Summary
Presentamos un en vivo imagen de protocolo de la corteza cerebral de ratones neonatales de la proyección de imagen de dos fotones. Este método es adecuado para el análisis de la dinámica del desarrollo de las neuronas corticales, los mecanismos moleculares que controlan la dinámica neuronal y los cambios en la dinámica neuronal en modelos de la enfermedad.
Abstract
Proyección de imagen de dos fotones es una poderosa herramienta para el análisis en vivo de los circuitos neuronales en el cerebro mamífero. Sin embargo, un número limitado de en vivo de imágenes métodos existe para examinar el tejido cerebral de los mamíferos recién nacidos vivos. Aquí se resume un protocolo de neuronas corticales individuales en vida ratones neonatales de la proyección de imagen. Este protocolo incluye las siguientes dos metodologías: (1) el sistema de Supernova para rala y brillante etiqueta de neuronas corticales en el cerebro en desarrollo y (2) un procedimiento quirúrgico para el frágil cráneo neonatal. Este protocolo permite la observación de cambios temporales de neurites corticales individuales durante las etapas neonatales con un alto cociente signal-to-noise. Silenciamiento del gen de célula-específica marcada y octavos de final también se logra combinando la Supernova con RNA de interferencia y gene CRISPR/Cas9 sistemas de edición. Este protocolo puede, por lo tanto, utilizarse para el análisis de la dinámica del desarrollo de las neuronas corticales, mecanismos moleculares que controlan la dinámica neuronal y cambios en la dinámica neuronal en modelos de la enfermedad.
Introduction
El cableado exacto de los circuitos neuronales en la corteza cerebral es esencial para funciones más altas del cerebro como percepción, cognición y aprendizaje y la memoria. Circuitos corticales se refinan dinámicamente durante el desarrollo postnatal. Estudios han investigado el proceso de usar el circuito cortical formación histológica y en vitro el análisis de la cultura. Sin embargo, la dinámica de formación de circuito en los mamíferos de vida ha permanecido en su mayoría inexplorada.
Microscopía de dos fotones ha sido ampliamente utilizado para el análisis en vivo de los circuitos neuronales en el cerebro de ratón adulto1,2. Sin embargo, debido a problemas técnicos, sólo un número limitado de estudios ha abordado la formación de circuitos neuronales en ratones recién nacidos. Por ejemplo, Carrillo et al realizar la proyección de imagen de Time-lapse de escalada las fibras en el cerebelo en la segunda semana postnatal3. Portera-Cailliau et al informó la proyección de imagen de los axones corticales capa 1 en la primera semana postnatal4. En el presente estudio, se resume un protocolo para la observación de la capa 4 cortical neuronas y sus dendritas en ratones recién nacidos. Resultados obtenidos mediante la aplicación de este protocolo, que incluye dos metodologías, se expresan en nuestra reciente publicación5. En primer lugar, utilizamos la Supernova vector sistema5,6 para el etiquetado de neuronas individuales del cerebro neonatal. En el sistema de la Supernova, las proteínas fluorescentes utilizadas para etiquetar neuronal son caída intercambiable y etiquetada gene célula-específico y análisis de la edición de octavos de final también son posibles. En segundo lugar, se describe un procedimiento quirúrgico para la preparación de ventana craneal en ratones neonatales frágil. Juntos, estas metodologías permiten la observación en vivo de neuronas individuales en el cerebro neonatal.
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Protocol
Los experimentos deben realizarse con arreglo a las directrices de bienestar de los animales prescritas por la institución del experimentador.
1. preparación de cachorros para la proyección de imagen
Nota: Cachorros con las neuronas corticales escasamente marcadas pueden obtenerse en el útero la electroporación (IUE) de Supernova vectores5,6. El sistema de Supernova consiste en los siguientes dos vectores: TRE-Cre y CAG-loxP-parada-loxP-gen X-ires-tTA-WPRE. En este sistema, escasa de etiquetado se basa en fuga TRE. En una población escasa de neuronas transfected, TRE conduce la expresión débil de Cre y tTA. Posteriormente, sólo en estas células, la expresión del gen X, facilita una regeneración positiva de los ciclos de tTA-TRE. El logrado etiquetado rala y brillante permite la visualización de los detalles morfológicos de las neuronas individuales en vivo. Detalles de la IUE no están descritos en este protocolo ya que han sido descritos en otra parte7,8,9,10,11.
- Preparan ratones embarazadas programado para IUE.
- Preparar una solución de ADN para la IUE. Escasa etiquetado con RFP, utilice una solución que contiene pK031:TRE-Cre (5 ng/μL) y pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 μg/μl) o una solución que contiene pK031:TRE-Cre (5 ng/μL) y pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 μg/μl).
Nota: Varias proteínas se pueden expresar en las neuronas marcadas usando diferentes combinaciones de vectores. También, varios genes pueden ser derribado o golpeado-hacia fuera específicamente en las células etiquetadas5,6 (p. ej., una serie de vectores para el sistema de Supernova están disponibles del centro de investigación RIKEN BioResource y de Addgene). - Realizar regular IUE7,8,9,10,11 para etiquetar las neuronas corticales. Para el etiquetado de las neuronas de la capa 4, use embrionarios embriones día 14.
- Espera para la entrega del cachorro y crecimiento.
2. cirugía
- Anestesiar el postnatal día 5 (P5) cachorro utilizando gas isoflurano (1.0%). Realice una prueba de cola-pellizco para comprobar el nivel de anestesia. Si el cachorro responde a la presión, aumentar la concentración de isoflurano (hasta 2,0%) o esperar hasta que desaparezca la respuesta. Mantener la temperatura corporal del cachorro durante la cirugía usando una almohadilla térmica.
- Inyectar por vía subcutánea un analgésico (carprofeno, 5 mg/kg).
- Esterilizar la piel del cachorro que cubre el cráneo limpiándolo con etanol al 70% tres veces.
- Quitar aproximadamente2 de 20 mm de la piel que cubre el cráneo con unas tijeras esterilizadas con etanol al 70% (figura 1A).
- Retire la fascia del cráneo usando pinzas esterilizadas y un hisopo de algodón limpio y estéril (figura 1A).
- Aplique el adhesivo de tejido utilizando puntas de carga a la superficie de la piel incisas a detener el sangrado. No aplique adhesivo tisular para el área de proyección de imagen (figura 1B) porque esto dificulta la apertura del cráneo.
- Colocar el cachorro sobre una almohadilla de calefacción (37 ° C) y deje que se recupera de la anestesia. Espere hasta que el adhesivo tisular ha secado y solidificado (aproximadamente 30 min).
- Si es necesario, aplique más Adhesivo tisular y espere que se seque y solidifique.
3. preparación de la ventana craneal
- Anestesiar el cachorro con isoflurano (1.0-2.0%) y verifique el nivel de anestesia mediante una prueba de cola-pinch.
- Abra cuidadosamente el cráneo con una cuchilla de afeitar esterilizada dejando la duramadre intacta (1 mm de diámetro) (figura 1). Use una esponja de gelatina (cortada en trocitos, aproximadamente < 2 mm3, con unas tijeras esterilizadas y aplicarlas con pinzas) en corteza buffer12 (125 mmol/L de NaCl, 5 mmol/L de KCl, 10 mmol/L glucosa, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl2 y 2 mmol/L de MgSO4; pH 7,4; 300 mOsm/L; temperatura) para detener el sangrado. Al abrir el cráneo, se aplica un buffer de corteza para mantener húmeda la superficie del cerebro.
- Quite cualquier buffer y la sangre de la superficie dural con una esponja de gelatina. Se aplica a puntas de capa delgada del 1.0% uso de agarosa de bajo punto de fusión (disuelto en tampón de corteza) amarillo. Usando una máquina del bloque de calor, mantener la temperatura de la solución de agarosa a 42° C hasta la aplicación.
Nota: El agotamiento del búfer y la sangre debe realizarse desde el lado de la craneotomía y teniendo cuidado de que la esponja de gelatina seca no entren en contacto con la duramadre. No hacerlo puede dañar la duramadre. - Se aplica un cubreobjetos de vidrio redondo (no. 1, 3 mm de diámetro) en la capa de gel de agarosa. Eliminar todas las burbujas entre el cubreobjetos y la capa de gel de agarosa vertiendo un exceso de gel de agarosa entre ellos. Retirar el gel sobrante que sobresale por debajo del cubreobjetos con unas pinzas (figura 1 y 1E).
- Asegure el cubreobjetos con cemento dental (Figura 1F).
- Mezclar el cemento en polvo y el líquido del cemento. Aplique la mezcla con puntas amarillas antes de llega a ser solidificado. No Aplique cemento dental hacia la dura, ya que esto puede dañar el cerebro.
- Coloque un estéril titanio barra (por encargo, aproximadamente 30 mg, ver figura 1) en el hueso craneal con cemento dental. Alinee la barra de titanio y el cubreobjetos (en la superficie de la duramadre) en paralelo a capturar fácilmente imágenes.
- Cubre el cráneo expuesto con cemento dental (figura 1 H).
- El cachorro se recupera de la anestesia. Mantenerlo en un calentador (37 ° C) hasta que el cemento dental ha solidificado (1 h).
4. dos fotones de imagen
Nota: Las imágenes en vivo en la figura 2 se adquirieron utilizando un microscopio de dos fotones con un laser de titanio zafiro (viga de diámetro [1/e2]2: 1,2 mm).
- Establecer la longitud de onda de láser de dos fotones. Para la excitación de la RFP, uso 1.000 nm (450 mW/mm2 a 400 μm de profundidad).
Nota: Se debe reducir la potencia del láser como la posición de z se mueve hacia arriba. - Limpie la superficie del cubreobjetos con etanol al 70%.
- Anestesiar el cachorro con isoflurano (1.5% - 2.0%) y verifique el nivel de anestesia mediante una prueba de cola-pinch.
- Fije el cachorro a la placa de titanio en la etapa de proyección de imagen usando una barra de titanio en la cabeza del cachorro (figura 2A y 2B). Ajustar la cabeza de tal manera que el cubreobjetos esté paralelo a la lente del objetivo con la etapa del goniómetro (figura 2B). Mantener la temperatura corporal del cachorro mediante una almohadilla caliente (37 ° C).
- Establece la concentración de isoflurano en 0,7% - 1.0%.
Nota: Una concentración de isoflurano muy alta puede causar la muerte accidental de la cría durante la proyección de imagen. - Coloque la etapa de proyección de imagen bajo la lente del objetivo (20 X, NA 1.0) del microscopio de dos fotones (figura 2B y 2C).
- Aplique una gota de agua sobre el cubreobjetos. Uso de epi-fluorescencia para localizar las neuronas marcado con la proteína fluorescentes en la zona donde la duramadre se ha expuesto.
- Adquirir imágenes z-stack μm 1.4 intervalos. Para capa 4 neurona de la proyección de imagen, fijar el ancho de z a 150-300 μm a la imagen la completa morfología dendrítica (Figura 2D y 2E). Uso lento de exploración y un promedio para obtener imágenes claras que muestran la morfología neuronal (tarda generalmente > 20 minutos para adquirir la completa morfología dendrítica).
Nota: Se recomiendan los siguientes parámetros para la proyección de imagen. Longitud de onda de excitación: 1.000 nm, escáner: tipo galvanómetro, espejo dicroico: 690 nm, filtro de emisión: 575-620 nm bandpass, detector: tipo de GaAsP, ganancia ajuste > 100, imagen tamaño > 512 x 512 μm, campo de visión > 600 x 600 μm, pixel Resolución < 1.2 μm.
5. recuperación y enfermería
- Separar el cachorro de la etapa de proyección de imagen.
- Colocar el cachorro sobre un calentador (37 ° C) y permita que recuperar (15 min).
- El cachorro la alimentación leche caliente con una micropipeta en intervalos de 2 horas y estimular suavemente el estómago para permitir la excreción. Confirmar que el cachorro es beber leche por la medición de su peso corporal.
6. volver a la proyección de imagen
- Anestesiar el cachorro con isoflurano (1.5-2.0%) y verifique el nivel de anestesia mediante una prueba de cola-pinch. Conéctelo a la etapa de proyección de imagen.
- Localizar las neuronas anteriormente reflejadas y adquirir una imagen z-stack. La identificación de las neuronas es fácil debido a su escasa etiquetado con Supernova.
- Repita los pasos 5.1 6.2 hasta que finalice la proyección de imagen. Nota: El cachorro puede ser reflejado hasta 18 h sin perder peso.
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Representative Results
Figuras 2D - 2F mostrar resultados representativos de la imagen de Time-lapse de dos fotones de neuronas corticales de la capa 4 mediante el presente Protocolo. Con el fin de análisis, seleccione las neuronas dendríticas clara morfología a lo largo de los periodos de proyección de imagen. Hemos analizado la morfología dendrítica de neuronas reflejadas utilizando el software de análisis morfológico. Reconstrucción de la morfología dendrítica representativa se muestra en la figura 2F. Las neuronas que muestra desconectado dendritas (figura 2) deben ser excluidas de los análisis, ya que las dendritas desconectadas indican muerte celular inducida por daño durante la cirugía o la proyección de imagen. Además, las neuronas con puntas dendríticos borrosos deben ser excluido (por ejemplo, la neurona con la punta de flecha en la Figura 2D).
Figura 1: cirugía, preparación de ventana craneal y apego de la bar de titanio (A) este panel muestra la eliminación de la piel que cubre el cráneo. (B) este panel muestra la fijación de la diferencia entre la piel y el cráneo. Tenga cuidado de no aplicar la Unión a la zona de proyección de imagen. (C) esta es una imagen de la duramadre expuesta. Una hoja de afeitar fue insertada entre el cráneo y la duramadre y el cráneo se agitó a la izquierda de la zona expuesta (flecha). El hueso entonces se puede quitar fácilmente con unas pinzas. (D) se trata de un diseño esquemático mostrando una vista vertical de la ventana craneal. La brecha entre el cristal y la duramadre se llena con una capa delgada de gel de agarosa. El cubreobjetos se fija al cráneo con cemento dental. (E) A forma redonda cubreobjetos se colocan en la capa de gel de agarosa. (F) esta es una imagen del cubreobjetos asegurado. (G) este panel muestra el diseño de la barra de titanio. La barra de titanio contiene dos orificios para la fijación en la etapa de proyección de imagen (ver figura 2) y una parte rectangular plana que se une a la cabeza del cachorro. Bar (H) la parte rectangular del titanio se une al cráneo del cachorro con cemento dental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: En vivo dos fotones la proyección de imagen de las neuronas corticales en ratones neonatales. (A) este panel muestra el diseño de la placa de titanio. La placa de titanio tiene dos orificios para la fijación de la barra de titanio y cuatro agujeros de tornillo para la fijación de la etapa del goniómetro, que se coloca en el escenario de proyección de imagen. 2.5 mm (de diámetro) tornillos de 2 mm (longitud) se utilizan para la fijación. (B) se trata de una imagen representativa del cachorro a la etapa de proyección de imagen. La temperatura corporal del cachorro se mantiene usando un calentador. (C) el cachorro es anestesiado con isoflurano en el en vivo de procedimiento. (D) este panel muestra una imagen representativa de Time-lapse Z-pila de capa 4 neuronas corticales de una cría de P5. La punta de flecha indica la neurona con las dendritas borrosas, que debe eliminarse del análisis. (E) este panel muestra aumento mayor imágenes de Time-lapse de la neurona con flechas en el panel D. Puntas de flecha de azul: consejos dendríticas que se repliegan en puntas de flecha de 4.5 h, amarillo: consejos dendríticas que son alargados en 4,5 h, pequeñas puntas de flecha blancas: axón de una célula vecina. (F) este es un modelo 3D de la huella dendrítica de la neurona en la figura izquierda de panel E. Círculos azules indican la posición del cuerpo celular. (G) este panel muestra representativas neuronas con dendritas desconectadas, que no están incluidas en el análisis. Los datos de muestra en los paneles D - G contienen NR1 (una subunidad esencial del receptor de glutamato tipo NMDA) - eliminado - neuronas (debido a los limitados datos disponibles de los autores). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pasos críticos en el protocolo y resolución de problemas:
El paso más crítico del protocolo es la extirpación del cráneo (paso 3.2 del Protocolo). Sobre inserción, la hoja de afeitar a menudo se adhiere a la duramadre, provocando hemorragia dural y daño en el cerebro. Esto puede evitarse añadiendo una gota de tampón de corteza en el cráneo y el cráneo en tampón de corteza.
Sangrado de la duramadre y la piel después de preparación de ventana craneal conduce a la oclusión de la ventana. Para evitar esto, el tejido cemento adhesivo y dental usado se debe completamente seco antes de proceder al siguiente paso. Varios cachorros con una ventana craneal deben estar preparados ya que es difícil evitar completamente el sangrado. En general, si la ventana craneal permanece clara y estable para la cirugía después de 2-3 h, el cachorro puede utilizarse para la proyección de imagen de Time-lapse.
Importancia del método con respecto a los métodos existentes y alternativas:
Aquí, hemos descrito un método para en vivo imágenes de la corteza neonatal de dos fotones. Este protocolo tiene varias ventajas en comparación con métodos previamente divulgados. Estas son las siguientes.
1) corticales neuronas pueden ser etiquetadas escasamente y brillantemente por transferencia vectores de Supernova con IUE. IUE ha sido ampliamente utilizado para el etiquetado de las neuronas corticales durante las etapas de desarrollo. Sin embargo, un simple IUE es inadecuada para la proyección de imagen de neuronas individuales ya que las neuronas pueden ser etiquetados como demasiado densamente7,8,9,10. Además, usando el sistema de Supernova, varios tipos de proteínas fluorescentes pueden utilizarse para el etiquetado de las escasas poblaciones de neuronas. Por ejemplo, mediante etiquetado escasa Supernova-mediada de un indicador de calcio genéticamente codificados GCaMP13,14, hemos recientemente realizamos un análisis funcional de las neuronas individuales en la capa de la corteza en desarrollo 4 (P3 a P13) 15.
2) el método descrito en este estudio es conveniente para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes de desarrollo de circuitos neuronales. El sistema de Supernova permite escasamente marcada nocaut en células específicas de cualquier gen. Así, se puede observar la dinámica de la neurona con la interrupción de un gen específico. Para ello, se han divulgado previamente sistemas basados en la genética como MADM16 y17 de SLICK. Sin embargo, debido a la cría de líneas de ratón es esencial para estos sistemas, que requieren mucho tiempo y costo que el protocolo descrito aquí.
3) este estudio utiliza una cuchilla de afeitar para el retiro del cráneo. Esto reduce al mínimo la sangría de la dura y permite la apertura de una amplia zona del cráneo (< 2 mm de diámetro). Mediante este procedimiento, fue posible observar la actividad espontánea de capa 4 neuronas en el área de barril grande todo dentro de la corteza somáticosensorial15.
Limitaciones del método:
Una desventaja de las imágenes en vivo del cerebro neonatal de ratón, en comparación con la proyección de imagen de animales transparentes como las larvas de pez cebra y los renacuajos de Xenopus , es la menor resolución espacial y temporal. Escaneo lento y promedio deben realizarse para la obtención de imágenes claras de la morfología neuronal debido a dispersión de la luz más se produce en el cerebro de ratón. Dispersión de la luz puede reducirse posiblemente usando un láser de longitud de onda más largo de excitación fluorescente de la proteína y las proteínas con longitudes de emisión de fluorescencia.
Otra limitación del presente Protocolo podría ser que la cirugía para la implantación ventana craneal puede afectar la formación de un circuito cortical normal debido a la inflamación de cerebro12. Sin embargo, existe una alta probabilidad que en vivo la proyección de imagen es más fisiológico en comparación con en vitro la proyección de imagen tales como proyección de imagen de Time-lapse de la preparación de rebanada del cerebro, que también debería dar lugar a inflamación severa isquemia y rebanar. También se ha divulgado que la exposición repetitiva a isoflurano puede afectar varios procesos neuronales18. Experimentos de control se debe realizar para verificar la adecuación de los resultados obtenidos por proyección de imagen en vivo . En el caso de la proyección de imagen de las neuronas de la capa 4 en la corteza somatosensorial, se confirmó un incremento normal en la longitud dendrítica total y adquisición del sesgo de orientación de las proyecciones dendríticas de neuronas radiadas espinosas5,20.
Estudios recientes reportaron > 1 mm-proyección de imagen de profundidad en un cerebro de ratón adulto, en donde la duramadre fue quitada durante cirugía19. Por otro lado, hemos podido informar hasta 400 μm de profundidad la proyección de imagen en neonatos5. Puesto que la dura no se puede quitar en recién nacidos y, a su vez, conduce a una alta dispersión de la luz, consideramos que la proyección de imagen profunda en recién nacidos es más difícil que en adultos. Futura mejora en sondas fluorescentes, los láseres y detectores debe permitir profunda proyección de imagen en el cerebro neonatal.
Hasta el momento, hemos reportado 18 horas Time-lapse de imágenes mediante el presente Protocolo5. Recientemente, hemos conseguido imágenes de lapso de tiempo de 72 horas por mejorar el protocolo20. Vamos a seguir afinar el protocolo presentado aquí (por ejemplo, a más largo plazo, mayor tiempo o proyección de imagen de resolución espacial) para revelar mecanismos dinámicos de desarrollo de circuitos neuronales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen su asistencia técnica T. Sato, M. Kanbayashi y S. Kouyama. Este trabajo fue apoyado por JSP KAKENHI Grant números JP15K14322 y JP16H06143, la Fundación de ciencia de Takeda, la Fundación conmemorativa de Uehara y el proyecto de investigación colaborativa de Niigata University cerebro investigación Instituto 2017-2923 (H.M.) y por KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 y JP15H04263 y Grant en la investigación científica en áreas de innovación "Regulación dinámica de la función cerebral por chatarra y sistema de construcción" (JP16H06459) de MEXT (T.I.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
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