Summary
Apresentamos um na vivo dois fotões protocolo para o córtex cerebral de ratos neonatais de imagem de imagem. Este método é adequado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, os mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e as mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.
Abstract
Imagem de dois fotões é uma poderosa ferramenta de análise de circuitos neuronais do cérebro de mamíferos na vivo . No entanto, um número limitado de no vivo de imagem métodos existe para examinar o tecido do cérebro de mamíferos recém-nascidos ao vivo. Aqui resumimos um protocolo para imagens individuais neurônios corticais em camundongos neonatais vivos. Este protocolo inclui as seguintes duas metodologias: (1) o sistema de Supernova para esparsas e brilhantes rotulagem dos neurônios corticais no cérebro em desenvolvimento e (2) um procedimento cirúrgico para o crânio neonatal frágil. Este protocolo permite a observação de mudanças temporais de neuritos corticais individuais durante estágios neonatais com uma alta relação sinal-ruído. Silenciamento de genes de células específicas rotuladas e nocaute também podem ser alcançados pela combinação da Supernova com interferência do RNA e gene CRISPR/Cas9 sistemas de edição. Este protocolo pode, assim, ser utilizado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.
Introduction
A fiação precisa de circuitos neuronais no córtex cerebral é essencial para funções superiores do cérebro incluindo a percepção, cognição e aprendizagem e memória. Circuitos corticais são dinamicamente refinados durante o desenvolvimento pós-natal. Estudos têm investigado o processo de formação de circuito cortical usando histológico e em vitro análises de cultura. No entanto, a dinâmica da formação do circuito em mamíferos viventes manteve-se na maior parte inexplorada.
Microscopia de dois fotões tem sido amplamente utilizada para as análises em vivo dos circuitos neuronais no cérebro do rato adulto1,2. No entanto, devido a desafios técnicos, somente um número limitado de estudos abordaram a formação do circuito neuronal em ratos recém-nascidos. Por exemplo, Carrillo et al realizaram a lapso de tempo imagem de fibras no cerebelo na segunda semana pós-parto3de escalada. Porteira-Cailliau et al relataram a imagem dos axônios na camada cortical 1 na primeira semana pós-natal4. No presente estudo, resumimos um protocolo para a observação de neurônios corticais de camada 4 e suas dendrites em camundongos recém-nascidos. Os resultados obtidos através da aplicação do presente protocolo, que inclui duas metodologias, são relatados em nossa recente publicação5. Primeiro, usamos a Supernova vetor sistema5,6 para rotular os neurônios individuais no cérebro neonatal. No sistema de Supernova, as proteínas fluorescentes usadas para rotular neuronal são knockdown exchangeable e etiquetados célula específica do gene e edição/nocaute análises também são possíveis. Em segundo lugar, descrevemos um procedimento cirúrgico para a preparação de janela cranial em camundongos neonatais frágil. Juntas, essas metodologias permitem a observação na vivo de neurônios individuais no cérebro neonatal.
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Protocol
Experimentos devem ser realizados de acordo com as normas de bem-estar animal prescritas pela instituição do experimentador.
1. preparação dos filhotes para a imagem latente
Nota: Filhotes com escassamente rotulados neurônios corticais podem ser obtidos por no utero eletroporação (IUE) de Supernova vetores5,6. O sistema de Supernova consiste dos seguintes dois vetores: TRE-Cre e CAG-loxP-STOP-loxP-Gene X-ires-tTA-WPRE. Neste sistema, rotulagem esparsas depende de escapamento do TRE. Em uma população dispersa de neurônios transfectadas, TRE dirige a fraca expressão da Cre e tTA. Posteriormente, apenas nestas células, a expressão do gene X é facilitada por um feedback positivo dos ciclos de tTA-TRE. O alcançado esparsas e brilhantes rotulagem permite a visualização de detalhes morfológicos de neurônios individuais em vivo. Detalhes do procedimento de IUE não são descritos no presente protocolo, desde que eles foram descritos em outro lugar7,8,9,10,11.
- Prepare-se ratos grávidas cronometrado para IUE.
- Prepare uma solução de DNA para IUE. Para a rotulagem esparsas com RFP, use uma solução contendo pK031:TRE-Cre (5 ng / µ l) e pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ l) ou uma solução contendo pK031:TRE-Cre (5 ng / µ l) e pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ l).
Nota: Várias proteínas podem ser expressos nos neurônios etiquetados usando diferentes combinações de vetores. Além disso, vários genes podem ser batido para baixo ou eliminado especificamente em pilhas etiquetadas5,6 (por exemplo, uma série de vetores para o sistema de Supernova estão disponíveis de RIKEN BioResource Research Center e de Addgene). - Execute regular IUE7,8,9,10,11 para rotular os neurônios corticais. Para a rotulagem de neurônios da camada 4, use embriões embrionários do dia-14.
- Espere para o crescimento e a entrega do filhote.
2. cirurgia
- Anestesia o pós-Natal dia-5 (P5) filhote usando gás de isoflurano (1,0%). Execute um teste de cauda-pitada para verificar o nível de anestesia. Se o filhote responde para o aperto, aumentar a concentração de isoflurano (até 2,0%) ou esperar até que a resposta desaparece. Manter a temperatura do corpo do filhote durante a cirurgia, usando uma almofada de aquecimento.
- Por via subcutânea injete um analgésico (carprofeno, 5 mg/kg).
- Esterilize a pele do filhote cobrindo o crânio por limpá-lo com etanol a 70% três vezes.
- Remova aproximadamente 20 mm2 da pele cobrindo o crânio com uma tesoura esterilizada com 70% de etanol (figura 1A).
- Retire a fáscia do crânio usando Pinças esterilizadas e um cotonete de algodão limpas e esterilizadas (figura 1A).
- Aplique o adesivo de tecido usando dicas de carregamento à superfície da pele incisão para parar o sangramento. Não aplique adesivo de tecido para a área de imagem (figura 1B) porque isso dificulta a abertura do crânio.
- Coloque o filhote em uma bolsa de água quente (37 ° C) e deixe-o recuperar da anestesia. Espere até que o adesivo de tecido tem secado e solidificado (cerca de 30 min).
- Se necessário, aplique mais tecido adesivo e esperar que seque e solidificar.
3. craniana janela preparação
- Anestesiar o filhote usando isoflurano (1,0% - 2,0%) e verificar o nível de anestesia por um teste de cauda-pitada.
- Abra cuidadosamente o crânio com uma lâmina de barbear esterilizada, deixando a dura-máter intacta (1 mm de diâmetro) (Figura 1). Use uma esponja de gelatina (cortadas em pedaços pequenos, aproximadamente 2mm <3, usando a tesoura esterilizada e aplicá-las usando uma pinça) embebido no córtex reserva12 (125 mmol/L de NaCl, 5 mmol/L KCl, glicose 10 mmol/L, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl2 e 2 mmol/L de MgSO4; pH 7,4; 300 mOsm/L; temperatura ambiente) para parar o sangramento. Ao abrir o crânio, aplica um buffer de córtex para manter a superfície do cérebro húmido.
- Remova qualquer buffer e o sangue da superfície dural usando uma esponja gelatinosa. Aplica dicas uma fina camada de 1,0% de agarose de baixo ponto de fusão (dissolvido em tampão de córtex) usando amarelo. Usando uma máquina de bloco de calor, manter a temperatura da solução de agarose a 42° C até o aplicativo.
Nota: A drenagem do buffer e o sangue deve ser realizada do lado da craniotomia enquanto cuida que a esponja de gelatina seca não entra em contacto com a dura-máter. A não observância pode causar danos a dura-máter. - Aplique uma lamela de vidro redonda (n º 1, 3mm de diâmetro) na camada de gel de agarose. Remova todas as bolhas entre a lamínula e a camada de gel de agarose derramando o excesso de gel de agarose entre eles. Remova o excesso de gel salientes debaixo da lamela usando uma pinça (Figura 1 e 1E).
- Fixe a lamela usando cimento dental (Figura 1F).
- Misture o pó de cimento e o líquido do cimento. Aplique a mistura usando pontas amarelas antes que torna-se solidificado. Não aplique cimento dental sobre a dura-máter, porque isso pode danificar o cérebro.
- Anexar um estéril titânio bar (feito, cerca de 30 mg, ver Figura 1) no osso craniano usando cimento dental. Alinhe a barra de titânio e a lamela (na superfície da dura-máter) em paralelo para facilmente capturar imagens.
- Cobrir o crânio exposto com cimento dental (Figura 1 H).
- Recupere o filhote de anestesia. Mantê-lo em um aquecedor (37 ° C) até que o cimento dental tem solidificado (1h).
4. dois fotões de imagem
Nota: As imagens na vivo na Figura 2 foram adquiridas usando um microscópio de dois fotões com um laser de titânio-safira (feixe de diâmetro [1/e2]2: 1,2 mm).
- Defina o comprimento de onda do laser de dois fotões. Para a excitação de RFP, uso 1.000 nm (450 mW/mm2 a 400 µ m de profundidade).
Nota: A potência do laser deve ser reduzida, como o z-posição move para cima. - Limpe a superfície da lamela com etanol a 70%.
- Anestesiar o filhote usando isoflurano (1.5-2.0%) e verificar o nível de anestesia utilizando um teste de cauda-pitada.
- Anexe o filhote para a placa de titânio no palco de imagens usando uma barra de titânio na cabeça do pup (Figura 2A e 2B). Ajuste a cabeça de tal que a lamela é paralela da lente objetiva usando fase goniômetro (Figura 2B). Manter a temperatura corporal do filhote usando uma almofada de aquecimento (37 ° C).
- Defina a concentração de isoflurano para 0,7% - 1,0%.
Nota: Uma concentração de isoflurano muito alta pode causar a morte acidental do filhote durante a imagem latente. - Coloque o palco de imagens sob a lente objetiva (20 X, at 1.0), o microscópio de dois fotões (Figura 2B e 2C).
- Aplique uma gota de água no sentido da lamela. Use o epi-fluorescência para localizar os neurônios rotulado de proteína fluorescentes na área onde foi exposta a dura-máter.
- Adquira imagens de z-pilha em intervalos de 1,4 µm. Para a camada 4 neurônio de imagem, definir o z-width para 150-300 µm a imagem inteira morfologia dendrítica (Figura 2D e 2E). Uso lento digitalização e em média para obter imagens nítidas, mostrando a morfologia neuronal (geralmente leva > 20 min para adquirir a morfologia dendrítica inteira).
Nota: Os parâmetros a seguir são recomendados para tratamento de imagens. Comprimento de onda de excitação: 1.000 nm, scanner: tipo galvanômetro, espelho dicroico: 690 nm, emissão filtro: 575-620 nm bandpass, detector: tipo GaAsP, ganho 100 > configuração, imagem tamanho > 512 x 512 µm, campo de visão > 600 x 600 µm, pixel resolução < 1.2 µm.
5. recuperação e enfermagem
- Desanexe o filhote desde a fase de imagem.
- Coloque o filhote em um aquecedor (37 ° C) e deixe-o recuperar (15 min).
- Alimente o filhote leite morno usando uma micropipeta em intervalos de 2-h e estimular suavemente o estômago para permitir a excreção. Confirme que o filhote está a beber leite, medindo o peso do seu corpo.
6. re-imaging
- Anestesiar o filhote com isoflurano (1.5-2.0%) e verificar o nível de anestesia utilizando um teste de cauda-pitada. Anexá-lo à fase de imagem.
- Localize os imagens anteriormente neurônios e adquirir uma imagem de z-pilha. A identificação de neurônios é fácil devido à sua rotulagem esparsas com Supernova.
- Repita as etapas de 5,1-6,2 até imagem é concluída. Nota: O filhote pode ser fotografado até 18 h sem perder peso.
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Representative Results
Figuras 2D - 2F mostrar resultados representativos da imagem latente de lapso de tempo de dois fotões de neurônios corticais de camada 4 usando o presente protocolo. Para efeitos de análise, selecione os neurônios com morfologia dendrítica claro durante os períodos de imagem. Analisamos a morfologia dendrítica de neurônios imagens usando software de análise morfológica. Reconstrução de morfologia dendrítica representativa é mostrada na Figura 2F. Os neurônios mostrando desconectadas dendrites (Figura 2) devem ser excluídos da análises, porque desconectadas dendrites indicam morte celular induzida por danos durante a cirurgia ou imagem. Além disso, os neurônios com dicas dendríticas turva devem ser excluída (por exemplo, o neurônio com a ponta da seta na Figura 2D).
Figura 1: cirurgia, preparação de janela cranial e fixação da barra de titânio (A), este painel mostra a remoção da pele cobrindo o crânio. (B), este painel mostra a fixação da diferença entre a pele e o crânio. Tenha cuidado para não aplicar o vínculo para a área de imagem. (C) esta é uma imagem da dura-máter exposta. Uma lâmina de barbear foi inserida entre o crânio e a dura-máter e o crânio foi agitou aberto à esquerda da área exposta (seta). O osso pode então ser facilmente removido com fórceps. (D) é um desenho esquemático, mostrando uma visão vertical da janela cranial. O fosso entre o vidro e a dura-máter é preenchido com uma fina camada de gel de agarose. A lamela é fixo ao crânio usando cimento dental. (E), A redondas lamínula é colocada sobre a camada de gel de agarose. (F) esta é uma imagem da lamela protegida. (G), este painel mostra o desenho da barra de titânio. A barra de titânio contém dois furos para fixação à fase de imagem (consulte a Figura 2) e uma parte plana retangular que é ligada à cabeça do filhote. (H), a parte retangular da titanium bar é anexado ao crânio do filhote de cachorro usando cimento dental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: No vivo dois fotões imagem latente dos neurônios corticais em camundongos neonatais. (A), este painel mostra o desenho da placa de titânio. A placa de titânio tem dois furos de parafuso para fixar a barra de titânio e quatro furos de parafuso para anexar a fase goniômetro, que é colocada no palco de imagens. 2.5 mm (em diâmetro) x parafusos de 2 mm (comprimento) são utilizados para fixação. (B) esta é uma imagem representativa do filhote anexado à fase de imagem. A temperatura do corpo do filhote é mantida usando um aquecedor. (C), o filhote é anestesiados com isoflurano durante o na vivo de imagem procedimento. (D), este painel mostra uma imagem representativa do tempo-lapso de Z-pilha de camada 4 neurônios corticais de um filhote de P5. A seta indica o neurônio com dendritos turva, que devem ser retirados da análise. (E), este painel mostra ampliação maior lapso de tempo imagens do neurônio com setas no painel D. Azul de pontas de seta: dicas dendríticas que estão retraídas em pontas de seta h 4,5, amarelo: dendríticas dicas que são alongadas em 4,5 h, pontas de seta brancas pequenas: axônio de uma célula vizinha. (F) este é um modelo 3D do rastreamento de neurônio na figura à esquerda do painel Edendrítica. Círculos azuis indicam a posição do corpo celular. (G) este painel mostra representativos neurônios com dendritos desconectados, não incluídos na análise. Os dados de exemplo em painéis D - G contêm NR1 (uma subunidade essencial de receptor de glutamato do tipo NMDA) - nocauteado - neurônios (por causa de dados limitados disponíveis dos autores). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Passos críticos no protocolo e solução de problemas:
O passo mais importante do protocolo é a remoção do crânio (passo 3.2 do protocolo). Mediante a inserção, a lâmina de barbear frequentemente adere a dura-máter, causando sangramento dural e danos ao cérebro. Isto pode ser evitado adicionando uma gota de buffer de córtex no crânio e removendo o crânio no buffer do córtex.
Sangramento da dura e a pele após preparação janela cranial leva a oclusão da janela. Para evitar isso, o tecido dental e adesivo cimento utilizado deve ser autorizado a completamente seco antes de prosseguir para a próxima etapa. Vários filhotes com uma janela craniana devem ser preparados desde que é difícil evitar completamente o sangramento. Em geral, se a janela craniana permanece claro e estável para o pós-operatório de 2-3 h, o filhote pode ser usado para a imagem latente de lapso de tempo.
Importância do método em relação a métodos existentes/alternativa:
Aqui, descrevemos um método na vivo dois fotões de imagem do córtex neonatal. Este protocolo tem vários méritos em comparação com métodos anteriormente relatados. Estes são listados a seguir.
1) corticais neurônios podem ser escassamente e brilhantemente etiquetados por transfecting vetores de Supernova usando IUE. IUE tem sido amplamente utilizada para a rotulagem de neurônios corticais durante estágios de desenvolvimento. No entanto, um simples IUE é inadequado para a imagem latente de neurônios individuais desde que os neurônios podem ser rotulada como demasiado densamente7,8,9,10. Além disso, usando o sistema de Supernova, vários tipos de proteínas fluorescentes podem ser usados para rotular populações esparsas de neurônios. Por exemplo, usando mediada por Supernova esparsas rotulagem de um indicador de cálcio geneticamente codificado GCaMP13,14, recentemente Efetuamos uma análise funcional dos neurônios individuais na camada de córtex em desenvolvimento 4 (P3 para P13) 15.
2) o método descrito neste estudo é adequado para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes desenvolvimento circuito neuronal. O sistema de Supernova permite escassamente rotulada nocaute de células específicas de qualquer gene. Assim, a dinâmica de um neurônio que contém uma disrupção do gene específico pode ser observada. Para esse efeito, sistemas baseados em genética como MADM16 e17 de SLICK foram anteriormente relatados. No entanto, como a criação de linhas de rato é essencial para esses sistemas, eles exigem muito tempo e o custo do que o protocolo descrito aqui.
3) o presente estudo utiliza uma lâmina de barbear para a remoção do crânio. Isto minimiza o sangramento da dura-máter e permite a abertura de uma vasta área do crânio (< 2 mm de diâmetro). Usando este procedimento, foi possível observar a atividade espontânea da camada 4 neurônios na área dentro do córtex somatossensorial15todo barril grande.
Limitações do método:
Uma desvantagem na vivo por imagens do cérebro neonatal do mouse, em comparação com a imagem dos animais transparentes como zebrafish larvas e girinos de Xenopus , é a menor resolução espacial e temporal. Devagar, digitalização e em média devem ser executadas para produzindo imagens desobstruídas da morfologia neuronal, porque mais luz espalhamento ocorre no cérebro do rato. Espalhamento de luz possivelmente pode ser reduzido usando um laser de comprimento de onda mais longo para excitação de proteína fluorescente e proteínas com comprimentos de emissão de fluorescência.
Uma outra limitação do presente protocolo pode ser que a cirurgia para implantação de janela craniana pode afetar a formação de um circuito cortical normal devido a inflamação de cérebro12. No entanto, há uma grande probabilidade de que na vivo a imagem é mais fisiológica comparado com imagem em vitro como a imagiologia de lapso de tempo de preparação de fatia o cérebro, que também deve dar origem a inflamação grave por isquemia e corte. Também foi relatado que a exposição repetitiva ao isoflurano pode afetar vários processos neuronais18. Experimentos de controle devem ser executados para verificar a adequação dos resultados obtidos pela imagem latente na vivo . No caso da nossa imagem de neurônios da camada 4 no córtex somatossensorial, confirmamos um aumento normal em comprimento total dendrítica e aquisição de viés de orientação de projeções dendríticas de neurônios stellate spiny5,20.
Estudos recentes relataram > 1 - mm-imagem de profundidade em um cérebro de rato adulto no qual a dura-máter foi removida durante a cirurgia,19. Por outro lado, nós fomos capazes de relatório até 400 µm-profundidade de imagem em neonatos5. Desde que a dura-máter não pode ser removida em neonatos e isto, por sua vez, leva a uma dispersão de luz alta, consideramos que a imagem de funda em neonatos é mais desafiador do que em adultos. Melhoria futura sondas fluorescentes, lasers e detectores deve permitir profunda de imagem no cérebro neonatal.
Até então, registramos o lapso de tempo de imagens utilizando o presente protocolo518 horas. Recentemente, temos conseguido na imagem latente de lapso de tempo de 72 horas, melhorando o protocolo20. Vamos continuar a refinar o protocolo aqui apresentado (por exemplo, tempo de longo prazo, mais alto, e/ou imagens de resolução espacial) para revelar mecanismos dinâmicos de desenvolvimento circuito neuronal.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer T. Sato, M. Kanbayashi e S. Kouyama para sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant números JP15K14322 e JP16H06143, a Takeda Science Foundation, Fundação Memorial Uehara e o Collaborative Research projeto de Niigata University cérebro Research Institute 2017-2923 (H.M) e KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 e JP15H04263 e Grant-em investigação científica nas áreas de inovação "Regulamento dinâmico da função cerebral por Scrap & Build System" (JP16H06459) do MEXT (T.I.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
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