Summary
Nous présentons une en vivo biphotonique imagerie protocole d’imagerie du cortex cérébral de souris néonatales. Cette méthode convient pour analyser la dynamique du développement des neurones corticaux, les mécanismes moléculaires qui contrôlent la dynamique neuronale et les changements dans la dynamique neuronale dans les modèles de maladies.
Abstract
L’imagerie biphotonique est un outil puissant pour l’analyse in vivo des circuits neuronaux dans le cerveau des mammifères. Cependant, un nombre limité de méthodes d’imagerie in vivo existe pour examiner le tissu cérébral des mammifères nouveau-nés vivants. Dans les présentes, nous résumons un protocole pour l’imagerie des neurones corticaux individuels dans la vie de souris néonatales. Ce protocole comprend les deux méthodes suivantes : (1) le système de Supernova pour l’étiquetage des rares et lumineux des neurones corticaux dans le développement du cerveau et (2) une intervention chirurgicale pour le crâne fragile néonatale. Ce protocole permet l’observation des changements temporels des neurites corticaux différents stades néonatale avec un rapport signal sur bruit élevé. Silençage génique de cellules spécifiques marqué et élimination directe est possible aussi en combinant la Supernova à l’interférence d’ARN et gène CRISPR/Cas9, systèmes de montage. Ce protocole peut, ainsi, être utilisé pour analyser la dynamique du développement des neurones corticaux, mécanismes moléculaires qui régissent la dynamique neuronale et des changements dans la dynamique neuronale dans les modèles de maladies.
Introduction
Le câblage précis des circuits de neurones dans le cortex cérébral est essentiel pour les fonctions cérébrales supérieures y compris la perception, cognition et apprentissage et la mémoire. Des circuits corticaux sont dynamiquement raffinés au développement postnatal. Des études ont étudié le processus d’utilisation de la formation des circuits corticaux histologique et analyses de la culture in vitro . Toutefois, la dynamique de la formation des circuits chez les mammifères vivants est restée pratiquement inexplorée.
Microscopie biphotonique a été largement utilisée pour l’analyse in vivo des circuits neuronaux dans le cerveau de souris adulte1,2. Toutefois, en raison de difficultés techniques, seulement un nombre limité d’études ont abordé la formation des circuits neuronaux chez des souris nouveau-nées. Par exemple, Carrillo et coll. effectuée l’imagerie Time-lapse de l’escalade des fibres du cervelet dans la deuxième semaine après la naissance3. Portera-Cailliau et coll. ont signalé l’imagerie des axones dans la couche corticale 1 dans la première semaine après la naissance4. Dans la présente étude, nous résumons un protocole pour l’observation des neurones corticaux de couche 4 et leurs dendrites chez des souris nouveau-nées. Obtenu par l’application de ce protocole, qui comprend deux méthodes, les résultats sont présentés dans notre récente publication5. Tout d’abord, nous utilisons la Supernova vector système5,6 pour l’étiquetage différents neurones dans le cerveau néonatal. Dans le système de la Supernova, les protéines fluorescentes utilisées pour l’étiquetage neuronale sont échangeables et étiquetées de gène spécifique des cellules et édition/knockout analyses sont également possibles. En second lieu, nous décrivons une procédure chirurgicale pour la préparation de la fenêtre crânienne en souris néonatales fragiles. Ensemble, ces méthodologies permettent l’observation in vivo des différents neurones dans le cerveau néonatal.
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Protocol
Des expériences doivent être effectués conformément aux directives prescrites par l’institution de l’expérimentateur bien-être des animaux.
1. préparation des chiots pour l’imagerie
NOTE : Chiots avec des neurones corticaux faiblement marquées peuvent être obtenues par in utero électroporation (IUE) de vecteurs de Supernova5,6. Le système de la Supernova est constitué des deux vecteurs suivants : TRE-Cre et CAG-loxP-STOP-loxP-Gene X-ires-tTA-WPRE. Dans ce système, clairsemée d’étiquetage s’appuie sur les fuites de TRE. Dans une faible densité de population de neurones transfectées, TRE amène l’expression faible de Cre et tTA. Par la suite, que dans ces cellules, l’expression du gène X est facilitée par une rétroaction positive des cycles tTA-TRE. L’atteint étiquetage clairsemée et lumineux permet la visualisation des détails morphologiques de neurones individuels in vivo. Détails de la procédure de l’IUE ne sont pas décrits dans le présent protocole puisqu’ils ont été décrits ailleurs7,8,9,10,11.
- Préparer des souris enceintes chronométré pour IUE.
- Préparer une solution d’ADN pour IUE. Pour l’étiquetage clairsemée avec DP, utiliser une solution contenant pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) et pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL), ou une solution contenant pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) et pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL).
NOTE : Différentes protéines peuvent être exprimées dans les neurones marqués à l’aide de différentes combinaisons de vecteurs. En outre, différents gènes peuvent être démontés ou frappé-out plus précisément dans les cellules marquées5,6 (par exemple, une série de vecteurs pour le système de Supernova sont disponibles du RIKEN BioResource Research Center et du Addgene). - Effectuer régulièrement IUE7,8,9,10,11 pour étiqueter des neurones corticaux. Pour le marquage des neurones de la couche 4, utilisez embryonnaires J14 embryons.
- Attendre pour la croissance et de la livraison du chiot.
2. chirurgie
- Anesthésier postnatal jour 5 (P5) chiot à l’aide de gaz isoflurane (1,0 %). Effectuer un test de queue-pincée pour contrôler le niveau de l’anesthésie. Si le chiot réagit à la pincée, augmenter la concentration de l’isoflurane (jusqu'à 2,0 %) ou attendre jusqu'à ce que disparaisse la réponse. Maintenir la température de corps du chiot pendant une intervention chirurgicale à l’aide d’un coussin chauffant.
- Injecter par voie sous-cutanée d’analgésique (carprofène, 5 mg/kg).
- Stériliser la peau du pup couvrant le crâne en l’essuyant avec de l’éthanol 70 % trois fois.
- Enlever environ 20 mm2 de la peau recouvrant le crâne à l’aide de ciseaux stérilisés à l’éthanol à 70 % (Figure 1 a).
- Enlever le carénage du crâne à l’aide de forceps stérilisé et un coton-tige propre et stérile (Figure 1 a).
- Appliquez la colle tissu à l’aide de conseils de chargement à la surface de la peau incisée pour arrêter le saignement. Ne pas appliquer de colle tissu vers la zone d’imagerie (Figure 1 b) parce que cela complique l’ouverture du crâne.
- Placez le chiot sur un coussin chauffant (37 ° C) et lui permettre de récupérer de l’anesthésie. Attendez que la colle tissu a séché et solidifié (environ 30 min).
- Si nécessaire, appliquez de l’adhésif de tissus plus et attendre qu’il sèche et se solidifier.
3. préparation de fenêtre crânienne
- Anesthésier le chiot l’isoflurane (de 1,0 à 2,0 %) et vérifier le niveau d’anesthésie par un test de queue-pincement.
- Ouvrir délicatement le crâne avec une lame de rasoir stérilisée, laissant la dure-mère intacte (1 mm de diamètre) (Figure 1). Utiliser une éponge de gélatine (coupés en petits morceaux, environ 2 mm <3, à l’aide de ciseaux stérilisés et de les appliquer à l’aide de la pince à épiler) trempé dans cortex tampon12 (125 mmol/L de NaCl, 5 mmol/L de KCl, 10 mmol/L de glucose, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L ACIC2 et 2 mmol/L MgSO4; pH 7,4 ; 300 mOsm/L ; température de la pièce) pour arrêter le saignement. Lors de l’ouverture du crâne, appliquer un tampon de cortex pour garder la surface de cerveau humide.
- Supprimer n’importe quel tampon et le sang de la surface durale à l’aide d’une éponge de gélatine. Appliquer un conseils de couche mince de 1,0 % faible point de fusion d’agarose (dissoute dans un tampon cortex) à l’aide du jaune. À l’aide d’une machine de bloc de chaleur, maintenir la température de la solution de gel d’agarose à 42° C jusqu'à l’application.
Remarque : La vidange du tampon et le sang doit être exécutée du côté de la craniotomie tout en prenant soin que l’éponge de gélatine sèche ne vient pas en contact avec la dure-mère. Faute de quoi pourrait endommager la dure-mère. - Appliquez une lamelle de verre (n ° 1, 3 mm de diamètre) sur la couche de gel d’agarose. Enlever toutes les bulles entre la lamelle et la couche de gel d’agarose en versant un excès de gel d’agarose entre eux. Retirer le gel excès qui dépassent sous la lamelle à l’aide de la pince à épiler (Figure 1 et 1E).
- Fixer la lamelle à l’aide de ciment dentaire (Figure 1F).
- Mélanger la poudre de ciment et le liquide de ciment. Appliquer le mélange à l’aide de pointes jaunes avant il devient solidifié. Ne pas appliquer le ciment dentaire sur la dure-mère, car cela pourrait endommager le cerveau.
- Attacher un titane stérile bar (faits, environ 30 mg, voir Figure 1) sur l’OS crânien à l’aide de ciment dentaire. Aligner la barre de titane et le couvre-objet (sur la surface de la dure-mère) en parallèle de capturer facilement des images.
- Couvrir le crâne exposé avec ciment dentaire (Figure 1 H).
- Récupérer le chiot d’anesthésie. Gardez-le sur un appareil de chauffage (37 ° C) jusqu'à ce que le ciment dentaire se solidifie (1 h).
4. two-photon Imaging
Remarque : Les images in vivo à la Figure 2 ont été acquis à l’aide d’un microscope biphotonique avec un laser titane-saphir (faisceau de diamètre [1/e2]2: 1,2 mm).
- Définissez la longueur d’onde laser de deux photons. Pour l’excitation de la DP, utilisation de 1 000 nm (450 mW/mm2 à 400 µm de profondeur).
Remarque : La puissance du laser doit être réduite lorsque la position z se déplace vers le haut. - Essuyez la surface de la lamelle avec l’éthanol à 70 %.
- Anesthésier le chiot l’isoflurane (de 1,5 à 2,0 %) et vérifiez le niveau d’anesthésie à l’aide d’un test de queue-pincée.
- Fixez le chiot à la plaque de titane sur la scène d’imagerie utilisant une barre de titane sur la tête du chiot (Figure 2 a et 2 b). Régler la tête de sorte que la lamelle est parallèle à la lentille de l’objectif à l’aide de l’étape du goniomètre (Figure 2 b). Maintenir la température du corps du chiot à l’aide d’un coussin chauffant (37 ° C).
- La valeur de la concentration d’isoflurane 0,7 % - 1,0 %.
Remarque : Une concentration très haute isoflurane peut causer la mort accidentelle du chiot en imagerie. - Placer la scène d’imagerie sous la lentille de l’objectif (20 X, NA 1.0) du microscope biphotonique (Figure 2 b et 2C).
- Appliquer une goutte d’eau sur la lamelle couvre-objet. Épi-fluorescence permet de localiser les neurones marqués au protéine fluorescentes dans la région où la dure-mère a été exposée.
- Acquisition d’images de z-pile à des intervalles de 1,4 µm. Pour couche 4 neurone d’imagerie, la valeur du z-largeur 150-300 µm d’imager la morphologie dendritique entière (Figure 2D et 2E). Utilisation lente numérisation et une moyenne pour obtenir des images claires montrant la morphologie neuronale (il faut généralement > 20 min d’acquérir l’ensemble morphologie dendritique).
Remarque : Les paramètres suivants sont recommandés pour l’imagerie. Longueur d’onde excitation : 1 000 nm, scanner : type de galvanomètre, miroir dichroïque : 690 nm, filtre d’émission : 575-620 nm passe-bande, détecteur : GaAsP type, gain réglage > 100, image taille > 512 x 512 µm, champ de vision > 600 x 600 µm, pixel résolution < 1,2 µm.
5. rétablissement et soins infirmiers
- Détacher le chiot dès le stade d’imagerie.
- Placez le chiot sur un appareil de chauffage (37 ° C) et laissez-le à récupérer (15 min).
- Nourrir le chiot lait tiède à l’aide d’une micropipette à intervalles de 2 h et stimuler doucement l’estomac pour permettre l’excrétion. Confirmer que le chiot boit du lait en mesurant sa masse corporelle.
6. Re-imaging
- Anesthésier le chiot à l’isoflurane (2,0 % - 1,5 %) et vérifiez le niveau d’anesthésie à l’aide d’un test de queue-pincée. Attachez-le à l’étape d’imagerie.
- Recherchez les neurones déjà imagés et acquérir une image de z-pile. L’identification des neurones est facile en raison de leur étiquetage clairsemée avec Supernova.
- Répétez les étapes 5.1-6.2 jusqu'à ce que l’imagerie est terminée. Remarque : Le chiot peut être photographié jusqu'à 18 h, sans perdre du poids.
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Representative Results
Personnages 2D - 2F afficher les résultats représentatifs de l’imagerie Time-lapse deux photons de neurones corticaux de couche 4 à l’aide du présent protocole. Aux fins d’analyse, sélectionnez les neurones avec une morphologie dendritique clair pendant les périodes d’imagerie. Nous avons analysé la morphologie dendritique des neurones imagés à l’aide de logiciels d’analyse morphologique. Reconstruction de morphologie dendritique représentatif est illustrée à la Figure 2F. Neurones montrant déconnecté dendrites (Figure 2) devraient être exclus des analyses, car déconnectés dendrites indiquent la mort cellulaire induite par des dommages au cours de la chirurgie ou l’imagerie. En outre, les neurones avec embouts dendritiques floues devraient être exclus (par exemple, le neurone avec la pointe de flèche en Figure 2D).
Figure 1 : chirurgie, préparation de fenêtre crânienne et fixation de la barre de titane (A), ce panneau indique la suppression de la peau recouvrant le crâne. (B), ce panneau montre la fixation de l’écart entre la peau et le crâne. Veillez à ne pas appliquer le lien sur la zone d’imagerie. (C) il s’agit d’une image de la dure-mère exposée. Une lame de rasoir a été insérée entre le crâne et la dure-mère, et le crâne était flapped ouvert à gauche de la zone exposée (pointe de flèche). L’OS peuvent alors être facilement enlevé avec une pincette. (D) il s’agit d’une conception schématique montrant une vue verticale de la fenêtre crânienne. L’écart entre le couvercle en verre et la dure-mère est rempli d’une mince couche de gel d’agarose. La lamelle est fixée sur le crâne à l’aide de ciment dentaire. (E), à la forme ronde de la lamelle couvre-objet est placé sur la couche de gel d’agarose. (F) il s’agit d’une image de la lamelle couvre-objet sécurisé. (G), ce panneau affiche la conception de la barre de titane. La barre de titane contient deux trous de vis pour la fixation au stade d’imagerie (voir Figure 2) et une partie rectangulaire plat qui est attachée à la tête du chiot. (H) la partie rectangulaire du titane est fixé à crâne le chiot à l’aide de ciment dentaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : In vivo imagerie biphotonique des neurones corticaux en souris néonatales. (A), ce panneau affiche la conception de la plaque de titane. La plaque de titane possède deux trous de vis pour fixer la barre de titane et de quatre trous de vis pour fixer la scène goniomètre, qui est placée sur la scène d’imagerie. 2. 5 mm (de diamètre) x vis de 2 mm (longueur) sont utilisés pour la fixation. (B) il s’agit d’une image représentative du chiot attaché à l’étape d’imagerie. Température du corps du chiot est maintenue à l’aide d’un appareil de chauffage. (C), le chiot est anesthésié l’isoflurane pendant in vivo procédure d’imagerie. (D), ce panneau affiche une image représentative de Time-lapse Z-pile de couche 4 neurones corticaux du pup P5. La flèche indique le neurone avec dendrites floues, qui devraient être retirés de l’analyse. (E), ce panneau présente un grossissement supérieur Time-lapse images du neurone avec des flèches dans le panneau D. Bleu de pointes de flèches : conseils dendritiques qui sont rentrés en pointes de flèche de 4,5 h, jaune : conseils dendritiques qui sont allongées en 4,5 h, petites pointes de flèche blanches : axone d’une cellule voisine. (F) il s’agit d’un modèle 3D de la trace dendritique des neurones dans la figure de gauche du groupe E. Cercles bleus indiquent la position du corps cellulaire. (G) ce panneau montre les neurones représentant avec dendrites déconnectées, qui ne sont pas inclus dans l’analyse. Les exemples de données dans les panneaux D - G contiennent NR1 (une sous-unité essentielle de récepteur de glutamate de NMDA-type) - assommé - neurones (en raison des données limitées disponibles auprès des auteurs). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Des étapes cruciales dans le protocole et le dépannage :
L’étape la plus critique du protocole est l’ablation du crâne (étape 3.2 du protocole). Lors de l’insertion, la lame de rasoir adhère souvent à la dure-mère, provoquant des saignements dural et des dommages au cerveau. Cela peut être évité en ajoutant une goutte de tampon de cortex sur le crâne et en supprimant le crâne dans un tampon de cortex.
Hémorragie de la dure-mère et la peau après que préparation de fenêtre crânienne mène à l’occlusion de la fenêtre. Pour éviter cela, le tissu adhésif et dentaire du ciment utilisé devrait être autorisé à sécher complètement avant de passer à l’étape suivante. Plusieurs chiots avec une fenêtre crânienne doivent être préparés comme il est difficile d’éviter complètement les saignements. En général, si la fenêtre crânienne reste clair et stable pour la chirurgie après 2-3 h, le chiot peut être utilisé pour l’imagerie Time-lapse.
Importance de la méthode en ce qui concerne les méthodes existantes/Alternative :
Ici, nous avons décrit une méthode pour en vivo biphotonique d’imagerie du cortex néonatal. Ce protocole a plusieurs avantages comparés aux méthodes rapportées antérieurement. Ceux-ci sont répertoriés comme suit.
1) corticales neurones peuvent être faiblement et joliment étiquetés par transfectants vecteurs de Supernova en utilisant IUE. IUE a été largement utilisé pour le marquage des neurones corticaux durant les stades. Toutefois, un simple IUE est inapte pour l’imagerie des neurones individuels étant donné que les neurones peuvent être étiquetés trop densément7,8,9,10. En outre, grâce au système de Supernova, divers types de protéines fluorescentes peuvent servir pour l’étiquetage des populations clairsemées de neurones. Par exemple, à l’aide de Supernova-mediated clairsemée étiquetage d’un indicateur de calcium codé génétiquement GCaMP13,14, nous avons récemment effectué une analyse fonctionnelle des neurones individuels dans la couche de cortex en développement 4 (P3 à P13) 15.
2) la méthode décrite dans la présente étude est adaptée pour élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement des circuits neuronaux. Le système de Supernova permet faiblement marqué knockout spécifiques des cellules de n’importe quel gène. Ainsi, on peut observer la dynamique d’un neurone contenant une perturbation de gènes spécifiques. À cet effet, systèmes axés sur la génétique comme MADM16 et SLICK17 ont été rapportées. Cependant, parce que l’élevage de lignées de souris est essentielle pour ces systèmes, ils exigent beaucoup de temps et un coût que le protocole décrit ici.
3) cette étude utilise une lame de rasoir pour l’enlèvement du crâne. Cela minimise l’hémorragie de la dure-mère et permet l’ouverture d’une vaste zone du crâne (< 2 mm de diamètre). En utilisant cette procédure, il a été possible d’observer l’activité spontanée de couche 4 neurones de la région de tout grand tonneau dans le cortex somatosensoriel15.
Limitations de la méthode :
Un inconvénient de l’imagerie in vivo du cerveau de souris néonatale, par rapport à l’imagerie des animaux transparents comme des larves de poisson zèbre et des têtards de Xenopus , est la plus faible résolution spatiale et temporelle. Balayage lent, pour une moyenne doivent être exécutées pour ce qui donne des images claires de la morphologie neuronale parce que la diffusion de la lumière plus se produit dans le cerveau de souris. Diffusion de la lumière peut éventuellement être réduite en utilisant un laser de longueur d’onde plus longs pour l’excitation de la protéine fluorescente et de protéines avec des longueurs d’onde d’émission de fluorescence.
Une autre limitation du présent protocole pourrait être que la chirurgie pour l’implantation de la fenêtre crânienne peut-être affecter la formation d’un circuit cortical normal en raison de l’inflammation cérébrale12. Cependant, il y a une forte probabilité que l’imagerie in vivo est plus physiologique comparée à in vitro d’imagerie comme l’imagerie Time-lapse de la préparation de tranches de cerveau, qui devrait également donner lieu à une inflammation sévère par ischémie et tranchage. On a également signalé que l’exposition répétée à l’isoflurane peut-être affecter plusieurs processus neuronaux18. Expériences de contrôle doit être effectués pour vérifier la pertinence des résultats obtenus par l’imagerie in vivo . Dans le cas de notre imagerie des neurones de la couche 4 dans le cortex somatosensoriel, nous avons confirmé une augmentation normale longueur dendritique et acquisition de partialité de l’orientation des projections dendritiques des neurones étoilés épineux5,20.
Des études récentes signalées > 1 mm-imagerie de profondeur dans un cerveau de souris adultes où la dure-mère a été supprimée au cours de la chirurgie,19. En revanche, nous avons pu rapport jusqu'à 400 µm-profondeur imagerie nouveau-nés5. Puisque la dure-mère ne peut être retirée chez les nouveau-nés, et cela, à son tour, conduit à une forte diffusion de la lumière, nous estimons que l’imagerie profonde chez les nouveau-nés est plus difficile que chez les adultes. Amélioration future des sondes fluorescentes, des lasers et détecteurs devrait permettre profonde d’imagerie dans le cerveau néonatal.
Jusqu’ici, nous avons rapporté Time-lapse d’imagerie utilisant le présent protocole518 heures. Récemment, nous avons réussi en imagerie Time-lapse de 72 heures en améliorant le protocole20. Nous allons continuer à affiner le protocole présenté ici (par exemple, à plus long terme, plu le temps ou l’imagerie de résolution spatiale) pour révéler des mécanismes dynamiques de développement des circuits neuronaux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient T. Sato, M. Kanbayashi et S. Kouyama pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant numéros JP15K14322 et JP16H06143, le FNS de Takeda, le Uehara Memorial Foundation et le projet de recherche Collaborative de Niigata University Brain Research Institute 2017-2923 (H.M.) et par KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 et JP15H04263 et Grant-dans la recherche scientifique sur les domaines de l’Innovation « Règlement de dynamique de la fonction cérébrale de Scrap & système de génération » (JP16H06459) du MEXT (T.I.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
