Summary
我们提出了一种用于成像新生小鼠大脑皮层的活体双光子成像协议。该方法适用于分析皮层神经元的发育动态、控制神经元动力学的分子机制以及疾病模型神经元动力学的变化。
Abstract
双光子成像是一种强大的工具, 用于体内分析哺乳动物大脑中的神经元电路。然而, 存在着有限数量的活体成像方法来检查活的新生哺乳动物的脑组织。本文综述了一种用于活体新生小鼠单个皮层神经元成像的协议。本议定书包括以下两种方法: (1) 在发育中脑皮层神经元稀疏和明亮标记的超新星系统, 以及 (2) 易碎新生儿颅骨的外科手术。该协议允许在高信噪比的新生儿阶段观察单个皮质突起的时间变化。通过将超新星与 RNA 干扰和 CRISPR/Cas9 基因编辑系统相结合, 也可以实现标记细胞特异基因的沉默和挖空。因此, 该协议可用于分析皮层神经元的发展动态、控制神经元动力学的分子机制, 以及疾病模型中神经元动力学的变化。
Introduction
脑皮层神经元电路的精确布线对于更高的大脑功能 (包括知觉、认知、学习和记忆) 至关重要。皮质电路在产后发育过程中动态地被提炼。通过组织学和体外培养分析, 研究了皮层电路的形成过程。然而, 活哺乳动物中的电路形成的动力学仍然主要是未知的。
双光子显微术已广泛应用于成人小鼠脑1、2神经元回路的体内分析。然而, 由于技术上的挑战, 只有有限数量的研究解决了新生小鼠神经元回路的形成。例如, Carrillo et 等执行了在第二个产后周3的小脑中攀爬纤维的延时成像。Portera-他等报道了第一个产后周4皮层层1的轴突成像。在本研究中, 我们总结了一个协议, 观察4层皮层神经元及其在新生小鼠的树突。在我们最近发表的5号出版物中报告了应用本议定书所获得的结果, 其中包括两种方法。首先, 我们使用超新星矢量系统5,6用于标记新生儿大脑中的单个神经元。在超新星系统中, 用于神经元标记的荧光蛋白是可交换的, 标记细胞特异基因敲除和编辑/挖空分析也是可能的。其次, 我们描述了在脆弱的新生小鼠颅窗准备的外科手术。这些方法结合在一起, 允许在体内观察新生儿大脑中的单个神经元。
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Protocol
实验应按照实验机构规定的动物福利准则进行。
1. 制备用于成像的幼崽
注意: 有稀疏标记的皮层神经元的幼崽可通过超新星载体5,6的子宫电穿孔 (井植敏) 获得。超新星系统由以下两个载体组成: TRE-转基因-转基因-ires-WPRE。在该系统中, 稀疏标记依赖于 TRE 泄漏。在转染神经元的稀疏种群中, TRE 驱动了 Cre 和 tTA 的弱表达。随后, 只有在这些细胞中, 基因 X 的表达通过 tTA-TRE 循环的正反馈来促进。所实现的稀疏和明亮的标签允许在体内的个体神经元的形态学细节的可视化。井植敏程序的详细信息未在本协议中描述, 因为它们已在别处描述过7、8、9、10、11。
- 为井植敏准备定时怀孕的小鼠。
- 为井植敏准备 DNA 溶液。对于带有 RFP 的稀疏标签, 请使用包含 pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) 和 pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) 的解决方案或包含 pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) 和 pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) 的解决方案。
注: 各种蛋白质可以用不同的载体组合在标记神经元中表达。此外, 各种基因可以被击倒或被敲出专门在标记的细胞5,6 (例如, 一系列的超新星系统的矢量可从理研生物资源研究中心和从 Addgene)。 - 执行常规井植敏7,8,9,10,11标签皮层神经元。对于4层神经元的标记, 使用胚胎 day-14 胚胎。
- 等待幼崽的分娩和成长。
2. 手术
- 使用异氟醚气体 (1.0%) 麻醉产后 day-5 (P5) 幼崽。执行尾部捏试验检查麻醉水平。如果幼崽响应捏, 增加异氟醚浓度 (高达 2.0%) 或等待, 直到反应消失。使用加热垫在手术过程中保持幼崽的体温。
- 皮下注射镇痛药 (卡洛芬, 5 毫克/千克)。
- 用70% 乙醇擦拭三次, 对小狗的皮肤进行消毒。
- 使用70% 乙醇灭菌的剪刀去除大约20毫米2的皮肤覆盖头骨 (图 1A)。
- 使用灭菌钳和干净、无菌棉签 (图 1A) 去除颅骨筋膜。
- 应用组织粘合剂使用加载提示到锐裂的皮肤表面停止出血。不要将组织粘合剂应用于成像区域 (图 1B), 因为这使得颅骨的开口更加困难。
- 将小狗放在加热垫上 (37 摄氏度), 并允许它从麻醉中恢复。等待, 直到组织粘合剂干燥和凝固 (约30分钟)。
- 如有必要, 应用更多的纸巾, 等待它干燥和凝固。
3. 颅骨窗准备
- 使用异氟醚 (1.0%-2.0%) 麻醉小狗, 并通过尾部捏试验检查麻醉水平。
- 小心地打开头骨与消毒剃刀刀片留下硬脑膜完好 (直径1毫米) (图 1C)。使用明胶海绵 (切成小块, 约 < 2 毫米3, 使用灭菌剪刀, 并用镊子) 浸泡在皮质缓冲液12 (125 毫摩尔/l 氯化钠, 5 毫摩尔/l 氯化钾, 10 毫摩尔/升葡萄糖, 10 毫摩尔/升 HEPES, 2 毫摩尔/升 CaCl2和2毫摩尔 MgSO4;pH 值 7.4;300 mOsm/升;室温) 止血。当打开头骨时, 应用皮质缓冲液保持大脑表面湿润。
- 使用明胶海绵去除硬脑膜表面的任何缓冲液和血液。使用黄色提示应用薄层1.0% 低熔点琼脂糖 (溶于皮质缓冲液)。使用热块机, 保持琼脂糖溶液在42°C 的温度, 直到应用。
注意: 缓冲液和血液的排泄必须从开颅手术的一侧进行, 同时注意干性明胶海绵不会接触硬脑膜。否则可能会损坏硬脑膜。 - 将圆形玻璃盖玻片 (直径为1、3 mm) 涂在琼脂糖凝胶层上。在盖玻片和琼脂糖凝胶层之间倒入过量的琼脂糖凝胶, 去除所有气泡。用镊子从盖玻片下凸出多余的凝胶 (图 1D和1E)。
- 使用牙科水泥固定盖玻片 (图 1F)。
- 混合水泥粉和水泥液。在凝固前使用黄色尖端涂抹混合物。不要在硬脑膜上应用牙科水泥, 因为这可能会损害大脑。
- 使用牙科水泥将无菌钛棒 (定制, 约30毫克, 见图 1G) 在颅骨骨上附着。平行对齐钛条和盖玻片 (硬脑膜表面), 轻松捕捉图像。
- 用牙科水泥覆盖裸露的头骨 (图 1H)。
- 从麻醉中恢复幼崽。保持在加热器 (37 摄氏度), 直到牙科水泥凝固 (1 小时)。
4. 双光子成像
注:图 2 中的体内图像是使用带有钛蓝宝石激光器的双光子显微镜 (光束直径 [1/e2]2: 1.2 mm) 获得的。
- 设置双光子激光波长。对于 RFP 激励, 使用 1000 nm (450 mW/毫米2在400µm 深度)。
注意: 当 z 位置向上移动时, 激光功率应减小。 - 用70% 乙醇擦拭盖玻片表面。
- 使用异氟醚 (1.5%-2.0%) 麻醉小狗, 用尾部捏试验检查麻醉水平。
- 使用小狗头上的钛条 (图 2A和2B) 将幼崽连接到成像台上的钛板上。调整头部, 使盖玻片与物镜平行, 使用测角器阶段 (图 2B)。使用加热垫 (37 摄氏度) 保持幼崽的体温。
- 将异氟醚浓度设置为 0.7%-1.0%。
注意: 极高的异氟醚浓度可能导致小狗在成像过程中意外死亡。 - 将成像阶段置于双光子显微镜 (图 2B和2C) 的物镜透镜 (20X, NA 1.0) 下。
- 将一滴水涂在盖玻片上。使用 epi 荧光在硬脑膜暴露的区域找到荧光蛋白标记的神经元。
- 以1.4 µm 的间隔获取 z 堆栈图像。对于4层神经元成像, 将 z 宽度设置为 150-300 µm, 以图像整个树突状形态学 (图 2D和2E)。使用慢速扫描和平均值获取清晰的图像, 显示神经元形态学 (通常需要 > 20 分钟才能获得整个树突形态)。
注意: 建议使用以下参数进行成像。激发波长: 1000 nm, 扫描仪: 振镜类型, 分色镜: 690 nm, 排放滤波器: 575-620 nm 带通, 探测器: GaAsP 类型, 增益设置 > 100, 图像大小 > 512 x 512 µm, 视场 > 600 x 600 µm, 像素分辨率 < 1.2 µm。
5. 康复和护理
- 从成像阶段分离幼崽。
- 将小狗放在加热器上 (37 摄氏度), 让它恢复 (15 分钟)。
- 用2小时间隔的微量吸管喂幼崽温热的牛奶, 轻轻刺激胃, 使其排泄。确认幼崽通过测量其体重来饮用牛奶。
6. 重新成像
- 麻醉的小狗与异氟醚 (1.5%-2.0%), 并检查麻醉水平使用尾部捏试验。将其附加到成像阶段。
- 找到先前成像的神经元并获取 z 堆栈图像。由于其稀疏的超新星标记, 神经元的识别很容易。
- 重复步骤 5.1-6.2, 直到映像完成。注意: 小狗可以成像高达18小时, 而不会失去重量。
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Representative Results
图 2D - 2F显示了使用本协议的4层皮层神经元双光子时移成像的代表性结果。为了分析, 在整个成像周期中选择具有清晰树突状形态学的神经元。利用形态学分析软件对成像神经元的树突形态学进行了分析。代表性的树突形态学重建如图 2F所示。显示断开连接的树突的神经元 (图 2G) 应排除在分析之外, 因为断开的树突表示在手术或成像过程中损伤引起的细胞死亡。此外, 应排除具有模糊树突尖端的神经元 (例如,图 2D中带箭头的神经元)。
图 1: 手术、颅窗准备和钛棒的附着.(A) 此面板显示了覆盖头骨的皮肤的去除。(B) 此面板显示了皮肤与头骨之间的间隙的固定。注意不要将粘合应用到成像区域。(C) 这是暴露的硬脑膜的图像。在头骨和硬脑膜之间插入了剃刀刀片, 头骨被拍打在裸露区域 (箭头) 的左侧。然后可以使用镊子轻松去除骨骼。(D) 这是一个示意图设计, 显示颅骨窗口的垂直视图。盖玻片与硬脑膜之间的空隙是用一层薄薄的琼脂糖凝胶填充的。盖玻片用牙科水泥固定在头骨上。(E) 在琼脂糖凝胶层上放置圆形盖玻片。(F) 这是安全盖玻片的图像。(G) 此面板显示了钛棒的设计。钛棒包含两个螺钉孔, 用于连接到成像阶段 (见图 2) 和一个连接在小狗头上的扁平矩形部分。(H) 钛棒的矩形部分使用牙科水泥附着在小狗的头骨上。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 新生小鼠皮层神经元的体内双光子成像。(A) 该面板显示钛板的设计。钛板有两个螺丝孔, 用于连接钛棒和四螺孔, 用于连接测角台, 放置在成像台上。2.5 毫米 (直径) x 2 毫米 (长度) 螺钉用于固定。(B) 这是连接到成像阶段的幼崽的代表性图像。小狗的体温是用加热器维持的。(C)在体内成像过程中, 小狗使用异氟醚进行麻醉。(D) 此面板显示一个 P5 小狗4层皮质神经元的有代表性的 Z 堆栈时移图像。箭头指示神经元具有模糊的树突, 应从分析中移除。(E) 面板D中的箭头显示了神经元的更高放大倍率延时图像。蓝色箭头: 在 4.5 h、黄色箭头中缩回的树枝状尖端: 在 4.5 h 中拉长的树枝状尖端, 白色小箭头: 相邻细胞的轴突。(F) 这是一个3维模型的神经元的树突状轨迹, 在E面板的左图中。蓝色圆圈表示细胞体的位置。(G) 此面板显示具有断开连接树突的具有代表性的神经元, 不包括在分析中。面板D G中的样本数据包含 NR1 (NMDA 型谷氨酸受体的一个基本亚基)--被击出的神经元 (由于作者提供的有限数据)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
协议和故障排除中的关键步骤:
该协议最关键的步骤是删除头骨 (协议步骤 3.2)。插入时, 刀片通常附着硬脑膜, 导致硬脑膜出血和大脑损伤。这可以避免通过添加一滴皮质缓冲液在头骨和删除头骨在皮质缓冲区。
颅窗准备后, 硬脑膜和皮肤出血导致窗口闭塞。为了避免这种, 在继续下一步之前, 应允许使用组织粘合剂和牙科水泥完全干燥。由于很难完全避免出血, 因此应准备多个有颅窗的幼崽。一般而言, 如果颅窗在手术后 2-3 小时内保持清晰稳定, 幼崽可用于延时成像。
与现有/替代方法有关的方法的重要性:
在这里, 我们描述了一种在体内两光子成像的新生儿皮层的方法。与以前报告的方法相比, 此协议有几个优点。这些列如下所示。
1) 皮层神经元可以是稀疏和明亮的标记的转染超新星载体使用井植敏。井植敏在发育阶段被广泛用于皮层神经元的标记。然而, 一个简单的井植敏不适合单个神经元的成像, 因为神经元可能被标记太密7,8,9,10。此外, 使用超新星系统, 各种类型的荧光蛋白可用于标记稀疏种群的神经元。例如, 使用超新星介导的基因编码钙指标 GCaMP13,14的稀疏标记, 我们最近进行了功能分析的单个神经元在发展中皮层层 4 (P3 到 P13)15。
2) 本研究所述方法适用于阐明神经元电路发展的分子机制。超新星系统允许稀疏标记细胞特异性敲除任何基因。因此, 可以观察到包含特定基因中断的神经元的动力学。为此, 以前报告了基于遗传学的系统, 如多属性决策16和光滑17 。然而, 由于小鼠系的育种对于这些系统来说是必不可少的, 所以它们需要的时间和成本要比这里描述的协议要多。
3) 本研究利用刀片进行颅骨切除。这最大限度地减少了硬脑膜出血, 并允许打开头骨的大面积 (< 直径2毫米)。使用此程序, 可以观察4层神经元在体感皮层15中的整个大桶区的自发活动。
方法的局限性:
与像斑马鱼幼虫和爪蟾蝌蚪等透明动物的成像相比, 小鼠新生脑的活体成像的缺点是空间和时间分辨率较低。慢扫描和平均应执行, 以产生清晰的神经元形态学图像, 因为更多的光散射发生在小鼠大脑。光散射可能会减少使用更长的波长激光荧光蛋白激发和蛋白质具有较长的荧光发射波长。
本议定书的另一个局限性可能是颅窗植入手术可能影响正常皮质电路的形成, 由于脑炎症12。然而, 有很大的可能性,在体内成像比体外成像, 如脑切片制备时移成像, 也应引起严重炎症的缺血和切片。还有报道说, 重复接触异氟醚可能影响几个神经元过程18。应进行对照实验, 验证体内成像结果的适用性。在我们对体感皮层的4层神经元进行成像时, 我们确认了树突状神经元的总枝晶长度正常增加, 并获得了多刺星状神经元的树突投影的取向偏差5,20。
最近的研究报告 > 1 毫米深度成像在一个成年小鼠大脑, 其中硬脑膜被删除在手术19。另一方面, 我们已经能够报告 400-µm 深度成像在新生儿5。由于硬脑膜不能在新生儿中移除, 这反过来又导致高光散射, 我们认为在新生儿的深度成像比成人更具挑战性。荧光探针、激光器和探测器的未来改进应允许在新生儿大脑中进行深层成像。
到目前为止, 我们已使用本议定书5报告了18小时的延时成像。最近, 我们通过改进协议20成功地完成了72小时的延时成像。我们将继续完善此处提供的协议 (例如, 较长的时间、更高的时段和/或空间分辨率成像), 以揭示神经元电路开发的动态机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢佐藤、m. 上林和 s. Kouyama 的技术援助。这项工作得到了 jsp KAKENHI 赠款号 JP15K14322 和 JP16H06143、武田科学基金会、上原纪念基金会以及新泻大学脑科学研究所 2017-2923 (陛下) 的合作研究项目的支持, 并由KAKENHI JP16K14559、JP15H01454、JP15H04263 和赠款--在创新领域的科学研究 "从 JP16H06459 (MEXT) 的废料 & 构建系统的动态调节大脑功能" (T.I.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
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