Summary
نقدم في فيفو اثنين-فوتون التصوير البروتوكول للتصوير قشرة الدماغ الفئران حديثي الولادة. هذا الأسلوب مناسبة لتحليل الديناميات التنموية من الخلايا العصبية القشرية، الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات الخلايا العصبية، والتغيرات في ديناميات الخلايا العصبية في نماذج المرض.
Abstract
تصوير اثنين-فوتون أداة قوية للتحليل في فيفو الدوائر العصبية في الدماغ الثدييات. ومع ذلك، توجد عدد محدود من أساليب التصوير في فيفو لفحص أنسجة المخ من الثدييات حديثي الولادة الحية. وهنا يمكننا تلخيص بروتوكول لتصوير الخلايا العصبية القشرية فردية في الفئران حديثي الولادة الحية. يتضمن هذا البروتوكول المنهجيتين التالية: (1) نظام سوبر نوفا لوسم متفرق ومشرق للخلايا العصبية القشرية في الدماغ، و (2) إجراء العمليات جراحية للجمجمة الولدان الهشة. ويسمح هذا البروتوكول مراقبة التغيرات الزمنية لفرادى نيوريتيس القشرية خلال مراحل الأطفال حديثي الولادة مع ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. كما يمكن عن طريق الجمع بين الفائق مع تدخل الجيش الملكي النيبالي والجينات كريسبر/Cas9 تحرير نظم إسكات الجينات الخاصة بخلية مسماة وخروج المغلوب. هذا البروتوكول، وبالتالي، يمكن لتحليل الديناميات التنموية من الخلايا العصبية القشرية، الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات الخلايا العصبية، والتغيرات في ديناميات الخلايا العصبية في نماذج المرض.
Introduction
الأسلاك الدقيقة من الدوائر العصبية في قشرة الدماغ ضروري لوظائف الدماغ العليا بما في ذلك التصور، والإدراك، والتعلم والذاكرة. الدوائر القشرية المكررة بشكل حيوي أثناء التطوير بعد الولادة. الدراسات وحققت عملية استخدام تشكيل الدائرة القشرية غذائها و في المختبر تحليلات الثقافة. ومع ذلك، ظلت ديناميات تشكيل الدائرة في الثدييات الحية غير مستكشفة في معظمها.
اثنين-فوتون الفحص المجهري تستخدم على نطاق واسع للتحليلات في فيفو الدوائر العصبية في الدماغ الماوس الكبار1،2. ومع ذلك، نظراً للتحديات التقنية، سوى عدد محدود من الدراسات تناولت تشكيل الدوائر العصبية في الفئران حديثي الولادة. على سبيل المثال، يقوم كاريو et al. تصوير مرور الزمن تسلق الألياف في المخيخ في الأسبوع بعد الولادة الثانية3. كيليو بورترا et al. عن تصوير محاور عصبية في الطبقة القشرية 1 في أول أسبوع بعد الولادة4. في الدراسة الحالية، ويمكننا تلخيص بروتوكول لمراقبة طبقة 4 القشرية الخلايا العصبية وعلى dendrites في الفئران حديثي الولادة. وترد النتائج التي تم الحصول عليها بتطبيق هذا البروتوكول، التي تتضمن منهجيات اثنين، في لدينا منشور الأخيرة5. أولاً، نحن نستخدم5،نظام ناقل سوبر نوفا6 لوضع العلامات الفردية من الخلايا العصبية في الدماغ الولدان. في نظام سوبر نوفا، البروتينات الفلورية تستخدم لتسمية الخلايا العصبية الجينات الخاصة بخلية قابلة للصرف والمسمى ضربة قاضية وتحليلات التحرير/خروج المغلوب أيضا ممكنة. ثانيا، نحن تصف إجراء العمليات جراحية لإعداد إطار الجمجمة في الفئران حديثي الولادة الهشة. معا، تسمح هذه المنهجيات في فيفو الملاحظة الفردية الخلايا العصبية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وينبغي إجراء تجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في مؤسسة المجرب الرفق بالحيوان.
1. إعداد الجراء للتصوير
ملاحظة: الجراء مع الخلايا العصبية القشرية المسماة قليلة ويمكن الحصول في الرحم انهانسر (IUE) الفائق ناقلات5،6. يتكون نظام مستعر أعظم من موجهات اثنين التالية: ترى-لجنة المساواة العرقية وكاج-لوكسب-توقف-لوكسب-س جين-آيريس--نقل واكتساب التكنولوجيا-وبر. وسم متفرق في هذا النظام، تعتمد على التسرب ترى. في عدد سكان متفرق transfected الخلايا العصبية، محركات ترى التعبير ضعيفة من لجنة المساواة العرقية ونقل واكتساب التكنولوجيا. وفي وقت لاحق، فقط في هذه الخلايا، يسر التعبير عن الجين X ردود فعل إيجابية من دورات ترى نقل واكتساب التكنولوجيا. حقق متفرق ومشرق العلامات يسمح تصور التفاصيل المورفولوجية للخلايا العصبية الفردية في فيفو. لم ترد تفاصيل الإجراء IUE في وصف هذا البروتوكول نظراً لأنها كانت في مكان آخر7،،من89،،من1011.
- إعداد الفئران الحوامل في الوقت المناسب ل IUE.
- تعد حلاً الحمض النووي ل IUE. لوسم متفرق مع طلب تقديم العروض، استخدام محلول يحتوي على pK031:TRE-لجنة المساواة العرقية (5 نانوغرام/ميليلتر) ومن pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 ميكروغرام/ميليلتر) أو محلول يحتوي على pK031:TRE-لجنة المساواة العرقية (5 نانوغرام/ميليلتر) و pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 ميكروغرام/ميليلتر).
ملاحظة: يمكن التعبير عن مختلف البروتينات في الخلايا العصبية المسماة باستخدام تركيبات مختلفة من العوامل الناقلة للمرض. أيضا، مختلف الجينات يمكن طرقت إلى أسفل أو طرقت السحب على وجه التحديد في الخلايا المسماة5،6 (مثلاً، سلسلة من النواقل لنظام سوبر نوفا متوفرة من مركز الأبحاث بتبريد بيوريسورسي ومن أدجيني). - أداء العادية IUE7،،من89،10،11 إلى تسمية الخلايا العصبية القشرية. لتسمية الخلايا العصبية طبقة 4، استخدام الجنينية يوم 14 الأجنة.
- الانتظار للتسليم ألجرو والنمو.
2-جراحة
- تخدير الولادة ألجرو (P5) يوم-5 استخدام غاز إيسوفلوراني (1.0%). إجراء اختبار الذيل-قرصه للتحقق من مستوى التخدير. إذا كان ألجرو يستجيب إلى رشة، زيادة تركيز isoflurane (يصل إلى 2.0 في المائة) أو انتظر حتى يختفي الاستجابة. الحفاظ على درجة حرارة الجسم ألجرو أثناء الجراحة باستخدام وسادة تدفئة.
- حقن تحت الجلد مسكن (والايبوبروفين، 5 مغ/كغ).
- تعقيم الجلد ألجرو تغطي الجمجمة بالمسح عليه مع الإيثانول 70% ثلاث مرات.
- قم بإزالة حوالي 20 مم2 من الجلد تغطي الجمجمة باستخدام مقص التعقيم مع الإيثانول 70% (الشكل 1A).
- إزالة اللفافة الجمجمة باستخدام الملقط المعقم ومسحه القطن نظيفة ومعقمة (الشكل 1A).
- تطبيق لاصق الأنسجة باستخدام تلميحات التحميل إلى سطح الجلد قطعي لوقف النزيف. لا تنطبق لاصق الأنسجة إلى منطقة التصوير (الشكل 1B) لأن هذا يزيد من صعوبة فتح الجمجمة.
- ضع ألجرو على وسادة تدفئة (37 درجة مئوية) والسماح للتعافي من التخدير. انتظر حتى لاصق الأنسجة قد جفت ووطدت (حوالي 30 دقيقة).
- إذا لزم الأمر، تطبيق أكثر الأنسجة لاصقة وانتظر حتى تجف وترسيخ.
3-إعداد الإطار الجمجمة
- تخدير ألجرو باستخدام إيسوفلوراني (1.0%-2.0%)، والتحقق من مستوى التخدير باختبار قرصه الذيل.
- فتح الجمجمة بعناية مع شفرة حلاقة معقم يترك دوراً سليمة (قطرها 1 ملم) (الشكل 1). استخدام اسفنجة جيلاتين (مقطعة إلى قطع صغيرة، تقريبا < 2 مم3، باستخدام مقص معقم، وتطبيقها باستخدام الملقط) غارقة في القشرة العازلة12 (125 mmol/لتر كلوريد الصوديوم، 5 ملمول/لتر بوكل، الجلوكوز 10 ملمول/لتر، 10 ملمول/لتر هيبيس، 2 ملمول/لتر كاكل2 ، و 2 ملمول/لتر مجسو4؛ الرقم الهيدروجيني 7.4؛ موسم 300/لتر؛ درجة حرارة الغرفة) وقف النزيف. عند فتح الجمجمة، تنطبق قشرة عازلة للحفاظ على رطوبة سطح الدماغ.
- قم بإزالة أي المخزن المؤقت والدم من السطح دورال باستخدام اسفنجة جيلاتين. تطبيق نصائح طبقة رقيقة من 1.0% [اغروس] نقطة انصهار منخفضة (حله في المخزن المؤقت اللحاء) استخدام أصفر. استخدام جهاز كتلة حرارة، الحفاظ على درجة الحرارة من أن الحل [اغروس] في 42 درجة مئوية حتى التطبيق.
ملاحظة: تجفيف المخزن المؤقت والدم يجب إجراء من جانب اوديما مع الحرص أن الأسفنج الجيلاتين الجاف لا تأتي على اتصال بلده دوراً. عدم القيام بذلك قد تضر بلده دوراً. - تطبيق زجاج جولة ساترة (رقم 1، 3 مم في القطر) على الطبقة [اغروس] هلام. إزالة كافة الفقاعات بين ساترة والطبقة [اغروس] هلام بصب فائض [اغروس] هلام بينهما. إزالة الجل الزائد بارزة من تحت ساترة استخدام الملقط (الشكل 1 و 1E).
- تأمين ساترة استخدام الأسمنت الأسنان (الشكل 1F).
- مزيج مسحوق الأسمنت والأسمنت السائل. تطبيق هذا الخليط باستخدام النصائح الصفراء قبل أن يصبح وطدت. لا تنطبق الأسنان من الأسمنت على دوراً، لأن هذا قد تلف الدماغ.
- إرفاق تيتانيوم عقيمة شريط (العرف، حوالي 30 ملغ، انظر الشكل 1) في عظم الجمجمة باستخدام الأسمنت الأسنان. قم بمحاذاة شريط التيتانيوم وساترة (على السطح لدورا) بالتوازي التقاط الصور بسهولة.
- تغطي الجمجمة المكشوفة مع الأسمنت الأسنان (الشكل 1 ح).
- استرداد ألجرو من التخدير. يبقيه على سخان (37 درجة مئوية) حتى الأسمنت الأسنان وقد وطدت (ح 1).
4-اثنين-فوتون التصوير
ملاحظة: الصور في فيفو في الشكل 2 تم الحصول عليها باستخدام مجهر اثنين-فوتون مع ليزر ياقوت التيتانيوم (شعاع قطرها [1/ه2]2: 1.2 مم).
- تعيين الطول الموجي الليزر اثنين-فوتون. لطلب تقديم العروض الإثارة، استخدام 1,000 نانومتر (450 ميجاوات/مم2 في 400 ميكرون من العمق).
ملاحظة: ينبغي خفض قوة الليزر كما z-الموقف الذي يتحرك صعودا. - مسح سطح ساترة مع الإيثانول 70%.
- تخدير ألجرو باستخدام إيسوفلوراني (2.0%-1.5%)، والتحقق من مستوى التخدير باستخدام اختبار قرصه الذيل.
- إرفاق ألجرو للوحة التيتانيوم في مرحلة التصوير باستخدام شريط تيتانيوم على الرأس ألجرو (الشكل 2 ألف و 2 باء). ضبط الرئيس مثل ساترة مواز للعدسة الهدف باستخدام مرحلة جونيوميتير (الشكل 2). الحفاظ على درجة حرارة الجسم ألجرو استخدام لوحة تدفئة (37 درجة مئوية).
- تعيين تركيز isoflurane إلى 0.7%-1.0 في المائة.
ملاحظة: قد يؤدي إلى تركيز عال جداً isoflurane الموت العرضي ألجرو أثناء التصوير. - ضع مرحلة التصوير تحت عدسة الهدف (20 س، غ 1.0) المجهر اثنين-فوتون (الشكل 2 و 2 ج).
- تطبيق قطره واحدة من الماء على ساترة. استخدم برنامج التحصين الموسع-الأسفار لتحديد موقع الخلايا العصبية المسماة البروتينات الفلورية في المنطقة حيث تعرضت في بلده دوراً.
- الحصول على الصور z-المكدس في فترات 1.4 ميكرومتر. لطبقة تعيين العصبية 4 التصوير، z-العرض إلى 150-300 ميكرون صورة مورفولوجية الجذعية كاملة (الشكل 2D و 2E). استخدام بطيئة والمسح الضوئي والمتوسط للحصول على صور واضحة تبين مورفولوجيا الخلايا العصبية (عادة ما يستغرق > 20 دقيقة اكتساب مورفولوجية الجذعية كاملة).
ملاحظة: ينصح المعلمات التالية للتصوير. الطول الموجي الإثارة: 1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط، والماسح الضوئي: نوع جلفانومتر، مرآة مزدوج اللون: 690 نانومتر، وتصفية الانبعاثات: 575-620 نانومتر ممر الموجه، وكاشف: نوع جاسب، الحصول على الإعداد > 100، صورة حجم > 512 × 512 ميكرومتر، مجال الرؤية > 600 × 600 ميكرون، بكسل القرار < 1.2 ميكرومتر.
5-التأهيل والتمريض
- فصل ألجرو من مرحلة التصوير.
- ضع ألجرو على سخان (37 درجة مئوية) ويسمح لها باستعادة (15 دقيقة).
- تغذية ألجرو الحليب الدافئ باستخدام ميكروبيبيتي على فترات 2-ح ولطف يحفز المعدة للسماح بإفراز. وتؤكد أن ألجرو هو شرب اللبن بقياس وزن الجسم.
6-إعادة التصوير
- تخدير ألجرو مع إيسوفلوراني (1.5-2.0%)، والتحقق من مستوى التخدير باستخدام اختبار قرصه الذيل. نعلق عليه إلى مرحلة التصوير.
- تحديد الخلايا العصبية المصورة مسبقاً والحصول على صورة z-مكدس. من السهل تحديد الخلايا العصبية نتيجة لتلك العلامات متفرق مع سوبر نوفا.
- كرر الخطوات من 5، 1-6، 2 حتى يتم الانتهاء من التصوير. ملاحظة: يمكن تصويرها ألجرو ما يصل إلى 18 ساعة دون فقدان الوزن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الأرقام في 2D - 2F إظهار نتائج الممثل من تصوير يومين-فوتون الوقت الفاصل بين الخلايا العصبية القشرية طبقة 4 باستخدام هذا البروتوكول. غرض التحليل، حدد الخلايا العصبية مع مورفولوجيا الجذعية واضحة طوال فترات التصوير. قمنا بتحليل مورفولوجية الجذعية من الخلايا العصبية المصورة باستخدام برمجيات تحليل الخصائص المورفولوجية. ويبين الشكل 2 واوالتعمير مورفولوجيا الجذعية الممثل. عرض قطع من الخلايا العصبية dendrites (الشكل 2) ينبغي أن تستبعد من التحليلات، لأنه قطع dendrites يشير إلى موت الخلايا الناجمة عن الأضرار أثناء الجراحة أو التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تكون الخلايا العصبية مع عدم وضوح نصائح الجذعية المستبعدة (مثلاً، العصبية مع رأس السهم في الشكل 2D).
رقم 1: جراحة، وإعداد إطار الجمجمة، ومرفق لشريط التيتانيوم (أ) هذا الفريق يوضح إزالة الجلد الذي يغطي الجمجمة. (ب) هذا الفريق يظهر تثبيت الفجوة بين الجلد والجمجمة. أن يكون حريصا على عدم تطبيق السندات إلى منطقة التصوير. (ج) هذا صورة دوراً المكشوفة. تم إدراج شفرة حلاقة بين الجمجمة ودورا، وكان فلابيد الجمجمة مفتوحة إلى يسار المنطقة المعرضة (رأس السهم). العظم يمكن ثم إزالتها بسهولة باستخدام الملقط. (د) هذا تصميم تخطيطي إظهار طريقة عرض عمودي من الإطار الجمجمة. يتم ملء الفجوة بين الزجاج غطاء ودورا مع طبقة رقيقة من [اغروس] هلام. هو ثابت ساترة للجمجمة باستخدام الأسمنت الأسنان. (ﻫ) مستدير ساترة ينصب على الطبقة [اغروس] هلام. (و) هذا صورة ساترة المضمون. (ز) هذا الفريق يظهر تصميم شريط التيتانيوم. شريط التيتانيوم يحتوي على اثنين من الثقوب المسمار للمرفق إلى مرحلة التصوير (انظر الشكل 2)، وجزء مسطح مستطيل واحد متصل بالرأس ألجرو. (ح) جزء مستطيل من التيتانيوم شريط موصولة إلى جمجمة ألجرو استخدام الأسمنت الأسنان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة. (أ) هذا الفريق يظهر تصميم لوحة التيتانيوم. وقد لوح التيتانيوم ثقبين المسمار لإرفاق شريط التيتانيوم وأربع فتحات المسامير لربط مرحلة جونيوميتير، التي وضعت في مرحلة التصوير. وتستخدم 2.5 ملم (في قطر) × 2 مم (الطول) مسامير للتثبيت. (ب) هذا صورة تمثيلية ألجرو المرفقة إلى مرحلة التصوير. يتم الحفاظ على درجة حرارة الجسم ألجرو استخدام سخان. (ج) ألجرو هو تخديره من استخدام isoflurane خلال في فيفو التصوير الداخلي. (د) هذا الفريق يظهر صورة Z-مكدس الوقت الفاصل بين ممثل لطبقة الخلايا العصبية القشرية 4 من ألجرو P5. يشير رأس السهم إلى العصبية مع dendrites غير واضحة، مما ينبغي إزالته من التحليل. (ه) هذا الفريق يظهر أعلى التكبير الوقت الفاصل بين الصور من العصبية مع الأسهم في الفريق د. رؤوس الأسهم الزرقاء: نصائح الجذعية التي يتم سحبه في رؤوس الأسهم ح 4.5، الأصفر: نصائح الجذعية التي هي ممدود في 4.5 ح، رؤوس الأسهم البيضاء الصغيرة: إكسون الخلية المجاورة. (و) هذا نموذج ثلاثي الأبعاد للتتبع الجذعية من الخلايا العصبية في الشكل الأيسر من لوحة ه. دوائر زرقاء تشير إلى موقف جسم الخلية. (ز) يظهر هذا الفريق الممثل من الخلايا العصبية مع قطع dendrites، التي لم يتم تضمينها في التحليل. نموذج البيانات في ألواح د - ز تحتوي على NR1 (فرعية أساسية من مستقبلات الجلوتامات من نوع نمدا)-خرج-الخلايا العصبية (بسبب قلة البيانات المتاحة من المؤلفين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:
أن الخطوة الأكثر أهمية للبروتوكول هو إزالة الجمجمة (الخطوة 3، 2 من البروتوكول). عند الإدراج، تلتزم شفرة حلاقة غالباً دوراً، مما تسبب في نزيف دورال وتلف الدماغ. ويمكن تجنب هذا بإضافة قطره من المخزن المؤقت اللحاء في الجمجمة وإزالة الجمجمة في المخزن المؤقت للقشرة.
نزيف من دوراً والجلد بعد إعداد الإطار الجمجمة يؤدي إلى انسداد الإطار. لتجنب هذا، الأنسجة الأسمنت لاصقة والأسنان المستخدمة ينبغي أن يسمح ليجف تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. وينبغي إعداد الجراء متعددة مع نافذة الجمجمة نظراً لأنه من الصعب تماما تجنب النزيف. بشكل عام، إذا كان الإطار الجمجمة تظل واضحة ومستقرة لجراحة بعد 2-3 ح، يمكن استخدامها ألجرو للوقت الفاصل بين التصوير.
أهمية الأسلوب فيما يتعلق بالأساليب القائمة البديلة:
هنا، لقد قمنا بوصف أسلوب في فيفو اثنين-فوتون التصوير من قشرة الأطفال حديثي الولادة. هذا البروتوكول له عدة مزايا مقارنة بأساليب سبق الإبلاغ عنها. يتم سرد هذه على النحو التالي.
1) يمكن تسمية الخلايا العصبية القشرية قليلة والزاهية قبل ترانسفيكتينج الفائق ناقلات استخدام IUE. IUE تستخدم على نطاق واسع للعلامات من الخلايا العصبية القشرية أثناء تطوير المراحل. ومع ذلك، IUE بسيطة غير مناسب لتصوير الخلايا العصبية الفردية حيث الخلايا العصبية قد وصفت جداً كثيفة7،،من89،10. وعلاوة على ذلك، باستخدام نظام سوبر نوفا، يمكن استخدام أنواع مختلفة من البروتينات الفلورية لتصنيف السكان متفرق من الخلايا العصبية. على سبيل المثال، استخدام سوبر نوفا بوساطة وسم متفرق مؤشر الكالسيوم وراثيا المرمزة جكامب13،14، نحن مؤخرا أدوا بتحليل وظيفي للخلايا العصبية الفردية في طبقة اللحاء النامية 4 (P3 إلى P13) 15.
2) الطريقة الموضحة في هذه الدراسة مناسبة لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطوير الدوائر العصبية. ويتيح هذا النظام الفائق قليلة المسمى بالضربة القاضية الخاصة بخلية أي الجينات. وهكذا، يمكن ملاحظة ديناميات خلية تحتوي على خلل جينات محددة. ولهذا الغرض، أبلغ سابقا الأنظمة المستندة إلى علم الوراثة مثل مآدم16 و17 من البقعة. ومع ذلك، نظراً لأن تربية الماوس الخطوط الأساسية لهذه النظم، أنها تتطلب الكثير من الوقت والتكلفة من البروتوكول هو موضح هنا.
3) هذه الدراسة تستخدم شفرة حلاقة لإزالة الجمجمة. وهذا يقلل النزيف من دوراً، ويسمح افتتاح منطقة واسعة من الجمجمة (< 2 ملم في القطر). باستخدام هذا الإجراء، كان من الممكن لمراقبة النشاط العفوي لطبقة الخلايا العصبية 4 في منطقة البرميل الكبيرة كاملة داخل قشرة سوماتوسينسوري15.
القيود المفروضة على الأسلوب:
سيئات في فيفو تصوير الدماغ الولدان الماوس، مقارنة مع تصوير الحيوانات شفافة مثل يرقات الزرد و النمو الضفادع الصغيرة، هو انخفاض القرار المكانية والزمانية. ينبغي إجراء مسح بطيئة والمتوسط تسفر عن صور واضحة من مورفولوجيا الخلايا العصبية لنثر مزيد من الضوء يحدث في الدماغ الماوس. ربما يمكن تخفيض تشتت الضوء باستخدام ليزر الطول موجي أطول للإثارة بروتين فلوري والبروتينات مع أطول الأطوال الموجية الانبعاثات الأسفار.
ويمكن تقييد آخر لهذا البروتوكول أن عملية جراحية لزرع نافذة الجمجمة قد تؤثر على تشكيل دارة القشرية العادي بسبب التهاب الدماغ12. ومع ذلك، هناك احتمال كبير أن التصوير في فيفو الفسيولوجية أكثر مقارنة مع التصوير في المختبر مثل تصوير الوقت الفاصل بين إعداد شريحة الدماغ، التي ينبغي أيضا أن تؤدي إلى التهاب حاد الاسكيمية، وتشريح. وأفيد أيضا أن التعرض المتكرر ل isoflurane قد تؤثر على العديد من العمليات العصبية18. ينبغي أن تجري تجارب التحكم للتحقق من مدى ملاءمة النتائج التي حصل عليها في فيفو التصوير. في حالة التصوير لدينا طبقة 4 الخلايا العصبية في قشرة somatosensory، أكدنا بزيادة طبيعية في إجمالي طول الجذعية واقتناء تحيز اتجاه إسقاطات الجذعية من الخلايا العصبية النجمية شوكي5،20.
وأفادت الدراسات الحديثة > 1-مم-تصوير العمق في الدماغ الكبار ماوس حيث تمت إزالة دوراً أثناء الجراحة19. من ناحية أخرى، تمكنا من التقرير ما يصل إلى 400 ميكرون-عمق التصوير في حديثي الولادة5. نظراً لدورا لا يمكن إزالتها عند الولدان، وهذا، بدوره، يؤدي إلى تشتت ضوء عالية، نحن نعتبر أن تصوير عميق في حديثي الولادة أكثر صعوبة من البالغين. ينبغي أن تسمح تحسين المستقبل في المسابير الفلورسنت، وأشعة الليزر، وكاشفات عميقة التصوير في أدمغة الأطفال حديثي الولادة.
حتى الآن، وقد أبلغنا 18 ساعة الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام البروتوكول الحالي5. في الآونة الأخيرة، نجحنا في 72 ساعة الوقت الفاصل بين التصوير بتحسين20من البروتوكول. سوف نواصل تحسين البروتوكول المعروضة هنا (مثلاً، الوقت الأطول أجلاً، أعلى، و/أو تصوير القرار المكانية) للكشف عن آليات حيوية لتطوير الدوائر العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون ساتو ت. وم. كانباياشي كوياما س. للمساعدة التقنية. JSPS كاكينهي منحة أرقام JP15K14322 و JP16H06143، ومؤسسة العلوم وتاكيدا، مؤسسة النصب التذكاري أوهارا، والتعاونية البحوث المشروع من جامعة نيغاتا الدماغ بحوث المعهد عام 2017-2923 (صاحب الجلالة) وتم تأييد هذا العمل JP16K14559 كاكينهي، JP15H01454، و JP15H04263، ومنحة في البحث العلمي في مجالات الابتكار "التنظيم الديناميكي وظيفة المخ بالخردة وبناء نظام" (JP16H06459) من يأمرون (منظمة الشفافية الدولية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
