Summary
Vi præsenterer en i vivo to-foton imaging protokol for imaging hjernebarken af neonatal mus. Denne metode er egnet til at analysere den udviklingsmæssige dynamics af kortikale neuroner, de molekylære mekanismer, der styrer neuronal dynamik og ændringer i neuronal dynamics i sygdomsmodeller.
Abstract
To-foton imaging er et kraftfuldt værktøj i vivo analyse af neuronal kredsløb i hjernen, pattedyr. Dog findes et begrænset antal i vivo billeddannelse metoder for behandlingen af hjernevæv af levende nyfødte pattedyr. Heri opsummere vi en protokol for imaging individuelle kortikale neuroner i levende neonatal mus. Denne protokol omfatter de følgende to metoder: (1) Supernova system for sparsom og lyse mærkning af kortikale neuroner i udviklingslandene hjernen, og (2) en kirurgisk procedure for skrøbelige neonatal kraniet. Denne protokol giver mulighed for observation af tidsmæssige ændringer af individuelle kortikale neurites neonatal etaper med en høj signal-støj-forhold. Mærket celle-specifik genhæmning og knockout kan også opnås ved at kombinere Supernova med RNA-interferens og CRISPR/Cas9 gen redigering systemer. Denne protokol kan således bruges til at analysere den udviklingsmæssige dynamics af kortikale neuroner, molekylære mekanismer, der styrer neuronal dynamics, og ændringer i neuronal dynamics i sygdomsmodeller.
Introduction
Den præcise ledninger af neuronal kredsløb i hjernebarken er afgørende for højere hjernefunktioner herunder perception, kognition, og indlæring og hukommelse. Kortikale kredsløb er dynamisk raffineret under postnatal udvikling. Studier har undersøgt processen af kortikale kredsløb dannelse ved hjælp af histologiske og in vitro- kultur analyser. Men dynamikken i kredsløb dannelse i levende pattedyr er forblevet det meste uudforsket.
To-foton mikroskopi har været meget anvendt i vivo -analyser af neuronal kredsløb i voksen mus hjernen1,2. Men på grund af tekniske udfordringer, kun et begrænset antal studier har behandlet neuronal kredsløb dannelse i nyfødte mus. For eksempel udførte Carrillo et al. den time-lapse billeddannelse af klatring fibre i lillehjernen i den anden postnatal uge3. Portera-Cailliau et al. rapporteret billeddannelse af axoner i kortikale lag 1 i den første postnatal uge4. I den foreliggende undersøgelse opsummere vi en protokol til iagttagelse af lag 4 kortikale neuroner og deres dendritter i nyfødte mus. Resultater, der opnås ved anvendelse af denne protokol, som omfatter to metoder, der rapporteres i vores seneste publikation5. Først bruger vi Supernova vektor system5,6 for mærkning individuelle neuroner i hjernen, neonatal. I ordningen for Supernova fluorescerende proteiner bruges til neuronal mærkning er udskiftelige og mærket celle-specifikke gen knockdown og redigering/knockout analyser er også muligt. For det andet, vi beskrive en kirurgisk procedure for kraniel vindue forberedelse i skrøbelige neonatal mus. Sammen, tillade disse metodologier i vivo observation af individuelle neuroner i neonatal hjerner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene skal udføres i overensstemmelse med retningslinjerne dyrevelfærd ordineret af den eksperimentatoren institution.
1. forberedelse af hvalpe til billedbehandling
Bemærk: Hvalpe med tyndt mærket kortikale neuroner kan opnås ved i utero elektroporation (IUE) af Supernova vektorer5,6. Supernova system består af de følgende to vektorer: TRE-Cre og CAG-loxP-STOP-loxP-gen X-ires-tTA-WPRE. I dette system, sparsom mærkning er baseret på TRE lækage. I et tyndt befolkede områder af transfekteret neuroner drev TRE den svage udtryk for Cre og tTA. Efterfølgende, kun i disse celler, er udtryk for gen X lettet ved en positiv feedback af tTA-TRE cyklusser. Den opnåede sparsom og lyse mærkning tillader visualisering af morfologiske oplysninger om individuelle neuroner in vivo. Nærmere oplysninger om proceduren for IUE er ikke beskrevet i denne protokol, da de har været beskrevet andetsteds7,8,9,10,11.
- Forberede timed-gravide mus til IUE.
- Forbered en DNA løsning på IUE. For sparsomme mærkning med RFP, bruge en opløsning indeholdende pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) og pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) eller en opløsning indeholdende pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) og pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL).
Bemærk: Forskellige proteiner kan udtrykkes i mærket neuroner ved hjælp af forskellige kombinationer af vektorer. Også forskellige gener kan blive slået ned eller bankede-out specifikt i mærket celler5,6 (f.eks, en serie af vektorer for Supernova system er tilgængelige fra RIKEN BioResource Research Center og Addgene). - Udføre regelmæssig IUE7,8,9,10,11 for at mærke kortikale neuroner. Mærkning af lag 4 neuroner, bruge embryonale dag-14 embryoner.
- Vente på pup levering og vækst.
2. kirurgi
- Bedøver den postnatale dag-5 (P5) pup bruger isofluran gas (1,0%). Udføre en hale-knivspids test for at kontrollere niveauet af anæstesi. Hvis hvalpen reagerer på knibe, øge isofluran koncentration (op til 2,0%) eller vente, indtil svaret forsvinder. Opretholde den pup kropstemperatur under operation ved hjælp af en varmepude.
- Subkutant indsprøjtes et smertestillende (carprofen, 5 mg/kg).
- Sterilisere den pup hud der dækker kraniet ved at tørre den med 70% ethanol tre gange.
- Fjerne ca 20 mm2 af den hud, der dækker kraniet ved hjælp af saks steriliseret med 70% ethanol (figur 1A).
- Fjerne fascia af kraniet ved hjælp af steriliseret pincet og en ren og steril vatpind (figur 1A).
- Anvende væv selvklæbende bruger læsning tips til indridset hudens overflade for at stoppe blødningen. Væv klæbemiddel til det billeddiagnostiske område (figur 1B) finder ikke anvendelse, da dette gør åbningen af kraniet svært.
- Placer pup på en varmepude (37 ° C) og gør det muligt at tilbagesøge anæstesi. Vent indtil væv limen er tørret og størknede (ca. 30 min.).
- Hvis det er nødvendigt, gælde mere væv lim og vente på det tørre og størkne.
3. kranienerver vindue forberedelse
- Bedøver den pup bruger isofluran (1,0-2,0%) og kontrollere niveauet anæstesi ved en hale-knivspids test.
- Forsigtigt åbne kraniet med en steriliseret barberblad forlader dura intakt (1 mm i diameter) (figur 1 c). Bruge en gelatine svamp (skæres i små stykker, ca < 2 mm3, bruger steriliseret saks, og anvende dem ved hjælp af pincet) dyppet i cortex buffer12 (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 10 mmol/L glukose, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl2 , og 2 mmol/L MgSO4; pH 7,4; 300 mOsm/L; stuetemperatur) at stoppe blødningen. Når åbning i kraniet, anvende en cortex buffer for at holde hjernen overfladen fugtig.
- Fjern eventuelle buffer og blod fra dural overfladen ved hjælp af en gelatine svamp. Anvende et tyndt lag af 1,0% lav smeltepunkt Agarosen (opløst i cortex buffer) ved hjælp af gul tips. Ved hjælp af en varme block maskine, holde temperaturen af Agarosen løsningen på 42° C indtil ansøgningen.
Bemærk: Dræning af buffer og blod skal udføres fra siden af kraniotomi mens pasning, der tør gelatine svampen ikke kommer i kontakt med dura. Udeblivelse kan beskadige dura. - Dækglas runde glas (nr. 1, 3 mm i diameter) på Agarosen gel lag. Fjerne alle bobler mellem coverslip og Agarosen gel lag ved at hælde et overskud af agarosegel mellem dem. Fjern den overskydende gel fremspringende fra under coverslip ved hjælp af pincet (fig. 1 d og 1E).
- Sikker coverslip ved hjælp af dental cement (figur 1F).
- Bland pulveret cement og cement væske. Påfør blandingen ved hjælp af gul tips, før det bliver bragt i fast form. Dental cement på dura, finder ikke anvendelse, da dette kan skade hjernen.
- Fastgør et sterilt titanium bar (custom lavet, ca 30 mg, se figur 1 g) på kranie knoglerne ved hjælp af dental cement. Juster titanium bar og coverslip (på overfladen af dura) parallelt med nemt fange billeder.
- Dække udsatte kraniet med dental cement (figur 1 H).
- Genskab pup fra anæstesi. Holde det på et varmeapparat (37 ° C), indtil den dental cement er størknet (1 h).
4. to-foton Imaging
Bemærk: I vivo billeder i figur 2 er anskaffet ved hjælp af en to-foton mikroskop med en titanium-safir laser (stråle diameter [1/e2]2: 1,2 mm).
- Sæt to-foton laser bølgelængde. For RFP excitation, brug 1.000 nm (450 mW/mm2 på 400 µm af dybde).
Bemærk: Laser power bør reduceres, da z-stilling bevæger sig. - Aftør overfladen af coverslip med 70% ethanol.
- Bedøver den pup bruger isofluran (1,5-2,0%) og kontrollere niveauet anæstesi ved hjælp af en hale-knivspids test.
- Vedhæfte pup til titanium plade på imaging scenen ved hjælp af en titanium bar på den pup hoved (figur 2A og 2B). Justere hovedet, sådan at coverslip er parallel til den objektive linse ved hjælp af goniometer scenen (figur 2B). Vedligeholde kroppens temperatur af den pup, bruge en varmepude (37 ° C).
- Indstil isofluran koncentration til 0,7% - 1,0%.
Bemærk: En meget høj isofluran koncentration kan forårsage hændelig død af hvalpen under imaging. - Placer den billeddiagnostiske fase under mål linse (20 X, NA 1,0) af to-foton mikroskop (figur 2B og 2 C).
- Påfør en dråbe vand på coverslip. Brug epi-fluorescens til at lokalisere de fluorescerende proteiner-mærket neuroner i det område, hvor dura er blevet udsat.
- Erhverve z-stak billeder med 1,4-µm intervaller. Til lag angive 4 neuron imaging, z-bredden til 150-300 µm til billede hele dendritiske morfologi (figur 2D og 2E). Brug langsom scanning og gennemsnit for at få klare billeder viser neuronal morfologi (det tager normalt > 20 min til at erhverve hele dendritiske morfologi).
Bemærk: Følgende parametre anbefales til billedbehandling. Excitation bølgelængde: 1.000 nm, scanner: Drejespoleinstrument type, dichroic spejl: 690 nm, emission filter: 575-620 nm bandpass, detektor: GaAsP type, få indstilling > 100, billedet størrelse > 512 x 512 µm, synsfelt > 600 x 600 µm, pixel opløsning < 1.2 µm.
5. nyttiggørelses- og sygepleje
- Frigøre pup fra imaging scenen.
- Placer pup på et varmeapparat (37 ° C) og gør det muligt at inddrive (15 min).
- Fodre hvalpen varm mælk med en mikropipette 2-h mellemrum og blidt stimulere maven at tillade udskillelse. Bekræfte, at pup er drikker mælk ved at måle sin kropsvægt.
6. re-tænkelig
- Bedøver pup med isofluran (1,5-2,0%), og kontrollere niveauet anæstesi ved hjælp af en hale-knivspids test. Vedhæfte det til stadiet billeddannelse.
- Find de tidligere afbildede neuroner og erhverve en z-stakken billede. Identifikation af neuroner er let på grund af deres sparsomme mærkning med Supernova.
- Gentag trin 5.1-6.2 indtil imaging er afsluttet. Bemærk: Pup kan være afbildet op til 18 h uden at miste vægt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tal 2D - 2F Vis repræsentative resultater af to-foton time-lapse billeddannelse af lag 4 kortikale neuroner ved hjælp af denne protokol. Med henblik på analyse, skal du vælge neuroner med klare dendritiske morfologi i hele de billeddiagnostiske perioder. Vi analyserede afbildet neuroner ved hjælp af morfologisk analyse software dendritiske morfologi. Repræsentative dendritiske morfologi genopbygning er vist i figur 2F. Neuroner viser afbrudt dendritter (fig. 2 g) bør udelukkes fra analyser, fordi afbrudt dendritter angive celledød induceret af skader under kirurgi eller billeddannelse. Derudover skal neuroner med sløret dendritiske tips være udelukket (f.eks.neuron med pilespidsen i figur 2D).
Figur 1: kirurgi, kraniel vindue forberedelse og fastgørelse af titanium bar (A) dette panel viser fjernelse af huden, der dækker kraniet. (B) dette panel viser fiksering af kløften mellem huden og kraniet. Pas på ikke at anvende bond på det billeddiagnostiske område. (C) Dette er et billede af den udsatte dura. Et barberblad blev indsat mellem kraniet og dura, og kraniet var slog åben til venstre for det udsatte område (pilespids). Knoglen kan derefter nemt fjernes med pincet. (D) Dette er en skematisk design viser en lodret visning af vinduet kranie. Kløften mellem cover glas og dura er fyldt med et tyndt lag af agarosegel. Coverslip er fastgjort til kraniet ved hjælp af dental cement. (E) A runde-formet coverslip er placeret på Agarosen gel lag. (F) Dette er et billede af den sikrede coverslip. (G) dette panel viser designet af titanium bar. Titanium bar indeholder to skruehuller for udlæg til billedbehandling fase (Se figur 2) og et fladt rektangulært del, der er knyttet til den pup hoved. (H) den rektangulære del af titanium bar er knyttet til den pup kraniet ved hjælp af dental cement. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: In vivo to-foton billeddannelse af kortikale neuroner i neonatal mus. (A) dette panel viser designet af titanium plade. Titanium plade har to skruehuller til fastgørelse af titanium bar og fire skruehuller til fastgørelse af vinkelmåleren fase, som er placeret på den billeddiagnostiske scene. 2.5 mm (i diameter) x 2 mm (i længden) skruer anvendes til fiksering. (B) Dette er et repræsentativt billede af den pup knyttet til billedbehandling fase. Den pup kropstemperatur vedligeholdes ved hjælp af et varmeapparat. (C) pup er bedøvede ved hjælp af isofluran ved i vivo billeddannelse procedure. (D) dette panel viser et repræsentativt Z-stakken time-lapse billede af lag 4 kortikale neuroner på en P5 hvalp. Pilespidsen angiver neuron med sløret dendritter, der bør fjernes fra analysen. (E) dette panel viser højere forstørrelse time-lapse billeder af neuron med pile i panelet D. Blå pilespidser: dendritiske tips, der er trukket tilbage i 4,5 h, gul pilespidser: dendritiske tips, der er aflange i 4,5 h, små hvide pilespidser: axon i en tilstødende celle. (F) Dette er en 3D-model af den dendritiske spor af neuron i den venstre figur af panelet E. Blå cirkler viser placering af cellen kroppen. (G) dette panel viser repræsentative neuroner med afbrudt dendritter, som ikke er medtaget i analysen. Eksempeldata i paneler D - G indeholder NR1 (en afgørende underenhed af NMDA-type glutamat receptor) - slået - ud neuroner (på grund af begrænsede data tilgængelige fra forfatterne). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen og fejlfinding:
Den mest kritiske trin i protokollen er fjernelse af kraniet (protokol trin 3.2). Ved indsættelse klæber barberblad ofte til dura, forårsager dural blødninger og skader på hjernen. Dette kan undgås ved at tilføje en drop på cortex buffer på kraniet og fjerner kraniet i cortex buffer.
Blødning fra dura og huden efter kranie vindue forberedelse fører til okklusion af vinduet. At undgå dette, vævet klæbende og dental cement anvendes må helt tørt, før du fortsætter til næste trin. Flere unger med et kranie vindue bør forberedes, da det er vanskeligt at helt undgå blødning. Generelt, hvis vinduet kraniel forbliver klart og stabilt for 2-3 timer efter operationen, kan pup bruges for time-lapse billeddannelse.
Betydningen af metoden med hensyn til eksisterende/Alternative metoder:
Her har vi beskrevet en metode for i vivo to-foton imaging af neonatal cortex. Denne protokol har flere fordele sammenlignet med tidligere rapporteret metoder. Disse er opført som følger.
1) kortikale neuroner kan tyndt og smukt markeret af transfecting Supernova vektorer ved hjælp af IUE. IUE har været meget anvendt til mærkning af kortikale neuroner under udvikling stadier. Men en enkel IUE er uegnede til billeddannelse af enkelte neuroner da neuroner kan mærkes også tæt7,8,9,10. Desuden kan ved hjælp af Supernova system, forskellige typer af fluorescerende proteiner anvendes til mærkning sparsomme populationer af neuroner. For eksempel bruger Supernova-medieret sparsomme mærkning af en genetisk kodet calcium indikator GCaMP13,14, vi har for nylig udført en funktionel analyse af individuelle neuroner i det udviklende cortex lag 4 (P3 til P13) 15.
2) metoden beskrevet i denne undersøgelse er velegnet til at belyse de molekylære mekanismer bag udvikling af neuronal kredsløb. Supernova systemet tillader sparsomt mærket celle-specifikke knockout af nogen gene. Således er kan dynamikken i et neuron, der indeholder et specifikt gen forstyrrelser observeres. Til dette formål, er genetik-baseret systemer såsom MADM16 og BEHÆNDIG17 tidligere rapporteret. Men fordi opdræt af mus linjer er afgørende for disse systemer, de kræver meget tid og omkostninger end protokollen beskrevet her.
3) denne undersøgelse udnytter et barberblad til kraniet fjernelse. Dette minimerer blødning fra dura og giver mulighed for åbningen af et bredt område af kraniet (< 2 mm i diameter). Brug denne procedure, var det muligt at observere den spontane aktivitet af lag 4 neuroner i området hele store tønde somatosensoriske cortex15.
Begrænsninger af metoden:
En ulempe, i vivo billeddannelse af musen neonatal hjernen, sammenlignet med billeddannelse af gennemsigtige dyr som zebrafisk larver og Xenopus haletudser, er den lavere rumlige og tidsmæssige opløsning. Langsom scanning og gennemsnit bør udføres for giver tydelige billeder af neuronal morfologi, fordi mere lysspredning opstår i hjernen, mus. Lysspredning kan eventuelt reduceres ved hjælp af en længere bølgelængde laser for fluorescerende proteiner excitation og proteiner med længere fluorescens emission bølgelængder.
En anden begrænsning af denne protokol kunne være, at operation for kraniel vindue implantation kan påvirke dannelsen af en normal kortikale kredsløb som følge af hjerne betændelse12. Men der er en høj sandsynlighed, i vivo billeddannelse er mere fysiologisk sammenlignet med in vitro- imaging som time-lapse billeddannelse af hjernen skive forberedelse, som bør også give anledning til alvorlige betændelse af iskæmi og udskæring. Det er også blevet rapporteret, at gentagne eksponering for isofluran kan påvirke flere neuronal processer18. Kontrol forsøg skal udføres for at kontrollere relevansen af resultaterne af i vivo billeddannelse. I forbindelse med vores billeddannelse af lag 4 neuroner i den somatosensoriske cortex bekræftede vi en normal stigning i dendritiske totallængde og erhvervelse af orientering bias af dendritiske fremskrivninger af tornede Stjernehus neuroner5,20.
Nylige undersøgelser rapporterede > 1 - mm-dybde imaging i en voksen mus hjernen hvori dura blev fjernet under kirurgi19. På den anden side har vi været i stand til betænkning op til 400 µm dybdegående imaging i nyfødte5. Da dura kan ikke fjernes i nyfødte og dette, til gengæld fører til en høj lysspredning, mener vi, at dybe imaging i nyfødte er mere udfordrende end hos voksne. Fremtidige forbedringer i fluorescerende sonder, lasere og detektorer skal tillade dybe imaging i neonatal hjerner.
Hidtil har vi rapporteret 18 timers time-lapse imaging ved hjælp af den nuværende protokol5. For nylig, det lykkedes i 72-timers time-lapse billeddannelse ved at forbedre protokol20. Vi vil fortsætte med at forfine protokollen præsenteres her (f.eks., langsigtede, højere og/eller rumlige opløsning imaging) for afslørende dynamisk mekanismer af neuronal kredsløb udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker T. Sato, M. Kanbayashi og S. Kouyama for deres tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af JSP'ER KAKENHI Grant numre JP15K14322 og JP16H06143, Takeda Science Foundation, Uehara Memorial Foundation, og den kollaborative forskning projekt af Niigata Universitet Brain Research Institute 2017-2923 (H.M.) og KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, og JP15H04263 og Grant-i videnskabelig forskning på Innovation områder "Dynamisk regulering af hjernefunktion af skrot & Build System" (JP16H06459) fra MEXT (ti).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
