honom-3 antikropp (meiotisk kromosomanalys axis protein)17. Kärnor i zonen stamceller kan identifieras genom avsaknad av HIM-3, förekomsten av nucleoplasmic REC-818eller förekomsten av WAPL-119. WAPL-1 intensitet är störst i den somatiska gonad, hög i den perifera zonen, och låg under tidig meiotiska prophases19. Flera cellcykeln mätningar är möjliga med några variationer i protokollet: jag) identifiera kärnor i S-fas och mäta S-fas index; (II) identifiera kärnor i M-fas och mäta indexet M-fas; (III) avgöra om kärnor var i mitotiskt eller meiotiska S-fas; IV) mäta längden på G2; V) åtgärd duartion G2 + M + G1 faser; VI) mäta graden av meiotiska inresa. VII) uppskatta graden av meiotiska progression.

Man kan göra flera cellcykeln mätningar från endast ett fåtal typer av våt-lab experiment. Protokollet nedan beskriver en 30 min puls märkning av utfodring C. elegans vuxen hermafroditer med EdU märkt bakterier och samtidig märkning M-fas celler genom färgning med anti-pH3 antikropp och perifera zonen celler genom färgning med anti-WAPL-1 antikroppar. Endast förändring varaktigheten av EdU foder (steg 2,5), typ av antikroppar sysselsatt (steg 5), och analyser (steg 8,3) krävs för ytterligare mätningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av EdU-märkt bakterier

  1. Växer en förrätt kultur av MG1693. Escherichia coli (E. coli) MG1693 bär en mutation i thyA.
    1. Strimma ut E. coli MG1693 från en fryst glycerol lager på en 120 mm lysogeny buljong (LB) agar petriskål. Kultur vid 37 ° C under natten.
    2. Inokulera från två enskilda E. coli MG1693 kolonier i två duplicera 4 mL tuber av flytande LB. kultur vid 37 ° C för ~ 16 h.
      Obs: MG1693 växer bra i LB utan komplettera med tymin eller tymidin.
  2. Växa E. coli MG1693 i minimal media kompletteras med EdU.
    1. Autoklav en 500 mL konisk kolv.
    2. Använd steril teknik för att lägga 5 mL av 20% glukos, 50 μL 10 mg/mL av tiamin, 120 μL av 5 mM tymidin, 100 μL av 1 M MgSO4, 200 μL 10 mM EdU, M9 buffert 100 mL och 4 mL färska odlade övernattning MG1693 kultur.
      Obs: EdU slutliga koncentration är 20 μM i denna kultur1,7. Denna koncentration leder till DNA skador och cellcykeln gripande om appliceras direkt på däggdjursceller i kulturen20. Dock införlivas bara en bråkdel av denna EdU i den E. coli och därmed tillgänglig för C. elegans. Det finns inga bevis för cellcykelarrest och ingen förändring i den perifera zonen eller M-fas index storlek efter EdU behandling av unga vuxna hermafroditer.
    3. Kultur över natten, men inte längre än 24 timmar vid 37 ° C under skakning på 200 rpm.
  3. Koncentrera sig EdU-märkt E. coli och gälla M9 agar petriskålar.
    1. Förväg kyla en bordsskiva centrifug till 4 ° C.
    2. Använd steril teknik för att överföra kulturen i 2 – 4 sterila 50 mL koniska rör.
    3. Centrifugera kulturer vid 3 000 x g vid 4 ° C i 30 min till pellet den EdU-märkt E. coli.
      Obs: Kassera EdU-innehållande supernatanten enligt lokala och institutionella riktlinjer.
    4. Återsuspendera pellets med 4 mL färsk M9. Använd en steril 1 mL Pipettera spets eller en steril 5 mL serologiska Pipettera. Omblandning pellets kan ta flera minuter.
    5. Använda den samma Pipettera att tillämpa och sprida ~ 8 droppar av återsuspenderade EdU-märkt E. coli MG1693 till mitten av rumstemperatur 60 mm M9 agar petriskålar. En batch ger ~ 16 rätter.
    6. Tillåta rätter att torka i flera timmar eller över natten i rumstemperatur och sedan försegla varje maträtt med en remsa av laboratoriet film. Rätter kan förvaras vid 15 ° C för ~ 2 veckor och vid 4 ° C för ~ 2 månader. Använd samma parti av EdU rätter för varje uppsättning experiment.

2. utfodring EdU C. elegans

  1. Synkronisera befolkningen genom tidsinställda ägg lekmanna, alkaliska hypoklorit behandling följt av kläckning till S-medium med kolesterol eller genom att plocka de lämpliga skede21. Växer djuren till önskad etapp (här, 24 h post-L4) på Nematoden odlingsmedium som ympats med E. coli OP50 vid 20 ° C.
    Obs: Förbereda 50 – 100 djur per experiment, som vissa inte kan dissekera väl, och andra kommer att gå förlorade i färd med att tvätta och överföra.
  2. Tillåta de EdU rätterna värmas till 20 ° C (eller den temperatur som krävs för experimentet).
  3. Tvätta djuren från NGM rätter med M9 eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i ett 1,5 mL rör. Att djuren att lösa kort genom gravitation eller en kort snurra i en mikrocentrifug.
  4. Avlägsna supernatanten och tvätta djuren 1 – 2 gånger med ~ 1 mL M9 eller PBS. Ta bort supernatanten.
  5. Använd ett glas Pasteur-pipett för att överföra djuren i en liten droppe M9 eller PBS på mitten av EdU gräsmattan. Vänta några minuter för att vätskan absorberas och inkubera vid 20 ° C i 30 min (för S-fas direktmätning) eller längre (att mäta historia av S-fas), som behövs.
    Obs: EdU signal detekteras i könsceller kärnor efter så lite som 15 min för EdU utfodring1.
  6. Tvätta EdU skålen med ~ 2 mL M9 eller PBS i ett glas dissekera maträtt maskar.

3. dissektion och fixering av C. elegans könsceller

Obs: Detta protokoll för dissektion, fixering och antikropp färgning av den C. elegans hermafrodit könsceller är nästan identisk med den utgiven av Gervaise och Arur (2016)22, förutom att 1 mL glas rören kan vara centrifugeras för att påskynda tvätt steg och en utdragen glas Pasteur-pipett kan användas för att ta bort vätskan från 1 mL glasrör mer effektivt.

  1. Tvätta och dissekera C. elegans germlines.
    1. Att djuren sedimentera till botten av dissekera skålen, virvel att samla djuren i centrum, och använda en lång Pasteur-pipett ta bort PBS. Tvätta 1 – 2 gånger med ~ 2 mL PBS.
    2. Tillsätt 2 mL PBS och 4 μL av 100 mM Levamisol att immobilisera djuren. Snurra skålen igen för att samla in djuren i mitten av skålen.
      Obs: Immobilisering kan ta mellan några sekunder och några minuter. Komplett immobilisering är inte nödvändigt för framgångsrik dissektion. Vissa människor har bättre framgång när dissekera ofullständigt orörlig djur.
    3. Dissekera djur med ett par 25G 5/8 ”nålar genom att skära på huvudet (ungefärligt mellan två faryngala lökarna) eller svansen. Se till att inte skära slingan av könsceller. Tarmen och könsceller ska ”lossna” av kroppen hålighet på grund av inre tryck, men sitta kvar. Detta protokoll är liknar tidigare publicerade Gervaise och Arur (2016)22.
      Obs: Hålla dissektion tiden till ~ 5 min, absolut inte mer än 15 min. längre dissektion gånger kan resultera i förlust av antikropp färgning signal (Sudhir Nayak, personlig kommunikation) och svält i PBS kan påverka djurens fysiologi. Lära sig att dissekera snabbt och korrekt kan ta lite övning.
    4. Om det behövs, snurra för att samla in dissekerade djuren i mitten, och använda en lång Pasteur-pipett för att ta bort så mycket PBS som möjligt.
  2. Fixa och torkar vävnader
    1. Tillsätt 2 mL 3% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS lösning. Täck skålen löst med laboratorium film och store på en bänk eller i en låda för 10 min.
      Obs: Tina PFA lösning i en 37 ° C vatten bad och sedan svalna till rumstemperatur innan dissekera germlines.
      Varning: PFA lösningen är måttligt giftiga och en trolig cancerframkallande och teratogen. Ångorna som avger från PARAFORMALDEHYD lösningar är brandfarliga. Nitrilhandskar. Späd PFA från 16% till 3% i kemiska dragskåp. När du arbetar utanför dragskåp, hålla alla behållare som omfattas.
    2. Överföra könskörtlarna noggrant till en ren 5 mL glas centrifugrör.
    3. Tillsätt ~ 3 mL PBSTw (PBS med 0,1% Tween-20) i skålen som innehöll könskörtlarna för att hämta resterande gonader och späd PFA lösningen.
    4. Varva ner i en klinisk centrifug på 870 x g för ~ 1 min. yngre eller mindre djur kräver längre spin gånger än äldre eller större djur.
    5. Med långa glas pipett överför supernatanten till oönskade material bägare för eventuell kassera i oönskade material flaska i kemiska huven.
    6. Tillsätt 2 mL av high-grade metanol pre kylas ned till-20 ° C. Täcka centrifugalröret tätt med laboratorium film.
      Obs: Användning av färska high-grade ”gold label” metanol är viktigt för korrekt morfologi med vissa antikroppar.
      FÖRSIKTIGHET: Metanol är en mycket brandfarlig vätska och ånga, som är giftigt vid förtäring, inandning eller tillåtet för att kontakta hud. Använd skyddshandskar och lämplig personlig skyddsutrustning. Använd en frys som är lämpliga för små volymer av brandfarliga ämnen.
    7. Förvaras i-20 ° C frys för 1 h, även över natten eller även flera månader.
      Obs: Protokollet kan pausas här.

4. Rehydrera Germlines

  1. Fyll glas centrifugeringsröret till toppen med PBSTw till utspädd metanol och rehydrera könskörtlarna. Snurra ner i en klinisk centrifug på 870 x g för ~ 1 min.
  2. Använder en lång glas Pasteur-pipett, överför supernatanten till oönskade material bägare för eventuell kassera i oönskade material flaska i kemiska huven.
  3. Tvätta könskörtlarna 3 gånger med ~ 5 mL PBSTw, snurrar ner i en klinisk centrifug på 870 x g för ~ 1 min varje gång. Ta bort supernatanten.
  4. Skölj en liten 1 mL borosilikatglas rör och en lång glas Pasteur-pipett med PBSTw.
  5. Tillsätt ~ 700 μL av PBSTw och använda det långa glaset Pasteur-pipett för att överföra könskörtlarna till små röret. Använda några extra droppar av PBSTw för att se till att alla gonader överförs.
  6. Snurra ner i en klinisk Centrifugera vid 870 x g för ~ 1 min. med en utdragen långa glas Pasteur-pipett, ta bort så mycket vätska som möjligt utan att störa könskörtlarna. Lämna mer än 50 μL.
    Obs: Om påvisande av antikroppar inte är nödvändigt, hoppa till steg 6.

5. identifiera antigener med antikroppar

  1. Späd de primära antikropparna i 30% serum i PBS. I det aktuella exemplet, anti-WAPL-1-antikroppar är utspädda 1:2,000 och anti-pH3 antikropp är utspädd 1: 500. Centrifugera nymalen tinade serum för 10 min i en microfuge på 20 000 x g vid 4 ° C att ta bort partiklar. Använd supernatanten, som kan lagras vid 4 ° C i flera dagar. Använd lämpligt serum för att matcha värd organismen av sekundära antikroppar (Get serum används här). Ett valfritt blockerande steg kan läggas före tillsats av primära antikroppar.
  2. Gälla varje litet glasrör 100 μL av utspädda primär antikropp. Odla i rumstemperatur i 4 h.
    Obs: Inkubationstider variera av antikropp. För vissa antikroppar räcker 2 h i rumstemperatur. Längre inkubationer (t.ex., övernattande) är möjliga, men kan öka bakgrunden.
  3. Fyll rören för att toppa med PBSTw och snurra ner i en klinisk Centrifugera vid 870 x g för ~ 1 min.
  4. Tvätta könskörtlarna 3 gånger med ~ 1 mL PBSTw. Inkubera i ~ 5 min per tvätt så att överflödig primär antikropp till diffunderar in tvätt. Med hjälp av en segdragen länge glas Pasteur-pipett, ta bort så mycket vätska som möjligt utan att störa könskörtlarna. Lämna mer än 50 μL.
  5. Späd de sekundära antikropparna i 30% get serum i PBS. I det aktuella exemplet, är get-anti-kanin-594 och get-anti-mus-647 varje utspätt till 1: 400.
    Obs: Välj sekundära antikroppar noggrant för att kontrollera färgämnen är åtskild från färgämnet i EdU kit. I det aktuella exemplet innehöll EdU kitet ett 488 nm excitation färgämne.
  6. 100 μL av utspädda sekundär antikropp gälla varje litet glasrör. Inkubera i mörker vid rumstemperatur 2 h.
    Obs: Inkubationstider variera av antikropp. För vissa sekundära antikroppar räcker 1 tim i rumstemperatur. Längre inkubationer (t.ex., övernattande) är möjliga, men kan öka bakgrunden.
  7. Tvätta könskörtlarna 3 gånger med ~ 1 mL PBSTw. Inkubera i ~ 5 min per tvätt så att överflödig sekundära antikroppar mot diffunderar in tvätt. Med hjälp av en segdragen länge glas Pasteur-pipett, ta bort så mycket vätska som möjligt utan att störa könskörtlarna. Lämna mer än 50 μL.
    Obs: Gonader kan lagras i 100 μL av PBS efter detta steg, om nödvändigt, även om detta kan minska signal. Ta bort PBS innan du fortsätter.

6. utföra EdU Klicka reaktionen för att upptäcka EdU

Obs: Utför EdU är Klicka reaktion innan antikroppen färgning steg (utföra steg 6 före steg 5) möjligt, beroende på antikroppar används7. Klicka reagenser kan dock störa vissa antigener (t.ex., REC-8 antikropp är känslig för fixering och permeabilisering). Den ordning som presenteras här ger ljusa antikropp färgning med REC-8, WAPL-1, HIM-3, pH3, flagga och CYE-1 antikroppar används, bland annat.

  1. Förbereda klicket EdU cocktail8 fräscha genom att lägga till följande till en ren 1,5 mL tub. Ordningen på tillägg är viktigt. Ljuskänsligt och underhålla alla reagens på is. Detta recept ger nog för ett prov (100 μL); multiplicera receptet efter behov.
    1. Tillsätt 2 mL av ultrarent vatten till bufferten additiv. Detta gör 10 x buffert additiva, vilket måste spädas till 1 x omedelbart före användning.
    2. Tillsätt 8,5 μl 10 x buffert till 76,5 μL av ultrarent vatten. Blanda väl.
    3. Tillsätt 4 μL av 100 mM CuSO4 (kan vara märkt som komponent E). Blanda väl.
    4. Tillsätt 0,25 μL av 488 nm färgämnet natriumazid. Det måste tinas i rumstemperatur, eftersom dess lösningsmedel, dimetyl sulfoxid, är fasta vid 4 ° C. Blanda väl och ljuskänsligt.
    5. Mix 9 μl ultrarent vatten med 1 μL av bufferten tillsats i locket på röret. Pipettera från den gemensamma jordbrukspolitiken att lägga till de återstående cocktailen, och blanda väl genom pipettering upp och ner.
  2. Utföra EdU Klicka reaktionen.
    1. Lägga till ~ 100 μL av Klicka EdU cocktail i könskörtlarna i små röret. Täck med laboratorium film och inkubera i 30-60 min i rumstemperatur.
    2. Tvätta en gång med 100 μL av reaktion skölj buffert.
    3. Tvätta könskörtlarna 4 gånger med ~ 1 mL PBSTw. Inkubera för ~ 15 min per tvätt för att tillåta EdU cocktail överskottskomponenter till diffunderar in tvätt. Med hjälp av en segdragen länge glas Pasteur-pipett, ta bort så mycket vätska som möjligt utan att störa könskörtlarna. Lämna mer än 50 μL.

7. färga DNA och förbereda bilder

  1. Tillsätt 1 droppe (~ 25 μL) av antifade monteringsmedium med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, används för att visualisera DNA) till könskörtlarna. Vänta några minuter så det kan kvitta och blanda med könskörtlarna.
    Obs: Alternativt en 1:1,000 utspädning av DAPI (lagervara en 0,1 mg/mL) i PBS får tillämpas för 5 min, följt av 20 μL av 1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktan (DABCO) i 90% glycerol eller en annan antifade monteringsmedium.
  2. Förbereda en stor 2,5% agaros pad på ett standardglas objektglas.
  3. Använd en ny ren dammfri långa glas Pasteur-pipett att överföra könskörtlarna till agaros pad. Hålla alla flytande och gonader smala längst ned i pipetten att minimera förlusten av könskörtlarna.
    Obs: Gonader fastnat på små glasrör eller i långa glas Pasteur-pipett kan ”räddas” genom sköljning med PBSTw, samlar vätskan i en dissekera maträtt och plocka enskilda djur in i bilden med en ögonfrans.
  4. Använd en ögonfrans (eller en slinga av tunna hår) limmade till en tandpetare för att fördela könskörtlarna över agaros pad och ta bort dammpartiklar.
  5. Applicera en rektangulär täckglas. Lägre långsamt från ena sidan för att undvika luftbubblor. Använda en vävnad att ta bort överflödig lösning vilket förhindrar täckglaset från att röra sig fritt.
    Obs: Välj coverslips som matchar till mikroskopet som ska användas. #1 och #1.5 coverslips fungerar bra.
  6. Låt bilderna ska bosätta sig och torka något över natten vid rumstemperatur eller 4 ° C. Detta bidrar till något platta könskörtlarna. Bilder ska förvaras vid 4 ° C.
  7. Tillval: Försegla kanterna av bilden med nagellack, eller en annan bild sealer. Tätning hörnen först, sedan sidorna, förhindrar täckglaset skiftande.

8. confocal Imaging och analys

  1. Bild den distala gonad med en snurrande skiva confocal fluorescerande Mikroskop utrustat med en hög energi ljuskälla, plan-apokromatiska mål och en kamera med hög effektivitet i mikroskopet. Fånga bilder med 1 μm eller tätare mellanrum mellan z-stackar. Ta del av laser power, känslighet och exponering tid för alla kanaler.
    1. Använd följande: 405 nm laser linje excitation med 485 nm (W60) utsläpp filter för DAPI, 488 nm laser linje excitation med 527 nm (W55) utsläpp filter för EdU, 561 nm laser linje excitation med en 615 nm (W70) utsläpp filter för WAPL-1 och en 640 nm laser line excita tion med 705 nm (W90) utsläpp filter för pH3.
      Obs: Signalintensitet och bakgrunden intensitet varierar. Likaså varierar krävs exponeringstider, eventuellt upp till 10-faldig.
  2. Använd den Cell Counter plug-in23 i Fiji24,25 manuellt räkna varje kärna. Märk varje enskilda nucleus enligt närvaro och frånvaro av pH3, EdU och WAPL-1. Använda klasserna av atomkärnor beskrivs i tabell 1 och figur 2, som dessa kommer att underlätta alla beräkningar som beskrivs nedan.
    Obs: Skickliga experimentalister kan exakt räkna alla atomkärnor i en 3D-bild utan dubbelräkning eller saknas några kärnor. Omväxlande, man kan räkna med att varje kärna i varje z-planet och märken-till-celler R script3 kan användas för att ta bort multiplicera-räknat atomkärnor.
  3. Beräkna cell nummer och frekvenser från ovan räknas beroende på vilken typ av cellcykeln mätning behövs. Typerna av kärnor definieras i tabell 1 och figur 2. Beräkningarna sammanfattas i tabell 2.
    1. (Variation jag) För att identifiera atomkärnor i S-fas, mata djuren EdU i 30 min. Alla kärnorna Visa EdU etikett är S-fas atomkärnor. För att beräkna, ta summan A och C atomkärnor, se tabell 1 och figur 2.
      Obs: I en 30 min EdU pulse i vildtyp vuxen hermafroditer, alla EdU märkt kärnor är samtidig märkta med stamceller zon markörer1.
    2. För att mäta den perifera zonen, fläcken med en stamfader zon markör såsom REC-8 eller WAPL-1 antikroppar. Den perifera zonen definieras här som alla nucleoplasmic REC-818 eller WAPL-1 immunreaktiva könsceller atomkärnor. För att beräkna, summera alla WAPL-1 immunreaktiva atomkärnor (A + B + C + D, se tabell 1 och figur 2).
      Obs: WAPL-1 etiketter också de DTC och somatiska gonad kärnor som inte bör räknas. Somatiska kärnor är lätta att identifiera genom extremt intensiva WAPL-1 signal, position något utanför könsceller, och en ”stekt ägg” morfologi av atomkärnor.
    3. För att mäta S-fas index, utföra en 30 min EdU experiment och co etikett med REC-8 eller WAPL-1 antikroppar. S-fas index definieras som andelen zonen stamceller som finns i S-fas. För att beräkna, räkna alla S-fas atomkärnor, och sedan dividera med det totala antalet stamceller zon atomkärnor (A + C / A + B + C + D, se tabell 1 och figur 2).
    4. (Variation II) För att identifiera atomkärnor i M-fas, fläcken med pH3 antikropp. Några pH3 immunreaktiva kärnorna är M-fas atomkärnor. Detta fungerar oavsett löptid EdU foder. För att beräkna, ta summan av A och B kärnor, se tabell 1 och figur 2.
      Obs: WAPL-1 etiketter också de DTC och somatiska gonad kärnor som inte bör räknas. Somatiska kärnor är lätta att identifiera genom extremt intensiva WAPL-1 signal, position något utanför könsceller, och en ”stekt ägg” morfologi av atomkärnor.
    5. För att mäta indexet M-fas, Co etikett med pH3 och REC-8 eller WAPL-1 antikroppar. M-fas index definieras som andelen zonen stamceller som finns i M-fas. För att beräkna, räkna alla M-fas atomkärnor, och sedan dividera med det totala antalet stamceller zon atomkärnor (A + B / A + B + C + D, se tabell 1 och figur 2).
    6. (Variant III) Kärnor i mitotiska och meiotiska S-fas etikett både med EdU. För att säga de två populationerna apart, avgöra huruvida den S-fas följdes av Mitos eller meios. För att avgöra om kärnor i mitotiskt eller meiotiska S-fas, foder EdU för 4 h och co etikett för pH3 (en M-fas markör) och HIM-3 (meiotisk kromosomanalys axis protein) av antikropp färgning. Spela in atomkärnor som visar både EdU och pH3 (typ A, se tabell 1 och figur 2) som mitotiska S-fas medan atomkärnor som visar både EdU och HIM-3 (typ E, se tabell 1 och figur 2) som meiotiska S-fas.
    7. (Variation IV) Beräkna tiden för G2-fasen.
      Obs: G2-fasen skiljer S-fas från M-fas. Även om ingen markör har rapporterats till etikett G2 i den C. elegans könsceller, kan man beräkna varaktigheten av G2 fas genom att kombinera data från flera experiment som etikett M-fasen (vid tidpunkten för dissektion) och S-fas (börjar på flera timmar före dissektion). En cell som visar både M-fas och S-fas markörer avslutade G2-fasen under experimentet. En cell som visar endast M-fas markören och inte S-fas markören var inte i S-fas under experimentet.
      1. För att beräkna tiden för G2-fasen, mata EdU 2 h och co etikett med pH3 antikropp. Granska endast kärnor som etikett med pH3 (dessa är i M-fas vid tidpunkten för dissektion) för förekomst av EdU (dessa var i S-fas under 2 h EdU etiketten före dissektion). Beräkna fraktionen av M-fas atomkärnor som slutförts G2-fasen (A / A + B, se tabell 1 och figur 2).
      2. Upprepa detta experiment med en 3 h EdU etikett, och igen med en 4 h EdU etikett (och eventuellt en 5 h EdU etikett). Rita procenten av pH3 positiva kärnor som är EdU positiva på y-axeln och varaktigheten av EdU etikett på x-axeln, som visas i figur 3A.
      3. Beräkna mediantiden för G2-fasen genom att ansluta punkterna på grafen och bestämma där linjen korsar 50%, som visas i figur 3A.
      4. Beräkna den maximala längden på G2-fasen genom att ansluta punkterna på grafen och bestämma där linjen korsar 99%, som visas i figur 3A.
    8. (Variation V) Beräkna varaktigheten av G2 + M + G1.
      Obs: I den C. elegans könsceller, G1 fas är ovanligt kort. Även om ingen markör har rapporterats att märka G1 i den C. elegans könsceller, kan en beräkna summan varaktigheten av G2, M och G1 fas och jämför sedan denna tid med G2-fasen tiden beskrivs ovan. Maximat varaktighet av G2 + M + G1 beräknas från den procentandel av alla perifera zonen atomkärnor (WAPL-1 immunreaktiva) som återstår EdU negativ (inte genomgå S-fas) efter EdU märkning i flera timmar.
      1. För att beräkna varaktigheten av G2 + M + G1, foder EdU för 2 h och co etikett med REC-8 eller WAPL-1 antikroppar. Fastställa andelen av den perifera zonen som genomgick S-fas under denna tid (A + C / A + B + C + D, se tabell 1 och figur 2).
      2. Upprepa detta experiment med en 3 h EdU etikett, och igen med en 4 h EdU etikett (och eventuellt en 5 h EdU etikett). Rita procenten av REC-8 eller WAPL-1 positiva kärnor som är EdU positiva på y-axeln och varaktigheten av EdU etikett på x-axeln, som visas i figur 3B.
      3. Beräkna den maximala längden på G2 + M + G1 genom att ansluta punkterna på grafen och hitta där linjen korsar 99%, som visas i figur 3B.
        Obs: Det är möjligt att utföra experiment för att fastställa varaktigheten av G2 och G2 + M + G1 som en enda uppsättning 2, 3, 4, och 5 h EdU experiment av samtidig märkning med både kanin-anti-WAPL-1 och mus-anti-pH3 antikroppar.
    9. (Variation VI) För att identifiera atomkärnor som replikeras i den perifera zonen men har sedan angivna meios, mata djuren EdU för 10 h och co etikett med REC-8 eller WAPL-1 antikroppar. Några kärnor Visa EdU etikett var i S-fas under dessa 10 h. Några kärnor som inte visar nucleoplasmic REC-8 eller WAPL-1 färgning var i meios. Helt enkelt räkna kärnorna med EdU märkning som inte visar märkning med den perifera zon markören (E, se tabell 1).
      Obs: Omvänt, om gonader färgas för meiotiska profas markören HIM-3 med anti-HIM-3 antikroppar, antalet kärnor med EdU märkning som är positiva för HIM-3.
    10. För att beräkna andelen meiotiska inträde, utföra ovanstående experimentet med en 5 h, 10 h och 15 h etikett för EdU. Rita antalet kärnor som in meios på y-axeln och varaktigheten av EdU etiketten på x-axeln, som visas i figur 3 c. Sedan använda en enkel linjär regression för att beräkna lutningen (kärnor trädde meios per h) från y = mx + b.
      Obs: Det är viktigt att använda en linjär regression för att beräkna meiotiska inträde. Det vore felaktigt att helt enkelt dela antalet kärnor som angetts meios av varaktigheten av EdU etiketten, eftersom y-skärningspunkten inte är noll.
    11. (Variation VII) Mäta graden av meiotiska progression.
      Obs: Eftersom EdU är kovalent införlivas med DNA, den kan användas att spåra en population av celler genom en differentiering. De celler som genomgick S-fas i den perifera zonen behålla EdU etiketten som de in i meios, framsteg genom meios, och genomgår oogenes. En puls-chase experiment med EdU kan användas för att mäta graden av meiotiska progression.
      1. Foder EdU-märkt bakterier till djur för 4 h (”pulsen”). Överföra djuren till namnlösa OP50 bakterier för 48 h (”jakten”), sedan dissekera och co etikett med en stamfader zon markör såsom REC-8 eller WAPL-1 (eller en meiotiska profas markör såsom HIM-3) om så önskas.
      2. När imaging, leta efter positionen för den mest proximala EdU-märkt kärnan. Meiotiska progressionshastigheten är avståndet (i cell diametrar från slutet av den perifera zonen) reste genom den mest proximala EdU märkt nucleus under 48 h jakten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eftersom DNA-syntes är skyldig att införliva EdU, kan man konstatera att EdU-märkt atomkärnor genomgick S-fas under fönstret EdU-märkning tid. Man kan tolka atomkärnor att etikett i en 30 min utfodring med EdU märkt bakterier som kärnorna i S-fas vid tidpunkten för dissektion. Atomkärnor som etikett i en längre kontinuerlig EdU utfodring experiment kan ha märkt tidigt i tidsfönstret och sedan vänster S-fas, eller kanske har märkt i den sena delen av fönstret EdU tid. EdU signal lokaliserar samarbete med DAPI signal. I vissa kärnor täcker EdU signalen alla kromosomer, medan i andra kärnor EdU signal lokaliserar till 1 – 2 ljusa puncta (figur 4). Dessa puncta sannolikt x-kromosomen, som replikerar sent i S-fas13.

Här, djuren var matas med EdU kontinuerligt i 30 min och dissekeras, såsom beskrivs ovan och i figur 5. Ett exempel på framgångsrik EdU färgning i en unga vuxna djur och ett exempel på misslyckade EdU färgning i ett äldre vuxna djur (se nedan) visas i figur 4. EdU signal från en 30 min märkning lokaliserar till cirka hälften av atomkärnor i den perifera zonen (definieras av WAPL-1 antikroppar märkning men tillnärmas genom DAPI morfologi26,27,28). S-fas index, andelen stamceller zonen som är EdU positiv, var tidigare rapporterade på 57 ±5% och så hög som 70% i unga vuxna1,2,3. M-fas index är cirka 2 – 3%1,29. I kontinuerlig utfodring för 4 h eller längre, alla atomkärnor i den perifera zon etiketten med EdU, och vissa kärnor som märkt i den perifera zonen eftersom ingått meiotiska profas1.

Medan tekniken fungerar konsekvent i vildtyp unga vuxna djur, inte en betydande del av Parade 5 dagar gamla hermafroditer (även de som innehåller spermier) etikett i en 30 min EdU puls (figur 4E). Men med en 4 h EdU utfodring, nästan alla dessa djur etikett. Sporadiska fel till etikett i genetiska hondjur med korta pulser för EdU har också varit rapporterade30. Det kan finnas andra situationer som resulterar i Sporadiska fel för etikett.

Man kan beräkna varaktigheten av cellcykeln genom att utföra flera EdU-märkning experiment med pH3 märkning i varje. Varaktigheten av G2 beräknades genom att analysera den procent av atomkärnor i M-fasen (pH3 immunreaktiva) som var EdU positiva under tiden (figur 6). Detta tillvägagångssätt ger median och längsta varaktighet för G2 (figur 3A). Mediantiden var interpolerade, visar en ungefärlig G2 varaktighet av 2,5 h i unga vuxna hermafroditer. Varaktigheten av G2 + M + G1 uppskattades från den procent av alla perifera zonen atomkärnor (WAPL-1 immunreaktiva) som var EdU positiva (figur 6). G2 + M + G1 metoden ger en maximal varaktighet åtgärd för de kombinerade faserna (figur 3B). Den 99: e percentil tid var interpolerade, visar en ungefärlig G2 + M + G1 varaktighet av 3,4 h i unga vuxna hermafroditer. Data från de samma experiment användes för att beräkna meiotiska inträde (kärnor per h). Priset är lutningen av en linjär regressionslinje för antalet kärnor som angett meios (EdU positiva, WAPL-1 negativa eller HIM-3 positiva) över varaktigheten av skivbolaget EdU (figur 3 c). I tabell 2visas värdena för vildtyp 1 dag gammal vuxen hermafroditer.

Figure 1
Figur 1: Diagram över C. elegans könsceller och cellcykeln. (A) cellcykeln av könsceller i den unga vuxna hermafrodit könsceller. Siffrorna anger den ungefärliga procentandelen tid i varje cell cycle scenen. (B) C. elegans hermafroditer har två U-formade germlines (röd och blå). Spermatheca visas i gult och livmodern med att utveckla embryon visas i mörkgrått. Den orange streckad linjen anger där djur är dissekerade för att extrudera germlines. (C) Diagram över en ovikt C. elegans könsceller. DAPI (blå) är ett DNA-färgämne som belyser nukleära morfologi. Distala perifera zonen (markerade i rött baserat på WAPL-1 antikroppar färgning) innehåller mitotiskt cykling stamceller och stamceller celler i meiotiska S-fas (WAPL-1 också etiketter somatiska gonad kärnor). Celler i mitotiska och meiotiska S-fas indikeras i grönt och etikett med en 30 min EdU puls. Två celler i M-fas etikett med pH3 antikropp och visas i svart. Den distala spets cellen (DTC) ger GLP-1/Notch liganden för att behålla stamceller ödet av dessa celler. Som cellerna migrerar från DTC, de avsluta den perifera zonen och ange meiotiska profas. Gula celler är sperma i spermatheca. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Venndiagram av klasser av atomkärnor. Atomkärnor grupperas efter närvaro och frånvaro av tre markörer: WAPL-1 indikerar zon stamceller (röd), EdU S-fas celler (grön) och pH3 anger M-fas celler (blå). Celltyper identifieras som A-G. Observera att i vildtyp unga vuxna hermafroditer celler av typ F finns inte, och cellerna märker inte tillsammans med EdU och pH3 utanför den (WAPL-1 positiv) stamceller zon. Distala gonad diagrammet nedan visar ett exempel på A-E och G kärnor. Se tabell 1 för mer information. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: grafisk presentation av cellcykeln varaktighet och meiotiska posten experimentella data. (A) varaktighet G2 fas är interpolerade från pH3 och EdU Co märkning följande varierade-längd EdU pulser grå linjerna indikerar 50th och 99th percentiler används i interpolera median och maximal G2 varaktigheter anges med pilar. (B), en cell i G2, M eller G1 fas omfattar inte EdU. Således, längsta G2 + M + G1 fas kan uppskattas genom att mäta längsta EdU etikett som ger EdU-negativa celler. Varaktigheten av G2 + M + G1 fas är interpolerade från EdU och REC-8 Co märkning efter varierade-längd EdU pulser. Grå linje anger 99: e percentilen används i interpolera längsta G2 + M + G1, markerad med en pil. Det är inte möjligt att interpolera Mediantiden G2 + M + G1. (C) graden av meiotiska inträde (i kärnor per h – se tabell 2) beräknas från lutningen av regressionslinjen. Observera att eftersom skärningspunkt med y-axeln inte är noll, en regression är nödvändiga för en korrekt beräkning av andelen meiotiska inträde (C). . Felstaplar visar standardavvikelsen. Siffrorna ändras och återges med tillstånd från Fox et al. 20111. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: exempel på lyckade och misslyckade 30 min EdU färgning. Confocal mikroskopbilder av en 1 dag gammal (A-D) och en 5 dag gammal (E-H) hermafrodit gonad (inte spermier utarmat) efter en 30 min EdU märkning experiment. Den streckade vita linjen markerar slutet på den perifera zonen. Asterisk markerar position av distala spets. Gröna märken EdU färgning visualiseras genom att klicka på kemi (A). Misslyckade EdU märkning resulterar i låg bakgrund färgning men inga ljusa EdU + kärnor (E). Röda märken WAPL-1 immunofluorescens (B, F). Gult indikerar överlappning (C, G). Blå märken DAPI färgning för DNA (D, H). Enda pilspetsar visar en kärna med EdU färgning hela kromatinet. Dubbla pilspetsar visar en kärna med EdU puncta på endast ett par kromosomer. Bilder erhölls med ett 63 X-objektiv. Skalstapeln = 10 µm (D, H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: experimentell arbetsflödet. En sammanfattning av det experimentella protokollet att växa (A), dissekera EdU etikett (B), (C), antikropp fläcken (D), utföra Klicka reaktionen att bifoga ett färgämne i EdU (E), fläcken DNA (F), bild germlines (G), och kvantifiera EdU märkt och antikropp färgade kärnor (H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: exempel på lyckade 4 h EdU färgning. Confocal mikroskopbilder av en 1 dag gammal vuxen hermafrodit gonad efter en 4 h EdU märkning experimentera. Den streckade vita linjen markerar slutet på den perifera zonen. Asterisk markerar position av distala spets. Magenta markerar pH3 immunofluorescens (A, C). Gröna märken EdU färgning visualiseras genom att klicka på kemi (B, C). Röda märken WAPL-1 immunofluorescens (D). Gult indikerar överlappningen av EdU och WAPL-1 (E). Blå märken DAPI färgning för DNA (F). Enda pilspetsar visar atomkärnor co märkt med EdU och pH3. Dubbel pilspets markerar en pH3 + EdU-nucleus - en sällsynt företeelse i en 4 h EdU märkning. Pilarna markerar EdU + WAPL-1 - kärnor som har angett meios. Bilder erhölls med ett 63 X-objektiv. En 10 µm skalstapeln visas (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Markör: pH3 EdU * WAPL-1 eller REC-8 HONOM-3
Tolkning: Mitos S-fas * Perifera zonen Meios
Klass: Kombinerade tolkning:
A Symbol 1 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 i M-fas, var i perifera zonen, i mitotiska S-fas under EdU etikett (avslutade G2)
B Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 i M-fas, var i perifera zonen, inte i S-fas under EdU etikett
C Symbol 2 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 i interphasen, i perifera zonen, var i S-fas under EdU etikett
D Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 i interphasen, i perifera zonen, var inte i S-fas under EdU etikett
E Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 meios, var i meiotiska S-fas under EdU etikett (meiotiska posten kärnor)
F Symbol 1 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 återgå till Mitos (finns i vissa mutanter) eller meiotiska divisioner (i spermatogenesen)
G Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 i meios, var inte i S-fas under EdU etikett
Summa totala pH3 positiva; alla celler i M-fas Summa totala EdU positiv; alla celler i S-fas Summa totala WAPL-1 positiv;  alla celler i den perifera zonen Summa totala HIM-3 positiv; alla celler i meiotiska profas

Tabell 1: kategorier av atomkärnor. * Observera att 30 min och 4 h EdU experiment varierar i tolkningen. I längre varaktighet EdU experiment, celler har sannolikt kommit längre än S-fas. Se Inledning och steg 8 för varaktigheten av EdU märkning för relevanta experiment.

Cellcykeln del Operationell Definition Beräkning * Värde **
Perifera zonen kärnor alla WAPL-1 (eller REC-8) positivt, HIM-3 negativa kärnor A + B + C + D 231 ± 23 kärnor
S-fas kärnor atomkärnor EdU positiva efter 30 min EdU etikett och WAPL-1 positivt A + C 133 ± 20 kärnor
M-fas kärnor pH3 och WAPL-1 co-positive kärnor A + B 5,2 ± 2.3 kärnor
S-fas index S-fas kärnor / stamceller zon kärnor A + C / A + B + C + D 57% av cellcykeln
M-fas index M-fas kärnor / stamceller zon kärnor A + B / A + B + C + D 2% av cellcykeln
Meiotiska posten celler EdU märkt kärnor i meios E varierar beroende på löptid EdU etikett
Meiotiska inträde hastighet Meiotiska posten kärnor per h av EdU etikett Lutning från figur 4 C *** 20,3 kärnor per h
G2 varaktighet (median) 50% intercept från Figure4A 2,5 h
G2 varaktighet (maximalt) 99% intercept från figur 4A 3,5 h
G2 + M + G1 varaktighet (maximalt) 99% intercept från figur 4B 3,5 h
Cellcykelns längd (median) medianduration G2 / G2-index *** 6,5 timmar
Cellcykelns längd (max) längsta G2 / G2-index *** 8,1 h

Tabell 2: cellcykeln beräkningar. * Bokstäverna representera klasserna av atomkärnor som definieras i tabell 1 och figur 3. Beräkningar ändras från Fox et al. 20111. ** Värdena (± standardavvikelse) för vildtyp hermafroditer upp vid 20 ° C till 24 h post mid-L4 scenen år. Observera att eftersom skärningspunkt med y-axeln inte är noll, en regression är nödvändiga för en korrekt beräkning av andelen meiotiska inträde. G2-indexet bestäms genom att subtrahera den S-fas index, M-fas index och ungefärliga G1-index (2%) från 100%, som beskrivs av Fox et al. 20111.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Beredning av EdU-märkt bakterier (steg 1) är avgörande för detta protokoll, och den första punkten för felsökning. Vildtyp unga vuxna hermafroditer etikett mycket pålitligt i en 4 h EdU-puls, vilket gör detta till en användbar kontroll för varje ny omgång EdU-märkt bakterier. Dessutom kommer intakt EdU-märkt bakterier som anger tarmen (i äldre djur eller vissa svalget/grinder defekta mutanter) etikett med klick-kemi och visas som ljusa avlånga puncta i tarmen. En alternativ teknik för märkning hermafroditer använder en ”blöt” i en hög koncentration (1 mM) av EdU3. Denna teknik svälter djuren för varaktigheten av märkning, men ger ett användbart sätt att kringgå gör EdU-märkt bakterier när felsökning fixering och klicka på kemi. Om ett EdU ”blöt” experiment lyckas medan en EdU foder inte är sedan förbereda färska EdU-märkt bakterier. För att nå en tillräcklig bakteriell densitet samtidigt också uppnå en hög EdU-halt, kan man behöva justera koncentrationerna av EdU och tymidin.

Den största begränsningen av denna teknik för märkning av S-fas är i behov av att mata EdU-märkt bakterier till djur. De djur som inte kan mata (på grund av genotyp eller etappen) kan inte märkas med denna teknik. Dock nukleosid analoger är för närvarande den enda metoden att identifiera S-fas kärnor i den C. elegans könsceller, och deras användning kräver inte att någon transgener vara närvarande i djuren. Dessutom, när införlivas, EdU resterna i kärnor även när de kommer ut S-fas, framsteg genom cellcykeln, dela eller skilja. Signalen försvagas av hälften med varje celluppdelning. Detta gör EdU perfekt för att spåra cellens historia även genom några celldelningar.

Stabiliteten i EdU gör puls-chase experiment okomplicerad; bara skölj överskott EdU bakterier från djur efter önskad längd puls är färdig och överföra djuren till namnlösa bakterier. EdU förblir i DNA och förblir synlig även efter flera celldelningar. Experimenten är dock begränsade till en enda typ av S-fas etikett (en enda puls för EdU). Co märkning med EdU och BrdU är möjligt i däggdjursceller31 men har inte rapporterats i C. elegans. Co märkning av IdU och CldU används i däggdjur32 men har inte rapporterats hos C. elegans.

De främsta fördelarna med EdU märkning är att metoden kräver inga transgener, EdU kan matas till C. elegans under regelbunden kultur, kemi är kompatibel med Immunofluorescerande tekniker och EdU kvarstår i DNA för en lång tid efter utfodring har stoppad. Dessa funktioner gör EdU ett bra verktyg att studera många aspekter av cellcykeln och bakteriecellen dynamiken.

Cellcykeln och bakteriecellen dynamics analys med EdU kan tillämpas på en mängd forskningsfrågor. Bara några exempel på ytterligare tillämpningar av denna metod: Hur ändrar dynamiken i cellcykeln hos djur med cellcykeln genmutationer? Hur påverkar fysiologiska förhållanden cellcykeln i stamceller, graden av bakteriecellen trätt i meiotiska profas och graden av bakteriecellen progression genom meiotisk profas? Hur förändras cellcykeln under larval utveckling? Hur stora signalering utbildningsavsnitt störningar påverkar cellcykeln, förutom förändringar i cell öde (såsom ektopisk spridning)? Detta system kan ändras för att studera cellerna gör i många olika förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma till E. coli lager center för MG1693; Wormbase; Stadens Caenorhabditis genetik som finansieras av nationella institut för hälsa Office av infrastruktur forskningsprogram (P40OD010440) för stammar. Zach Pincus för statistisk rådgivning; Aiping Feng för reagenser. Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar och John Brenner för utbildning, rådgivning, stöd och bra diskussion; och de Kornfeld och Schedl labs för feedback på detta manuskript. Detta arbete stöds delvis av National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 till KK, R01 GM100756 till TS] och en National Science Foundation pre gemenskap [DGE-1143954 och DGE-1745038 till ZK]. National Institutes of Health varken National Science Foundation hade någon roll i utformningen av studien, insamling, analys och tolkning av data, eller skriftligen manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. Click-iT EdU Imaging Kits. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. De Cell Counter Plugin. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. ImageJ. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
  31. Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 140 C. elegans EdU S-fas cellcykeln könsceller meiotiska S-fas M-fas G2-fasen
Cellcykeln analys i den <em>C. elegans</em> könsceller med tymidin Analog EdU
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kocsisova, Z., Mohammad, A.,… More

Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU. J. Vis. Exp. (140), e58339, doi:10.3791/58339 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter