Summary
נציג של ויוו שני הפוטונים הדמיה פרוטוקול הדמיה ההכרויות neonatal עכברים. שיטה זו מתאימה לניתוח הדינמיקות התפתחותית של נוירונים בקליפת המוח, המנגנונים המולקולריים הדינמיקות עצביים ועל שינויים עצביים dynamics במודלים של המחלה.
Abstract
שני הפוטונים הדמיה הוא כלי רב עוצמה לניתוח ויוו של מעגלים עצביים במוח של יונקים. עם זאת, מספר מוגבל של ויוו בשיטות הדמיה קיימים לבחינת על רקמת המוח של יונקים היילוד בשידור חי. בזאת אנו מסכמים את פרוטוקול הדמיה נוירונים בודדים בקליפת המוח בעכברים neonatal חי. פרוטוקול זה כולל את מתודולוגיות שני הבאים: (1) מערכת סופרנובה דלילים ובהירים תיוג של נוירונים בקליפת המוח המוח המתפתח, (2) הליך כירורגי על הגולגולת neonatal שביר. פרוטוקול זה מאפשר התבוננות שינויים הטמפורלי של הפרט neurites קורטיקלית בשלבים neonatal עם יחס אות לרעש גבוה. גם ניתן להשיג על ידי שילוב של הסופרנובה עם הפרעה RNA ו CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה מערכות שכותרתו תא ספציפי ג'ין להחרשת, נוק אאוט. פרוטוקול זה, לכן, ניתן להשתמש לניתוח הדינמיקות התפתחותית של נוירונים בקליפת המוח, המנגנונים המולקולריים השולטים על דינמיקה עצביים, וכן שינויים עצביים dynamics במודלים של המחלה.
Introduction
החיווט מדויק של מעגלים עצביים בקליפת חיוני עבור תפקודי המוח כולל תפיסה, קוגניציה, למידה וזיכרון. מעגלים בקליפת המוח הם מעודן באופן דינמי במהלך הפיתוח כמחנכת. מחקרים חקרו את תהליך השימוש היווצרות מעגל קורטיקלית היסטולוגית וניתוחים in vitro לקשרי תרבות. עם זאת, הדינמיקה של היווצרות מעגל ביונקים החיים נשאר בעיקר נחקרו.
מיקרוסקופ שני הפוטונים כבר בשימוש נרחב עבור הניתוחים ויוו של מעגלים עצביים העכבר למבוגרים המוח1,2. עם זאת, בשל האתגרים הטכניים, רק מספר מצומצם של מחקרים עסקו מעגלים עצביים היווצרות בעכברים היילוד. לדוגמה, קאריו. ואח לביצוע ההדמיה בצילום מואץ של טיפוס סיבי המוח הקטן של שבוע לאחר הלידה השניה3. . Portera-Cailliau et al. דיווח על ההדמיה של אקסונים בשכבת קורטיקלית 1 שבוע לאחר הלידה הראשונה4. במחקר הנוכחי, אנו מסכמים את פרוטוקול להשגחה של נוירונים בקליפת המוח של שכבה 4, שלהם דנדריטים בעכברים היילוד. התוצאות המתקבלות על-ידי החלת פרוטוקול זה, הכולל שתי מתודולוגיות, מדווחים הפרסום האחרונה שלנו5. ראשית, אנו משתמשים5,6 מערכת וקטור סופרנובה עבור תיוג נוירונים בודדים במוח neonatal. במערכת סופרנובה, החלבונים פלורסנט משמש תיוג עצביים גנים ספציפיים תא להחלפה ומתויגים הינם ניתוחים עריכה/נוק-אאוט הינם אפשריים. שנית, אנו מתארים הליך כירורגי להכנה חלון הגולגולת בעכברים neonatal שביר. יחד, מתודולוגיות אלה מאפשרים התצפית ויוו של נוירונים בודדים במוח neonatal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים צריכה להתבצע בהתאם להנחיות רווחת שקבע המוסד של הנסיין.
1. הכנת הגורים עבור הדמיה
הערה: הגורים עם נוירונים בקליפת המוח בדלילות שכותרתו ניתן להשיג על ידי אלקטרופורציה בתוך הרחם (הצמיגים) של סופרנובה-וקטורים-5,-6. מערכת סופרנובה מורכב שני וקטורים הבאים: טרה-Cre, חטיבתי-loxP-עצור-loxP-X ג'ין-ires-tTA-WPRE. במערכת זו, תיוג דליל מסתמך על זליגת TRE. אוכלוסיה דלילה של נוירונים transfected, טרה מניע את ביטוי חלש Cre tTA. לאחר מכן, רק בתאים אלה, הביטוי של גנים X בהנחייתם של משוב חיובי של מחזוריות tTA-טרה. מושגת דלילים ובהירים תיוג מאפשר את החזיית פרטי מורפולוגי נוירונים בודדים בתוך vivo. פרטים של ההליך הצמיגים לא המתוארות פרוטוקול זה, מאז הם תיארו במקום אחר7,8,9,10,11.
- היכונו עכברים מתוזמן-בהריון. הצמיגים.
- להכין פתרון ה-DNA הצמיגים. עבור תיוג דליל עם RFP, להשתמש פתרון המכיל pK031:TRE-Cre (5 ng/µL), pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (µg 1/µL) או פתרון המכיל pK031:TRE-Cre (5 ng/µL), pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (µg 1/µL).
הערה: חלבונים שונים יכול להתבטא שכותרתו הנוירונים באמצעות צירופים שונים של וקטורים. כמו כן, גנים שונים שניתן הפילו-למטה או הפילו-אאוט בפרט תאים עם תוויות5,6 (למשל, סדרה של וקטורים עבור מערכת סופרנובה זמינים מרכז המחקר BioResource RIKEN, Addgene). - ביצוע רגיל. הצמיגים7,8,9,10,11 לתייג נוירונים בקליפת המוח. עבור תיוג של נוירונים שכבה 4, השתמש מתחלקים היום-14 עוברי.
- המתן עד מסירת הגור וצמיחה.
2. ניתוח
- עזים ומתנגד הגורים (P5) יום-5 כמחנכת באמצעות גז איזופלוריין (1.0%). לבצע בדיקת הזנב-קמצוץ כדי לבדוק את רמת ההרדמה. אם הכלבלב מגיב בלחץ, להעלות את ריכוז איזופלוריין (עד 2.0%) או להמתין עד התגובה נעלמת. לשמור על חום הגוף של הגור במהלך הניתוח באמצעות כרית החימום.
- Subcutaneously להזריק מקבל (carprofen, 5 מ"ג/ק"ג).
- לחטא העור של הכלבלב המכסה את הגולגולת שתמחקי את זה עם אתנול 70% שלוש פעמים.
- הסר כ 20 מ מ2 של העור המכסה את הגולגולת באמצעות מספריים לעקר עם 70% אתנול (איור 1 א').
- הסר fascia של הגולגולת באמצעות מלקחיים סטיריליים ספוגית כותנה נקי, סטרילי (איור 1 א').
- החל דבק רקמות באמצעות טעינת טיפים לפני השטח של העור חרות כדי לעצור את הדימום. אל תחיל את רקמת דבק לאזור הדימות (איור 1B), כי זה מקשה על פתיחת הגולגולת.
- במקום הכלבלב על כרית החימום (37 מעלות צלזיוס), לאפשר לו להתאושש מן ההרדמה. המתן עד שהדבק רקמות שהתייבשה פני השטח למוצק (כ- 30 דקות).
- במידת הצורך, להחיל יותר דבק רקמות, המתן עד יבש, לחזק.
3. חלון הגולגולת הכנה
- עזים ומתנגד הכלבלב באמצעות איזופלוריין (1.0-2.0%), בדוק את רמת הרדמה על ידי מבחן הזנב-קורט.
- בזהירות לפתוח את הגולגולת עם סכין גילוח סטיריליים עוזב את דורא שלם (1 מ מ קוטר) (איור 1C). השתמש בספוג ג'לטין (חתוך לחתיכות קטנות, כ < 2 מ מ3, באמצעות מספריים מעוקר, וליישם אותם באמצעות פינצטה) טבולים קליפת מאגר12 (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L אשלגן כלורי, גלוקוז 10 mmol/L, 10 mmol/L HEPES, mmol/L 2 CaCl2 , ו- 2 mmol/L MgSO4; pH 7.4; 300 mOsm/L; טמפרטורת החדר) כדי לעצור את הדימום. בעת פתיחת הגולגולת, החל חוצץ קליפת כדי לשמור את פני השטח של המוח לחות.
- הסר כל מאגר ודם מפני השטח. קרום שימוש בספוג ג'לטין. החל טיפים שכבה דקה של 1.0% באמצעות נקודת ההיתוך הנמוכה agarose (מומס מאגר cortex) צהוב. באמצעות מכונת בלוק חום, לשמור על הטמפרטורה של הפתרון agarose ב 42° C עד היישום.
הערה: ניקוז של מאגר ודם יש לבצע מהצד של הניתוח תוך דאגה בספוג ג'לטין יבש שאינו בא במגע עם השכבה הקשה של המוח. הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום נזק השכבה הקשה של המוח. - החל coverslip של זכוכית עגול (מס ' 1, 3 מ מ קוטר) על השכבה ג'ל agarose. להסיר את כל הבועות בין coverslip את השכבה ג'ל agarose על ידי מזיגת עודף של ג'ל agarose ביניהם. להסיר את הג'ל עודף בולט מתחת coverslip באמצעות פינצטה (איור 1D ו- 1E).
- אבטח את coverslip באמצעות מלט שיניים (איור 1F).
- מערבבים את אבקת מלט, הנוזל מלט. החל את התערובת בעזרת טיפים צהוב לפני זה פני השטח הופך למוצק. אל תחיל מלט שיניים על גבי דורא, כי זה עלול לגרום נזק למוח.
- צירוף של טיטניום סטרילי בר (בהתאמה אישית, כ- 30 מ"ג, ראה איור 1 ג'י) על עצם הגולגולת באמצעות מלט שיניים. יישר את בר טיטניום, את coverslip (על פני השטח של דורה), במקביל בקלות ללכוד תמונות.
- מכסים את הגולגולת חשוף עם מלט שיניים (איור 1 H).
- לשחזר את הגור מן ההרדמה. שמור אותו על הגל (37 מעלות צלזיוס) עד הבטון שיניים התחזק (1h).
4. שני הפוטונים הדמיה
הערה: התמונות ויוו באיור 2 נרכשו באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים עם לייזר טיטניום-ספיר (קרן קוטר [1/e2]2: 1.2 מ מ).
- קבע את אורך הגל של הלייזר שני הפוטונים. עבור RFP עירור, שימוש 1,000 nm (450 מ"מ/mW2 -מיקרומטר 400 של עומק).
הערה: עוצמת הלייזר צריך להיות מופחת כפי z-עובר למעלה. - נגב את פני השטח של coverslip עם 70% אתנול.
- עזים ומתנגד הכלבלב באמצעות איזופלוריין (1.5-2.0%), בדוק את רמת ההרדמה באמצעות מבחן הזנב-קורט.
- צרף הכלבלב לצלחת טיטניום על הבמה הדמיה באמצעות בר טיטניום על הראש של הכלבלב (איור 2A ו- 2B). התאם את הראש כך coverslip, הוא מקביל העדשה המטרה באמצעות השלב מד זווית (איור 2B). לשמור על טמפרטורת גוף של הכלבלב באמצעות כרית החימום (37 מעלות צלזיוס).
- הגדר את הריכוז איזופלוריין כ- 0.7% - 1.0%.
הערה: ריכוז גבוה מאוד איזופלוריין עלול לגרום מוות בתאונה של הכלבלב במהלך דימות. - מקם את הבמה דימות תחת עדשת אובייקטיבי (20 X, נה 1.0) מיקרוסקופ שני הפוטונים (איור 2B ו- 2 C).
- החל טיפה אחת של מים על גבי coverslip. השתמש epi-זריחה כדי לאתר את הנוירונים התווית על-ידי החלבון הניאון באזור שבו נחשפה השכבה הקשה של המוח.
- לרכוש תמונות z-מחסנית במרווחי זמן 1.4-מיקרומטר. שכבה 4 נוירון הדמיה, להגדיר את z-הרוחב 150-300 מיקרומטר לשיקוף המורפולוגיה דנדריטים כולו (איור דו-ממדי , 2E). שימוש איטי סריקה של ממוצע כדי לקבל תמונות ברורות מציג המורפולוגיה עצביים (זה בדרך כלל לוקח > 20 דקות כדי לרכוש המורפולוגיה דנדריטים כולו).
הערה: הפרמטרים הבאים מומלצים עבור הדמיה. עירור גל: 1,000 ננומטר, סורק: סוג גלוונומטר, ראי ודיקרואיק זוהר: 690 ננומטר, מסנן פליטה: 575-620 bandpass ננומטר, גלאי: סוג חאספ, לקבל הגדרה > 100, תמונה בגודל > 512 x 512 מיקרומטר, שדה ראייה > 600 x 600 מיקרומטר, פיקסל רזולוציה < 1.2 מיקרומטר.
5. החלמה וסיעוד
- ניתוק הכלבלב החל משלב הדמיה.
- למקם את הגור על הגל (37 מעלות צלזיוס) ולאפשר לשחזר (15 דקות).
- להאכיל הגור חלב חם באמצעות micropipette במרווחים של 2-h ולעורר בעדינות את הבטן כדי לאפשר הפרשה. לאשר כי הכלבלב שותה חלב על ידי מדידת משקל הגוף שלו.
6. תמונה חדשה
- עזים ומתנגד הכלבלב עם איזופלוריין (1.5-2.0%), ולבדוק את רמת ההרדמה באמצעות מבחן הזנב-קורט. לצרף אותו אל הבמה הדמיה.
- לאתר את הנוירונים בעבר שבעורך ולרכוש תמונת z-מחסנית. הזיהוי של נוירונים קל בשל תיוג דליל שלהם עם סופרנובה.
- חזור על שלבים 5.1-6.2 עד ההדמיה הושלמה. הערה: הכלבלב יכול לדימות ועד 18 h מבלי לאבד משקל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דמויות 2D - 2F הצג תוצאות נציג שני הפוטונים הדמיה בצילום מואץ של שכבה 4 נוירונים בקליפת המוח משתמש בפרוטוקול הנוכחי. לצורך ניתוח, בחר נוירונים עם מורפולוגיה דנדריטים ברור לאורך כל התקופות הדמיה. ניתחנו את המורפולוגיה דנדריטים של נוירונים הדמיה באמצעות תוכנת ניתוח מורפולוגי. מורפולוגיה דנדריטים נציג שחזור מוצג באיור 2F. נוירונים מציג המנותקת דנדריטים (איור 2G) צריך להיות מהכלל מניתוחי, מכיוון דנדריטים המנותקת מציינים מוות תאי הנגרם על ידי נזק במהלך הניתוח או הדמיה. בנוסף, נוירונים עם טיפים דנדריטים מטושטשת צריך להיות שלא נכללו (למשל, הנוירון עם החץ בדו מימד איור).
איור 1: ניתוח, הכנת חלון הגולגולת, מצורף של אנחנו חיים טיטניום (א) לוח זה מראה את הסרת העור המכסה את הגולגולת. (B) לוח זה מראה את הקיבעון של הפער שבין העור הגולגולת. יש להיזהר לא להחיל את הקשר אל אזור ההדמיה. (ג) זו תמונה של דורה חשוף. סכין גילוח הוכנס בין הגולגולת השכבה הקשה של המוח, הגולגולת הייתה מנפנפת פתוח משמאל באזור החשוף (חץ). העצם ואז ניתן להסיר בקלות באמצעות מלקחיים. (ד) זה הוא עיצוב סכמטי מציג מבט אנכי של החלון הגולגולת. הפער בין הזכוכית המכסה את דורא מתמלא שכבה דקה של agarose ג'ל. Coverslip קבוע לגולגולת באמצעות מלט שיניים. Coverslip (אי) A בצורת עגול מושם על שכבת ג'ל agarose. (F) זו תמונה של coverslip מאובטחת. (G) לוח זה מראה את העיצוב של הבר טיטניום. הבר טיטניום מכיל שני חורי הברגים עבור הקובץ המצורף לשלב הדמיה (ראה איור 2) וחלק אחד מלבני שטוח המוצמד לראש של הגורים. (H) החלק המלבני של טיטניום בר מחובר לגולגולת של הכלבלב באמצעות מלט שיניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: In vivo שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים neonatal. (א) לוח זה מראה את העיצוב של צלחת טיטניום. הצלחת טיטניום כולל שני חורי הברגים לצירוף הבר טיטניום, ארבעה חורי הברגים לצירוף השלב מד זווית, אשר ממוקם על הבמה הדמיה. 2.5 מ"מ (בקוטר) x מ מ 2 (באורכו) משמשים עבור קיבעון. (B) זה תמונת הנציגה של הכלבלב צמוד לשלב הדמיה. טמפרטורת הגוף של הכלבלב נשמר באמצעות תנור. (ג) הכלבלב הוא מורדם באמצעות איזופלוריין במהלך ה- ויוו הדמיה בהליך. (ד) לוח זה מציג תמונת הנציגה של זמן לשגות Z-מחסנית של שכבה 4 נוירונים בקליפת המוח של גור P5. החץ מצביע על הנוירון עם דנדריטים מטושטשת, אשר יש להסיר מן הניתוח. (E) לוח זה מראה הגדלה גבוהה יותר תמונות בצילום מואץ של הנוירון עם החצים בלוח ד'. כחול ראשי חץ: עצות דנדריטים הם נסוגים ב 4.5 h, צהוב ראשי חץ: עצות דנדריטים הם מוארך ב 4.5 h, ראשי חץ לבן קטן: אקסון של תא השכן. (F) דגם תלת-ממדי של המעקב הדנדריטים של נוירון באיור השמאלי של החלונית E. העיגולים הכחולים לציין את המיקום של גוף התא. (G) לוח זה מציג את הנוירונים נציג עם דנדריטים מנותקות, אשר אינם נכללים בניתוח. הנתונים לדוגמה פאנלים D - G מכילים NR1 (חיוני יחידת משנה של קולטן NMDA-סוג גלוטמט) - הפיל - נוירונים (בגלל נתונים מוגבלים זמין מן המחברים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול לפתרון בעיות:
השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הינו של הגולגולת (פרוטוקול שלב 3.2). בשעת ההוספה, גילוח לאנאפוליס לעיתים קרובות השכבה הקשה של המוח, גורם לדימום. קרום נזק למוח. זה ניתן למנוע על-ידי הוספת טיפה של קליפת מאגר על הגולגולת והסרה הגולגולת במאגר בקליפת המוח.
דימום השכבה הקשה של המוח, העור לאחר הכנת חלון הגולגולת מוביל סגר של החלון. כדי למנוע זאת, הרקמה מלט דבק קונבציונאלית בשימוש צריך להיות מותר יבש לחלוטין לפני שתמשיך לשלב הבא. צריך להיות מוכן הגורים מרובים עם חלון הגולגולת מאז קשה להימנע לחלוטין דימום. באופן כללי, אם החלון הגולגולת נותר ברורה ויציבה במשך 2-3 שעות לאחר הניתוח, הכלבלב יכול לשמש עבור הדמיה בצילום מואץ.
משמעות השיטה ביחס שיטות קיימות/חלופית:
. הנה, תארנו שיטת ויוו שני הפוטונים הדמיה של קליפת neonatal. פרוטוקול זה יש מספר היתרונות לעומת שיטות שדווחה בעבר. אלה מפורטים כדלקמן.
1) נוירונים קורטיקלית ניתן בדלילות, במאור פנים שכותרתו מאת transfecting סופרנובה וקטורים באמצעות הצמיגים. . הצמיגים כבר בשימוש נרחב עבור תיוג של נוירונים בקליפת המוח במהלך פיתוח שלבים. אולם, הצמיגים פשוטה היא מצוייה ההדמיה של נוירונים בודדים מאז נוירונים יכולה להיקרא גם בצפיפות7,-8,-9,-10. יתר על כן, באמצעות מערכת סופרנובה, סוגים שונים של חלבונים פלורסנט יכול לשמש עבור תיוג אוכלוסיות דלילה של נוירונים. לדוגמה, שימוש בתיווך סופרנובה דליל תיוג של מחוון סידן מקודדים גנטית13,GCaMP14, לאחרונה ערכנו ניתוח תפקודי של נוירונים בודדים בשכבה קליפת המוח המתפתח 4 (P3 כדי P13) 15.
2) השיטה המתוארים במחקר זה מתאים שחקרתי את המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח מעגלים עצביים. מערכת סופרנובה מאפשר בדלילות שכותרתו נוקאאוט התא הספציפי של כל הגן. לפיכך, ניתן לצפות את הדינמיקה של נוירון המכיל הפרעה גנים ספציפיים. לענין זה, מערכות מבוססות גנטיקה כמו גברת16 ו חלקלק17 דווחו בעבר. עם זאת, מכיוון הרבייה של קווים העכבר הוא חיוני עבור מערכות אלו, הם דורשים הרבה זמן ועלות מאשר הפרוטוקול המתואר כאן.
3) מחקר זה מנצל סכין גילוח להסרת הגולגולת. זה ממזער לדמם השכבה הקשה של המוח ומאפשרת את הפתיחה של שטח רחב של הגולגולת (< 2 מ מ קוטר). באמצעות הליך זה, ניתן היה לצפות את פעילות ספונטנית של שכבת נוירונים 4 באזור כולו חבית גדולה בתוך קליפה המגע15.
מגבלות של השיטה:
חיסרון ויוו הדמיה של המוח העכבר neonatal, לעומת ההדמיה של חיות שקופים כגון דג זברה הזחלים ראשנים של צפרדע רפואית , היא ברזולוציה נמוכה יותר יכולות. לאט סריקה של חישוב ממוצע צריכה להתבצע עבור מניב תמונות ברורות של המורפולוגיה עצביים בגלל פיזור אור יותר מתרחשת במוח העכבר. פיזור אור אולי יכול להיות מופחת באמצעות לייזר באורך גל ארוך יותר חלבון פלואורסצנטי עירור, חלבונים עם אורכי פליטת קרינה פלואורסצנטית.
הגבלה נוספת של הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות ניתוח לפתיחת חלון הגולגולת ההשתלה עלולה להשפיע על היווצרות של מעגל קורטיקלית רגילה עקב דלקת המוח12. עם זאת, יש הסתברות גבוהה כי ויוו הדמיה היא פיזיולוגית יותר בהשוואה במבחנה הדמיה כגון הדמיה בצילום מואץ של הכנת פרוסה במוח, אשר צריך גם להצמיח דלקת חמורה על ידי איסכמיה וחלוקת. גם דווח כי החשיפה החוזרת לאיזופלוריין עלול להשפיע על תהליכים עצביים מספר18. בקרת ניסויים צריכה להתבצע לאימות נאותות התוצאות המתקבלות על-ידי הדמיה ויוו . במקרה שלנו הדמיה של שכבה 4 נוירונים בתוך קליפת המגע, אישרנו זאת עלייה נורמלי ואורכו דנדריטים ורכישה של התמצאות הטיה של תחזיות דנדריטים של נוירונים stellate קוצני5,20.
מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על > 1 - מ מעומק הדמיה במוח העכבר למבוגרים שבו השכבה הקשה של המוח הוסר. במהלך ניתוח19. מצד שני, אנחנו כבר מסוגל לדווח עד 400-מיקרומטר-עומק הדמיה neonates5. מאז לא ניתן להסיר את השכבה הקשה של המוח ב neonates זה, בתורו, מוביל פיזור אור גבוהה, אנו רואים כי הדמיה עמוק ב- neonates הוא מאתגר יותר מאשר אצל מבוגרים. שיפור עתידי הגששים פלורסנט, לייזרים גלאי צריך לאפשר עמוק הדמיה במוח neonatal.
עד כה, אנו מדווחים על 18 שעות זמן לשגות הדמיה באמצעות פרוטוקול נוכח5. לאחרונה, הצלחנו בתחום ההדמיה זמן לשגות 72 שעות על ידי שיפור את פרוטוקול20. אנו נמשיך לחדד את פרוטוקול המובאת כאן (למשל, זמן ארוך טווח, גבוה יותר, ו/או הדמיה ברזולוציה מרחבית) חשיפת מנגנוני דינמי של פיתוח מעגלים עצביים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה סאטו ט, מ Kanbayashi ו- Kouyama ס' לסיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על- ידי JSPS KAKENHI גרנט מספרים JP15K14322, JP16H06143, קרן המדע טקדה, קרן ההנצחה Uehara ו את שיתופי מחקר פרויקט של נייגאטה אוניברסיטת המוח מחקר מכון 2017-2923 (H.M.) KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, ו JP15H04263, במענק מחקר מדעי בתחומים חדשנות "דינמי ויסות תפקוד המוח על ידי גרוטאות & לבנות מערכת" (JP16H06459) מ- MEXT (רכב מורשה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
