Summary
We presenteren een in vivo twee-foton imaging protocol voor beeldvorming van de hersenschors van neonatale muizen. Deze methode is geschikt voor het analyseren van de ontwikkelingstoxiciteit dynamiek van corticale neuronen, de moleculaire mechanismen waarmee de neuronale dynamiek, en de veranderingen in de dynamiek van de neuronale in ziekte modellen.
Abstract
Twee-foton imaging is een krachtig hulpmiddel voor de analyse in vivo voor neuronale circuits in de hersenen van zoogdieren. Er bestaan echter een beperkt aantal in vivo imaging methoden voor de behandeling van het hersenweefsel van levende pasgeboren zoogdieren. Hierin vatten we een protocol voor imaging-individuele corticale neuronen in levende neonatale muizen. Dit protocol omvat de volgende twee methoden: (1) de Supernova-systeem voor het schaars en heldere labelen van corticale neuronen in de ontwikkelende hersenen, en (2) een chirurgische ingreep voor de kwetsbare neonatale schedel. Dit protocol staat toe de waarneming van de temporele veranderingen van individuele corticale neurites in neonatale fase met een hoge signaal-/ ruisverhouding. Gelabelde cel-specifieke gen zwijgen en knock-out kunnen ook worden bereikt door een combinatie van de Supernova met de interferentie van RNA en CRISPR/Cas9 gene bewerken systemen. Dit protocol kan dus worden gebruikt voor het analyseren van de ontwikkelingstoxiciteit dynamiek van corticale neuronen, moleculaire mechanismen waarmee de neuronale dynamiek, en veranderingen in de dynamiek van de neuronale in ziekte modellen.
Introduction
De exacte bedrading van neuronale circuits in de hersenschors is essentieel voor hogere hersenfuncties, met inbegrip van waarneming, cognitie, en leren en geheugen. Corticale circuits zijn dynamisch verfijnde tijdens postnatale ontwikkeling. Studies hebben onderzocht het proces van het gebruik van de vorming van de corticale circuit histologische en in vitro cultuur analyses. De dynamiek van de vorming van het circuit in levende zoogdieren heeft bleef echter grotendeels onontgonnen.
Twee-foton microscopie is wijd verbeid gebruikt voor de analyses in vivo voor neuronale circuits in de volwassen muis hersenen1,2. Echter, als gevolg van technische uitdagingen, slechts een beperkt aantal studies hebben aangepakt neuronale circuit vorming in pasgeboren muizen. Bijvoorbeeld uitgevoerd Carrillo et al. de time-lapse beeldvorming van vezels in het cerebellum in de tweede postnatale week3klimmen. Deur-Cailliau et al. rapporteerde de beeldvorming van axonen in corticale laag 1 in de eerste postnatale week4. In de huidige studie vatten we een protocol voor het waarnemen van laag 4 corticale neuronen en hun dendrites in pasgeboren muizen. Verkregen door toepassing van dit protocol, waaronder twee methodieken, resultaten worden gemeld in onze recente publicatie5. Eerst, gebruiken we de Supernova vector systeem5,6 voor het labelen van individuele neuronen in de hersenen bij pasgeborenen. In de Supernova-systeem, de fluorescente proteïnen die gebruikt voor het labelen van de neuronale zijn omruilbare en gelabelde cel-specifieke gen knockdown en bewerken/knock-out analyses zijn ook mogelijk. Ten tweede, beschrijven we een chirurgische ingreep in kwetsbare neonatale muizen voorbereiding craniale venster. Samen kunnen deze methodologieën de in vivo waarneming van individuele neuronen in neonatale hersenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten moeten worden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van het welzijn van dieren van de experimentator instelling voorgeschreven.
1. bereiding van Pups Imaging
Opmerking: Pups met dun gelabelde corticale neuronen kunnen worden verkregen door in utero electroporation (ÇÉ) van5,6van de vectoren van de Supernova. Het Supernova-systeem bestaat uit de volgende twee vectoren: TRE-Cre en CAG-loxP-STOP-loxP-gen X-ires-tTA-WPRE. In dit systeem afhankelijk sparse labeling van TRE lekkage. In een bevolkingsdichtheid van transfected neuronen drijft TRE de zwakke uitdrukking van Cre en tTA. Vervolgens alleen in deze cellen, wordt de uitdrukking van het gen X vergemakkelijkt door een positieve feedback van de tTA-TRE cycli. De bereikt schaars en heldere labeling maakt de visualisatie van morfologische details voor individuele neuronen in vivo. Bijzonderheden omtrent de ÇÉ worden niet beschreven dit protocol sinds ze elders beschreven7,8,9,10,11.
- Getimede-zwangere muizen voorbereiden ÇÉ.
- Bereid een DNA-oplossing voor ÇÉ. Voor sparse labelen met RFP, gebruikt u een oplossing met pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) en pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) of een oplossing met pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) en pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL).
Opmerking: Verschillende eiwitten kunnen worden uitgedrukt in de gelabelde neuronen met behulp van verschillende combinaties van de vectoren. Ook verschillende genen kunnen worden geslagen-down of knock-out specifiek in gelabelde cellen5,6 (bijvoorbeeldeen reeks van vectoren voor het Supernova-systeem zijn beschikbaar van RIKEN BioResource Research Center en van Addgene). - Regelmatige ÇÉ7,8,9,10,11 om corticale neuronen van een label uitvoeren Gebruik voor de etikettering van laag 4 neuronen, embryonale dag-14 embryo's.
- Wachten op de levering van de pup en groei.
2. operatie
- Anesthetize de postnatale dag-5 (P5) pup met behulp van Isofluraan gas (1,0%). Het uitvoeren van een staart-snuifje test om te controleren van het niveau van de verdoving. Als de pup op de snuifje reageert, verhogen de concentratie Isofluraan (maximaal 2,0%) of wachten totdat de reactie verdwijnt. Het handhaven van de lichaamstemperatuur van de pup tijdens de operatie met behulp van een verwarming pad.
- Subcutaan injecteren pijnstiller (carprofen, 5 mg/kg).
- Steriliseren van de pup huid die betrekking hebben op de schedel door afvegend het met 70% ethanol driemaal.
- Verwijderen van ongeveer 20 mm2 voor de huid die betrekking hebben op de schedel met behulp van schaar gesteriliseerd met 70% ethanol (figuur 1A).
- Verwijder de fascia van de schedel met behulp van gesteriliseerde pincet en een schoon, steriel katoenen doekje (figuur 1A).
- Toepassing weefsel lijm met laden tips om de ingesneden huidoppervlak te stoppen met het bloeden. Niet van toepassing weefsel lijm op het imaginggebied (figuur 1B) omdat dit de opening van de schedel bemoeilijkt.
- Plaats de pup op een verwarming pad (37 ° C) en laat het herstellen van anesthesie. Wacht totdat de weefsel lijm is gedroogd en gestold (ongeveer 30 min).
- Indien nodig, meer weefsel lijm en wachten tot het droog en stollen.
3. cranial venster voorbereiding
- Anesthetize van de pup met behulp van Isofluraan (1,0% - 2,0%) en controleer het anesthesie-niveau met een staart-snuifje-test.
- Zorgvuldig de schedel te openen met een gesteriliseerde scheermesje verlaten de dura intact (1 mm diameter) (Figuur 1 c). Gebruik een spons gelatine (snijd in kleine stukjes, ongeveer 2 mm <3, gebruik van gesteriliseerde schaar, en toe te passen met behulp van pincet) gedrenkt in cortex buffer12 (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, glucose 10 mmol/L, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl2 , en 2 mmol/L MgSO4; pH 7.4; 300 mOsm/L; kamertemperatuur) om te stoppen met het bloeden. Bij het openen van de schedel, toepassing een buffer van de cortex te houden van de hersenen oppervlak vochtig.
- Verwijder elke buffer en bloed uit het dural oppervlak met een spons gelatine. Passen een dun laagje van het gebruik van 1,0% laag-smeltpunt agarose (ontbonden in cortex buffer) gele tips. Het gebruik van een warmte blok machine, handhaving van de temperaturen van de agarose oplossing bij 42° C tot toepassing.
Opmerking: Het aftappen van buffer en bloed moet worden uitgevoerd vanaf de kant van de craniotomy terwijl het verzorgen, die de droge gelatine spons niet in contact met de dura komt. Niet te doen kan de dura beschadigen. - Breng een dekglaasje van ronde glazen aan (nr. 1, 3 mm diameter) op de agarose gel laag. Verwijder alle bubbels tussen het dekglaasje aan en de agarose gel laag door het gieten van een overmaat van agarose gel ertussen. Verwijder de overtollige gel uitsteekt onder het dekglaasje aan met pincet (Figuur 1 d en 1E).
- Beveilig het dekglaasje aan met behulp van tandheelkundige cement (figuur 1F).
- Meng de poeder van het cement en de vloeistof voor botcement. Breng het mengsel met behulp van gele tips voordat het wordt verhard. Niet van toepassing tandheelkundige cement op de dura, omdat dit aan de hersenen schade kan.
- Hechten van een steriele titanium bar (maat, ongeveer 30 mg, Zie figuur 1G) op de craniale bot met behulp van tandheelkundige cement. Uitlijnen de titanium bar en het dekglaasje aan (op het oppervlak van de dura) parallel aan de beelden gemakkelijk te vangen.
- Betrekking hebben op de blootgestelde schedel met tandheelkundige cement (Figuur 1 H).
- Herstelt de pup van anesthesie. Houd het op een verwarmingssysteem (37 ° C) totdat de tandheelkundige cement heeft verhard (1 h).
4. twee-foton Imaging
Opmerking: De in vivo afbeeldingen in Figuur 2 werden verkregen met behulp van een twee-foton microscoop met een titanium-saffier-laser (beam diameter [1/e2]2: 1.2 mm).
- De golflengte van de laser van de twee-foton instellen Voor RFP excitatie, gebruik 1.000 nm (450 mW/mm2 op 400 µm van diepte).
Opmerking: De kracht van de laser moet worden verminderd als de z-positie omhoog. - Veeg het oppervlak van het dekglaasje aan met 70% ethanol.
- Anesthetize van de pup met behulp van Isofluraan (1,5% - 2,0%) en controleer het niveau van de anesthesie met behulp van een staart-snuifje-test.
- Bevestig de pup aan de titanium plaat op de imaging podium met een titanium bar op de pup van hoofd (figuur 2A en 2B). Pas het hoofd zodanig dat het dekglaasje aan parallel aan het objectief met behulp van de goniometer fase (figuur 2B). Het handhaven van de lichaamstemperatuur van de pup met behulp van een verwarming pad (37 ° C).
- Stel de Isofluraan concentratie op 0,7% - 1,0%.
Opmerking: Een zeer hoge Isofluraan concentratie kan veroorzaken accidentele dood van de pup tijdens imaging. - Plaats de imaging fase onder het objectief (20 X, NB 1.0) van de twee-foton microscoop (figuur 2B en 2 C).
- Toepassing van een druppel water op het dekglaasje aan. Epi-fluorescentie zoekt u de fluorescente proteïne-geëtiketteerden neuronen in het gebied waar de dura is blootgesteld.
- Z-stapel afbeeldingen 1.4-µm tussenpozen te verwerven. Voor laag wordt in 4 neuron imaging, de z-breedte instellen op 150-300 µm om het imago van de gehele dendritische morfologie (figuur 2D en 2E). Gebruik traag scannen en gemiddeld om duidelijke afbeeldingen tonen de neuronale morfologie (het duurt meestal > 20 min te verwerven van de hele dendritische morfologie).
Opmerking: De volgende parameters worden aanbevolen voor imaging. Excitatie golflengte: 1.000 nm, scanner: galvanometer type, dichroïde spiegel: 690 nm, emissie filter: 575-620 nm bandpass, detector: GaAsP type, krijgen van instelling > 100, afbeelding grootte > 512 x 512 µm, gezichtsveld > 600 x 600 µm, pixel resolutie < 1,2 µm.
5. herstel en verpleging
- Loskoppelen van de pup van het imaging podium.
- Plaats de pup op een kachel (37 ° C) en laat ze herstellen (15 min).
- Feed de pup warme melk met behulp van een micropipet 2-h tussenpozen en voorzichtig stimuleren de maag zodat de uitscheiding. Bevestigen dat de pup is het drinken van melk door het meten van zijn lichaamsgewicht.
6. imaging opnieuw
- Anesthetize van de pup met Isofluraan (1,5% - 2,0%), en controleer het niveau van de anesthesie met behulp van een staart-snuifje-test. Koppelen aan de beeldvorming fase.
- Zoek de eerder verbeelde neuronen en verwerven van de afbeelding van een z-stack. De identificatie van neuronen is eenvoudig vanwege hun sparse labelen met Supernova.
- Herhaal stap 5.1-6.2 totdat imaging is voltooid. Opmerking: De pup kan worden beeld tot 18 h zonder het verliezen van gewicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2D figuren - 2F Toon representatieve resultaten voor twee-foton time-lapse imaging van corticale neuronen laag 4 met behulp van dit protocol. Selecteer voor analysedoeleinden, neuronen met duidelijke dendritische morfologie in de beeldvorming periodes. We analyseren de dendritische morfologie van verbeelde neuronen met behulp van morfologische analysesoftware. Representatieve dendritische morfologie wederopbouw wordt weergegeven in figuur 2F. Neuronen tonen verbroken dendrites (Figuur 2 g) moeten worden uitgesloten van de analyses, omdat verbroken dendrites celdood geven, veroorzaakt door schade tijdens chirurgie of imaging. Bovendien, moeten neuronen met wazig dendritische tips worden uitgesloten (bijvoorbeeld, het neuron met de pijlpunt in figuur 2D).
Figuur 1: chirurgie, Cranio venster voorbereiding en bevestiging van de bar. titanium (A) dit paneel toont de verwijdering van de huid die betrekking hebben op de schedel. (B) dit paneel toont de vastlegging van de kloof tussen de huid en de schedel. Wees voorzichtig niet toe te passen de band het imaginggebied. (C) Dit is een afbeelding van de blootgestelde dura. Een scheermesje is ingevoegd tussen de schedel en de dura en de schedel was open aan de linkerkant van de blootgestelde gebied (pijlpunt) klapte. Het bot kan dan gemakkelijk worden verwijderd met behulp van de verlostang. (D) Dit is een schematische ontwerp toont een verticale weergave van het Cranio-venster. De kloof tussen het glas van de cover en de dura is gevuld met een dun laagje agarose gel. Het dekglaasje aan is bevestigd aan de schedel met tandheelkundige cement. (E) A rond-gevormde dekglaasje aan wordt geplaatst op de agarose gel laag. (F) Dit is een afbeelding van de beveiligde dekglaasje aan. (G) dit paneel het ontwerp van de titanium-balk wordt weergegeven. De titanium bar bevat twee schroefgaten voor bevestiging aan de beeldvorming fase (Zie Figuur 2) en een platte rechthoekige deel dat is gekoppeld aan het hoofd van de pup. (H) het rechthoekje onderaan de titanium bar is gekoppeld aan de pup de schedel met tandheelkundige cement. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: In vivo twee-foton beeldvorming van corticale neuronen in neonatale muizen. (A) dit paneel toont het ontwerp van de titanium plaat. De titanium plaat heeft twee schroefgaten voor de bevestiging van de titanium bar en vier schroefgaten voor de bevestiging van de goniometer fase, die in het imaging werkgebied is geplaatst. 2.5 mm (in diameter) x 2 mm (lengte) schroeven worden gebruikt voor fixatie. (B) Dit is een representatief beeld van de pup op de imaging fase aangesloten. De pup de lichaamstemperatuur is onderhouden met behulp van een kachel. (C) de pup is verdoofd met behulp van Isofluraan tijdens de in vivo imaging procedure. (D) dit paneel toont een representatieve Z-stack time-lapse beeld van laag 4 corticale neuronen van een pup P5. De pijlpunt geeft aan het neuron met wazig dendrites, die uit de analyse moet worden verwijderd. (E) dit paneel toont de hogere vergroting time-lapse beelden van het neuron met pijlen in deelvenster D. Blauwe pijlpunten: dendritische tips die zijn ingetrokken in 4.5 h, gele pijlpunten: dendritische tips die zijn langgerekte in 4.5 h, kleine witte pijlpunten: axon van een naburige cel. (F) Dit is een 3D-model van de dendritische trace van neuron in de linker figuur van deelvenster E. De positie van de cel lichaam wordt aangegeven door blauwe cirkels. (G) dit paneel toont representatieve neuronen met verbroken dendrites, die niet zijn opgenomen in de analyse. De voorbeeldgegevens in panelen D - G bevatten NR1 (een essentieel subeenheid van NMDA-type glutamaat-receptor) - gevloerd - neuronen (vanwege de beperkte gegevens beschikbaar van de auteurs). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in het Protocol en probleemoplossing:
De meest kritische stap van het protocol is het verwijderen van de schedel (Protocol stap 3.2). Op de invoegpositie, het scheermesje vaak houdt zich aan de dura, dural bloeden en schade aan de hersenen veroorzaken. Dit kan vermeden worden door een daling van de cortex buffer op de schedel in toevoegen en verwijderen de schedel cortex buffer.
Bloeden uit de dura en de huid nadat craniale venster voorbereiding tot occlusie van het venster leidt. Om te voorkomen dat dit, het weefsel zelfklevende en tandheelkundige cement gebruikt mag worden volledig droog is voordat u verdergaat met de volgende stap. Meerdere pups met een cranial venster moeten worden opgesteld omdat het moeilijk is om volledig te voorkomen dat bloeden. In het algemeen, als het Cranio-venster duidelijk en stabiel voor 2-3 h na chirurgie blijft, kan de pup worden gebruikt voor time-lapse imaging.
Betekenis van de methode met betrekking tot bestaande/alternatieve methoden:
Wij hebben hier een methode voor in vivo imaging van de neonatale cortex van twee-foton beschreven. Dit protocol heeft verschillende voordelen in vergelijking met de eerder gemelde methoden. Deze zijn als volgt opgesomd.
1) corticale neuronen kunnen dun en helder door Supernova vectoren met behulp van ÇÉ transfecting worden aangeduid. ÇÉ is wijd verbeid gebruikt voor de etikettering van corticale neuronen tijdens het ontwikkelen van stadia. Een eenvoudige ÇÉ is echter ongeschikt voor de beeldvorming van individuele neuronen omdat neuronen kunnen worden gelabeld ook dichtbevolkte7,8,9,10. Bovendien, met behulp van de Supernova-systeem, diverse soorten fluorescente proteïnen kunnen worden gebruikt voor het labelen van dunbevolkte van neuronen. Bijvoorbeeld met behulp van Supernova-gemedieerde sparse labeling van een genetisch gecodeerde calcium indicator GCaMP13,14, we hebben onlangs uitgevoerd een functionele analyse van individuele neuronen in de ontwikkelingslanden cortex laag 4 (P3 aan P13) 15.
2) de in deze studie beschreven methode is geschikt voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van de neuronale circuit. Het Supernova systeem maakt dunbevolkte gelabelde cel-specifieke knock-out van een gen. Dus, de dynamiek van een neuron met een verstoring van de specifiek gen kan worden waargenomen. Voor dit doel, zijn genetica gebaseerde systemen zoals MADM16 en gladde17 eerder gemeld. Echter, omdat het fokken van muis lijnen essentieel voor deze systemen is, ze vereisen veel tijd en kosten dan het protocol beschreven hier.
3) deze studie maakt gebruik van een scheermesje voor het verwijderen van de schedel. Dit minimaliseert bloeden uit de dura en laat de opening van een groot gebied van de schedel (< 2 mm diameter). Met deze procedure, bleek het mogelijk om te observeren van de spontane activiteit van laag 4 neuronen in het hele grote vat gebied binnen de Somatosensorische cortex15.
Beperkingen van de methode:
Een nadeel van in vivo imaging van de muis neonatale hersenen, vergeleken met de beeldvorming van transparante dieren zoals zebrafish larven en Xenopus kikkervisjes, is de lagere ruimtelijke en temporele resolutie. Traag scannen en gemiddeld moeten worden uitgevoerd voor heldere beelden van de neuronale morfologie oplevert omdat meer lichtverstrooiing in de hersenen van de muis voorkomt. Verstrooiing van licht kan eventueel worden verminderd met behulp van een langere golflengte laser voor TL proteïne excitatie en eiwitten met langere fluorescentie emissie golflengten.
Een andere beperking van het huidige protocol zou kunnen zijn dat de operatie voor Cranio venster implantatie van invloed kan zijn op de vorming van een normale corticale circuit als gevolg van hersenen ontsteking12. Echter, er is een hoge waarschijnlijkheid dat in vivo imaging is meer fysiologische in vergelijking met in vitro beeldvorming zoals time-lapse beeldvorming van de hersenen segment voorbereiding, die ook aanleiding tot ernstige ontsteking door ischemie en snijden geven moet. Men heeft ook gerapporteerd dat herhaalde blootstelling aan Isofluraan verschillende neuronale processen18kan beïnvloeden. Controle experimenten moeten worden uitgevoerd voor het controleren van de juistheid van de resultaten van in vivo imaging. In het geval van onze beeldvorming van laag 4 neuronen in de Somatosensorische cortex bevestigd wij een normale toename dendritische totaallengte en verwerving van oriëntatie bias van dendritische projecties van stekelige Notti neuronen5,20.
Recente studies gerapporteerd > 1 mm-diepte beeldvorming in de hersenen van een volwassen muis waarin de dura werd verwijderd tijdens chirurgie19. Aan de andere kant, heeft men kunnen rapporteren tot 400-µm-diepte imaging in pasgeborenen5. Aangezien de dura kan niet worden verwijderd bij pasgeborenen en dit op zijn beurt tot een hoge verstrooiing van licht leidt, vinden wij dat diepe beeldvorming bij pasgeborenen moeilijker is dan bij volwassenen. Toekomstige verbetering in fluorescerende sondes, lasers en detectoren mag diep beeldvorming in neonatale hersenen.
Tot nu toe hebben we 18 uur time-lapse imaging met behulp van het huidige protocol5gemeld. Onlangs, gelukt in 72-uur time-lapse beeldvorming door een verbetering van het protocol van20. Wij zullen blijven verfijnen het protocol hier gepresenteerd (bijvoorbeeld, op langere termijn, hoger, en/of ruimtelijke resolutie beeldvorming) voor het openbaren van dynamische mechanismen van de neuronale circuit ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken T. Sato, M. Kanbayashi en S. Kouyama voor hun technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant nummers JP15K14322 en JP16H06143, de Takeda Science Foundation, de Uehara Memorial Foundation en de Collaborative Research Project van Niigata Universiteit hersenen onderzoek instituut 2017-2923 (H.M.) en KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, en JP15H04263 en Grant-in wetenschappelijk onderzoek naar innovatie gebieden "Dynamische regulering van hersenfunctie door afvallen & Build System" (JP16H06459) van MEXT (TI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
