Summary
Vi presenterer en i vivo to-fotonet imaging protokoll for imaging hjernebarken neonatal mus. Denne metoden er egnet for å analysere utviklingsmessige dynamikken i kortikale nevroner, molekylære mekanismer som kontrollerer neuronal dynamikken og endringene i neuronal dynamikk i sykdom modeller.
Abstract
To-fotonet bildebehandling er et kraftig verktøy for i vivo analyse av nevrale kretser i pattedyr hjernen. Imidlertid finnes et begrenset antall i vivo tenkelig metoder for å undersøke hjernevev live nyfødte pattedyr. Her oppsummere vi en protokoll for imaging personlige kortikale nevroner i levende neonatal mus. Denne protokollen inkluderer de følgende to metodikkene: (1) Supernova system for sparsom og lyse merking av kortikale nerveceller i utvikle hjernen, og (2) en kirurgisk prosedyre for skjøre neonatal skallen. Denne protokollen tillater observasjon av tidsmessige endringer av personlige kortikale neurites under neonatal stadier med en høy signal-til-støy-forhold. Merket celle-spesifikke genet stanse og knockout kan også oppnås ved å kombinere Supernova RNA-interferens og CRISPR/Cas9 gene redigering systemer. Denne protokollen kan dermed brukes for å analysere utviklingsmessige dynamikken i kortikale nevroner, molekylære mekanismer som styrer neuronal dynamikk, og endringer i neuronal dynamikk i sykdom modeller.
Introduction
Den nøyaktige kablingen for nevrale kretser i hjernebarken er viktig for høyere hjernefunksjoner inkludert persepsjon, kognisjon, og læring og hukommelse. Kortikale kretser er dynamisk raffinert under postnatal utvikling. Studier har undersøkt prosessen av kortikale krets dannelsen ved hjelp av histologiske og i vitro kulturanalyser. Men har dynamikken i kretsen formasjonen i levende pattedyr vært stort sett uutforsket.
To-fotonet mikroskopi er mye brukt for i vivo -analyser av nevrale kretser i voksen mus hjernen1,2. Men på grunn av tekniske utfordringer, har bare et begrenset antall studier adressert neuronal krets formasjonen i nyfødte mus. For eksempel utført Carrillo et al. tidsinnstilt bildebehandling klatring fibre i lillehjernen i andre postnatal uke3. Portera-Cailliau et al. rapportert avbilding av axons i kortikale lag 1 i første postnatal uke4. Studien oppsummere vi en protokoll for observasjon av lag 4 kortikale nevroner og deres dendrites i nyfødte mus. Resultatene ved å bruke denne protokollen, som inkluderer to metoder, rapporteres i våre siste publikasjon5. Først bruker vi Supernova vektor system5,6 for merking individuelle neurons i neonatal hjernen. I Supernova systemet, fluorescerende proteiner brukes for neuronal merking er utskiftbare og merket celle-spesifikke genet knockdown og redigering/knockout analyser er også mulig. Andre, beskriver vi en kirurgisk prosedyre for kraniale vinduet forberedelse i skjøre neonatal mus. Sammen tillater disse metodene i vivo observasjon av individuelle neurons i neonatal hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter bør utføres i henhold til dyrevelferd veiledning foreskrevet av det eksperimentator institusjon.
1. forberedelse av Pups for Imaging
Merk: Pups med tynt merket kortikale neurons kan fås ved i utero electroporation (IUE) Supernova vektorer5,6. Supernova systemet består av følgende to vektorer: TRE-grobunn og CAG-loxP-STOP-loxP-gen X-ires-tTA-WPRE. I dette systemet avhengig sparsom merking TRE lekkasje. I en sparsom befolkningen transfekterte neurons stasjoner TRE svak uttrykk for grobunn og tTA. Senere, bare i disse cellene, er uttrykk for gen X tilrettelagt av en positiv tilbakemelding tTA-TRE sykluser. Oppnådd sparsom og lyse merkingen kan effekten av morfologiske detaljene i individuelle neurons i vivo. Detaljer om IUE prosedyren er ikke beskrevet i denne protokollen siden de er beskrevet andre steder7,8,9,10,11.
- Forberede tidsbestemte-gravide mus IUE.
- Forberede en DNA-løsning for IUE. Sparsom merking med RFP, bruke en løsning som inneholder pK031:TRE-grobunn (5 ng/µL) og pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) eller en løsning som inneholder pK031:TRE-grobunn (5 ng/µL) og pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL).
Merk: Ulike proteiner kan uttrykkes i merket neurons bruker forskjellige kombinasjoner av vektorer. Også ulike gener kan banket-ned eller slått ut i merkede celler5,6 (f.eksen rekke vektorer for Supernova-systemet er tilgjengelig fra RIKEN BioResource Research Center og Addgene). - Utføre vanlige IUE7,8,9,10,11 Hvis etiketten kortikale nevroner. Merking av lag 4 neurons, bruke embryonale dag-14 embryoer.
- Vent til pup levering og vekst.
2. kirurgi
- Bedøve postnatal dag-5 (P5) programmet bruker isoflurane gass (1,0%). Utfør en hale-klype for å kontrollere nivået av anestesi. Hvis pup reagerer på klemme, øke isoflurane konsentrasjonen (opptil 2.0%) eller vente på svaret forsvinner. Opprettholde det pup kroppstemperatur under operasjonen bruker en oppvarming pad.
- Subcutaneously injisere en analgesic (carprofen, 5 mg/kg).
- Sterilisere det pup huden dekke skallen ved å tørke den med 70% etanol tre ganger.
- Fjern ca 20 mm2 av huden dekke skallen med saks sterilisert med 70% etanol (figur 1A).
- Fjerne fascia av skallen bruke steriliserte tang og en ren, sterile bomullspinne (figur 1A).
- Bruke vevet lim bruke lasting tips å skåret huden overflate for å stoppe blødningen. Gjelde ikke vev lim tenkelig området (figur 1B) fordi dette gjør åpning av skallen vanskeligere.
- Plasser pup på en varmeputen (37 ° C) og la den til å gjenopprette fra anestesi. Vent til vev limet har tørket og styrket (ca 30 min).
- Om nødvendig bruke flere vev lim og vent til den tørke og stivne.
3. skallen vinduet forberedelse
- Bedøve pup med isoflurane (1,0% - 2.0%) og kontrollere anestesi nivået av en hale-klype test.
- Nøye åpne skallen med en sterilisert barberblad forlate dura intakt (1 mm i diameter) (figur 1 c). Bruk en gelatin svamp (skåret i små biter, ca < 2 mm3, bruke steriliserte saks, og bruke dem ved hjelp av pinsett) dynket i cortex buffer12 (125 mmol/L NaCl 5 mmol/L KCl, 10 mmol/L glukose, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl2 , og 2 mmol/L MgSO4; pH 7.4; 300 mOsm/L; romtemperatur) for å stoppe blødningen. Når du åpner skallen, bruke en cortex buffer for å holde hjernen overflaten fuktig.
- Fjern eventuell buffer og blod fra dural overflaten med en gelatin svamp. Bruke et tynt lag med 1,0% lav-smelte-punkt agarose (oppløst i cortex buffer) bruker gul tips. Bruker en varme blokk maskin, opprettholde temperaturen i agarose løsningen på 42° C til programmet.
Merk: Drenering av bufferen og blod må utføres fra side av craniotomy mens du tar vare som tørr gelatin svampen ikke kommer i kontakt med dura. Gjør det kan skade dura. - Bruk en runde glass dekkglassvæske (nr. 1, 3 mm i diameter) på agarose gel laget. Fjern alle boblene mellom dekkglassvæske og agarose gel laget ved å helle et overskudd av agarose gel mellom dem. Fjern overflødig gel stikker fra dekkglassvæske ved hjelp av pinsett (figur 1 d og 1E).
- Sikre dekkglassvæske ved hjelp av dental sement (figur 1F).
- Bland sement pulver og sement væsken. Påfør blandingen med gule tips før det blir styrket. Gjelde ikke dental sement på dura, fordi dette kan skade hjernen.
- Knytte et sterilt Titan bar (skreddersydde, ca 30 mg, se figur 1G) på skallen bein med dental sement. Juster Titan baren og dekkglassvæske (på overflaten av dura) parallelt lett fange bilder.
- Dekk eksponert skallen med dental sement (figur 1 H).
- Gjenopprette pup bedøvelsen. Holde det på en ovn (37 ° C) før dental sement har styrket (1 h).
4. to-fotonet Imaging
Merk: I vivo bildene i figur 2 ble anskaffet et to-fotonet mikroskop med en Titan-Safirglass laser (stråle diameter [1/e2]2: 1,2 mm).
- Angi to-fotonet laser bølgelengde. For RFP eksitasjon, bruk 1000 nm (450 mW/mm2 på 400 µm dybde).
Merk: Laser makt skal reduseres som z-posisjonen flytter oppover. - Tørke overflaten av dekkglassvæske med 70% etanol.
- Bedøve pup med isoflurane (1,5% - 2.0%) og sjekk anestesi nivået med en hale-klype test.
- Fest pup Titan plate på tenkelig scenen med en Titan stang på det pup hode (figur 2A og 2B). Justere hodet slik at dekkglassvæske er parallell til linsen bruker goniometer scenen (figur 2B). Opprettholde kroppstemperatur av programmet bruker en varmeputen (37 ° C).
- Angi isoflurane konsentrasjonen 0,7% - 1,0%.
Merk: En svært høy isoflurane konsentrasjon kan føre til utilsiktet død pup under bildebehandling. - Plass tenkelig scenen under målet linsen (20 X, NA 1.0) av to-fotonet mikroskopet (figur 2B og 2 C).
- Bruke en dråpe vann på dekkglassvæske. Bruke epi-fluorescens for å finne fluorescerende protein-merket neurons i området der dura har vært utsatt.
- Erverve z-stakk bilder på 1,4-µm intervaller. Lag satt 4 Nevron imaging z-bredden til 150-300 µm å image hele dendrittiske morfologi (figur 2D og 2E). Bruk langsom skanning og snitt for å få klare bilder viser neuronal morfologi (det tar vanligvis > 20 min å kjøpe hele dendrittiske morfologi).
Merk: Følgende parametere anbefales for bildebehandling. Eksitasjon bølgelengde: 1000 nm, skanner: galvanometer type, dichroic speil: 690 nm, utslipp filter: 575-620 nm Båndpassdesign, detektor: GaAsP type, få innstilling > 100, image størrelse > 512 x 512 µm, synsfelt > 600 x 600 µm, pixel resolution < 1.2 µm.
5. utvinning og sykepleie
- Koble pup fra tenkelig scenen.
- Plasser pup på en ovn (37 ° C) og la den gjenopprette (15 min).
- Mate pups varm melk med brønnene på 2-h intervaller og forsiktig stimulerer magen å tillate utskillelse. Bekreft at pup er til å drikke melk ved å måle sin kroppsvekt.
6. re-tenkelig
- Bedøve pup med isoflurane (1,5% - 2.0%), og sjekk anestesi nivået med en hale-klype test. Knytte den til tenkelig scenen.
- Finn tidligere fotografert neurons og Hent en z-stack bilde. Identifikasjon av neurons er enkelt takket være sparsommelig merking med Supernova.
- Gjenta trinn 5.1-6.2 til bildebehandling er fullført. Merk: Pup kan avbildes til 18 h uten å miste vekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tallene 2D - 2F Vis representant resultatene av to-fotonet tidsinnstilt bildebehandling lag 4 kortikale neurons bruker stede protokollen. For analyse, Velg neurons med klart dendrittiske morfologi gjennom tenkelig periodene. Vi analyserte dendrittiske morfologi av fotografert neurons bruker morfologisk analyseprogramvare. Representant dendrittiske morfologi gjenoppbygging er vist i figur 2F. Neurons viser frakoblet dendrites (figur 2 g) bør utelukkes fra analyser, fordi frakoblede dendrites indikerer celledød indusert av skade under kirurgi eller imaging. I tillegg skal neurons med uklare dendrittiske tips ekskluderes (f.eksNevron med pilspissen i figur 2D).
Figur 1: kirurgi, skallen vinduet forberedelser og feste Titan stang (A) dette panelet viser fjerning av huden dekke skallen. (B) dette panelet viser fiksering av gapet mellom huden og kraniet. Pass på at du ikke bruk bånd til tenkelig området. (C) Dette er et bilde av den utsatte dura. Et barberblad ble satt inn mellom skallen og dura og skallen var flakset åpen til venstre for eksponert område (pilspiss). Benet kan deretter enkelt fjernes ved hjelp av pinsett. (D) Dette er en skjematisk design viser en loddrett visning av vinduet skallen. Gapet mellom dekket glasset og dura er fylt med et tynt lag av agarose gel. Dekkglassvæske er fast til skallen bruke dental sement. (E) A rund-formet dekkglassvæske plasseres på agarose gel laget. (F) Dette er et bilde av den sikre dekkglassvæske. (G) dette panelet viser utformingen av baren Titan. Baren Titan inneholder to skruehullene for tilknytning til tenkelig scenen (se figur 2) og en flat rektangulær del som er knyttet til det pup hode. (H) den rektangulære delen av Titan bar er knyttet til det pup skull bruke dental sement. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: I vivo to-fotonet avbilding av kortikale nevroner i neonatal mus. (A) dette panelet viser utformingen av Titan plate. Titan plate har to hullene for å feste baren Titan og fire skruehullene for å feste goniometer scenen, som er plassert på tenkelig scenen. 2.5 mm (i diameter) x 2 mm (lengde) skruene brukes for fiksering. (B) Dette er et representativt bilde av pup knyttet til bildebehandling scenen. Det pup kroppstemperatur opprettholdes med et Varmeapparat. (C) pup er anesthetized bruke isoflurane under den i vivo imaging prosedyren. (D) dette panelet viser et representativt Z stabel time-lapse bilde av lag 4 kortikale nevroner i en P5 pup. Pilspissen angir Nevron med uklare dendrites, som bør fjernes fra analysen. (E) dette panelet viser høyere forstørrelse time-lapse bilder av Nevron med piler i D-panelet. Blå pilspisser: dendrittiske tips som er trukket i 4.5 h, gul pilspisser: dendrittiske tips som er avlang i 4.5 h, små hvite pilspisser: axon av en nærliggende celle. (F) Dette er en 3D modell av dendrittiske sporingen av Nevron i venstre figur E-panelet. Blå sirkler angir posisjonen til celle kroppen. (G) dette panelet viser representant neurons med frakoblet dendrites, som ikke er inkludert i analysen. Eksempeldataene i paneler D - G inneholder NR1 (en viktig delenhet i NMDA-type glutamat reseptor) - slått - ut neurons (på grunn av begrensede data tilgjengelig fra forfatterne). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avgjørende skritt i protokollen og feilsøking:
Det viktigste trinnet av protokollen er fjerning av skallen (protokollen trinn 3.2). Ved innsetting overholder den razor bladet ofte dura, forårsaker dural blødning og skade på hjernen. Dette kan unngås ved å legge en dråpe cortex buffer på skallen og fjerne skallen cortex buffer.
Blødning fra dura og huden etter skallen vinduet forberedelse fører til okklusjon av vinduet. For å unngå dette, vevet lim og dental sement brukes bør kunne helt tørt før du fortsetter til neste trinn. Flere pups med skallen vindu bør være forberedt siden det er vanskelig å helt unngå blødning. Hvis vinduet skallen forblir klar og stabil for 2-3 h etter operasjonen, kan generelt pup brukes for tidsinnstilt bildebehandling.
Betydningen av metoden med hensyn til eksisterende/Alternative metoder:
Her har vi beskrev en metode for i vivo to-fotonet imaging på neonatal cortex. Denne protokollen har flere fordeler sammenlignet med tidligere rapportert metoder. Disse står som følger.
1) kortikale neurons kan tynt og lyst merkes med transfecting Supernova vektorer ved hjelp av IUE. IUE har vært mye brukt for merking av kortikale neurons under utviklingen stadier. En enkel IUE er imidlertid uegnet for avbilding av individuelle neurons siden neurons kan merkes for tett7,8,9,10. Videre kan bruker Supernova systemet, ulike typer fluorescerende proteiner brukes til merking sparsom bestander av neurons. For eksempel bruker Supernova-mediert sparsom merking av en genetisk kodet kalsium indikator GCaMP13,14, vi har nylig utført en funksjonell analyse av individuelle neurons i utviklingsland cortex laget 4 (P3 å P13) 15.
2) metoden beskrevet i denne studien er egnet for Klargjørende molekylære mekanismer underliggende neuronal krets utvikling. Supernova systemet tillater tynt merket celle-spesifikke knockout av noen genet. Dermed kan dynamikken i en Nevron som inneholder bestemte genet avbrudd observeres. For dette formålet, er genetikk-baserte systemer som MADM16 og SLEIP17 tidligere rapportert. Men fordi oppdrett av musen linjer er viktig for disse systemene, krever de mye tid og kostnader enn protokollen beskrevet her.
3) denne studien benytter et barberblad skallen fjerning. Dette minimerer blødning fra dura og tillater åpning av et stort område av skallen (< 2 mm i diameter). Bruker denne fremgangsmåten, var det mulig å observere spontan aktiviteten til lag 4 nerveceller i hele stor tønne området innenfor somatosensory cortex15.
Begrensninger av metoden:
En ulempe ved i vivo bildebehandling av musen neonatal hjernen, sammenlignet med avbilding av gjennomsiktige dyr som sebrafisk larver og Xenopus rumpetroll, er lavere romlige og tidsmessige oppløsning. Sakte skanning og snitt bør utføres for gir klare bilder av neuronal morfologi fordi mer lysspredning skjer i musen hjernen. Lysspredning kan muligens bli redusert med en lengre bølgelengde laser for fluorescerende protein eksitasjon og proteiner med lengre fluorescens utslipp bølgelengder.
En annen begrensning av nåværende protokollen kan være at operasjonen for kraniale vinduet implantasjon kan påvirke dannelsen av en normal kortikale krets på grunn av hjernen betennelse12. Men er det en høy sannsynlighet at i vivo imaging er mer fysiologiske forhold med i vitro imaging som tidsinnstilt bildebehandling av hjernen stykke preparatet, som bør også gi opphav til alvorlig betennelse av iskemi og slicing. Det er også rapportert at repeterende eksponering for isoflurane kan påvirke flere neuronal prosesser18. Kontroll eksperimenter skal utføres for å bekrefte hensiktsmessigheten av resultatene av i vivo tenkelig. Når det gjelder våre avbildning av lag 4 nerveceller i somatosensory cortex bekreftet vi en vanlig økning i dendrittiske totallengde og anskaffelse av orientering skjevhet av dendrittiske anslag spiny stellate neurons5,20.
Nyere studier rapportert > 1 - mm-dybde imaging i en voksen mus hjernen hvor dura ble fjernet under kirurgi19. På den annen side, har vi kunnet rapporten til 400-µm-dybde imaging i nyfødte5. Siden dura kan ikke fjernes i nyfødte og dette i sin tur fører til en høy lysspredning, anser vi at dyp imaging i nyfødte er mer utfordrende enn hos voksne. Fremtidige forbedringer i fluorescerende sonder, lasere og detektorer bør tillate dyp imaging i neonatal hjernen.
Så langt har vi rapportert 18-timers time-lapse imaging bruker den nåværende protokollen5. Nylig har vi lykkes i 72-timers tidsinnstilt bildebehandling ved å forbedre den protokoll20. Vi vil fortsette å avgrense protokollen presenteres her (f.eks, langsiktige, høyere tid eller romlige oppløsning imaging) for å avsløre dynamisk mekanismer for neuronal krets utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker T. Sato og M. Kanbayashi S. Kouyama for deres kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI Grant tall JP15K14322 og JP16H06143, Takeda Science Foundation, Uehara Memorial Foundation og de samarbeidende forskning prosjekt av Niigata University hjernen Research Institute 2017-2923 (H.M.) og KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, og JP15H04263 og Grant i vitenskapelig forskning på innovasjon områder "Dynamisk regulering av hjernefunksjon av skrap & nybygg System" (JP16H06459) fra MEXT (ti).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
