Summary
Мы представляем в естественных условиях двух фотонных изображений протокол для визуализации коры головного мозга у новорожденных мышей. Этот метод подходит для анализа динамики развития корковых нейронов, молекулярные механизмы, которые управляют нейрональных динамики и изменения в нейрональных динамика в модели заболеванием.
Abstract
Двух фотонных изображений является мощным инструментом для анализа нейронных цепей в мозге млекопитающих в естественных условиях . Однако ограниченное количество в vivo тепловизионные методы существуют для изучения мозговой ткани живых новорожденных млекопитающих. Здесь мы кратко протокол для визуализации отдельных корковых нейронов в живых новорожденных мышей. Этот протокол включает в себя следующие две методологии: (1) системе Сверхновая для разреженных и яркие маркировки корковых нейронов в развивающийся мозг и (2) хирургическая процедура для хрупких новорожденного череп. Этот протокол позволяет наблюдение временных изменений отдельных корковых невритов новорожденных этапах с высоким соотношением сигнал шум. Приклеенные этикетку клеток конкретных генов и нокаут также могут быть достигнуты путем объединения сверхновой РНК-интерференции и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена систем редактирования. Этот протокол может таким образом, использоваться для анализа динамики развития корковых нейронов, молекулярные механизмы, которые управляют нейрональных динамики и изменения в динамике нейронов в модели заболеванием.
Introduction
Точное проводки нейронных цепей в коре имеет важное значение для высших мозговых функций, включая восприятие, познание и обучения и памяти. Корковых цепи динамически уточняются во время послеродового развития. Исследования изучали процесс корковых цепи формирования с использованием гистологических и в пробирке анализа культуры. Однако динамика формирования цепи в жизни млекопитающих оставалась главным образом неизученными.
Двух Фотон микроскопии широко используется для анализа в vivo нейронных цепей в1,мозг взрослой мыши2. Однако из-за технических проблем, только ограниченное количество исследований рассматривались нейронные цепи формирования у новорожденных мышей. К примеру Каррильо et al. исполнил покадровой съемки восхождения волокна мозжечка в втором послеродовой неделю3. Portera-Кайо et al. сообщили изображений аксоны в коркового слоя 1 в первом послеродовой неделю4. В настоящем исследовании мы суммируем протокол для наблюдения слой 4 корковых нейронов и их дендритов новорожденных мышей. Результаты, полученные путем применения настоящего Протокола, которая включает в себя две методологии, сообщается в нашей недавней публикации5. Во-первых мы используем сверхновой вектор системы5,6 для маркировки отдельных нейронов в головном мозге новорожденных. В системе сверхновой флуоресцентных белков, используется для маркировки нейронов нокдаун гена клеток конкретных сменные и помечены и редактирования/нокаут анализы также возможны. Во-вторых мы описываем хирургическая процедура подготовки черепной окно в хрупких новорожденных мышей. Вместе эти методологии позволяют наблюдения в естественных условиях отдельных нейронов в мозге новорожденных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты следует проводить в соответствии с руководящими животных, установленном учреждением экспериментатора.
1. Подготовка щенков для изображений
Примечание: Щенков с редкой помечены корковых нейронов может быть получено в утробе матери электропорации (МСЭ) сверхновой векторов5,6. Сверхновая система состоит из следующих двух векторов: TRE-КРР и ЦАГ loxP стоп loxP-X Джин-ires-tTA-WPRE. В этой системе разреженные маркировки опирается на TRE утечки. В редкие популяции transfected нейронов TRE диски слабое выражение КРР и tTA. Впоследствии только в этих клетках, экспрессии гена X способствует положительной обратной связи tTA-TRE циклов. Достигнутые разреженных и яркие маркировки позволяет визуализировать морфологических подробности отдельных нейронов в естественных условиях. Подробная информация о процедуре МСЭ не описаны в этот протокол, так как они были описаны других7,8,9,10,11.
- Подготовьте приурочен беременных мышей для МСЭ.
- Приготовляют раствор ДНК для МСЭ. Для разреженных маркировки с ЗП, используйте раствор, содержащий pK031:TRE-Cre (5 нг/мкл) и pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 мкг/мкл) или раствор, содержащий pK031:TRE-Cre (5 нг/мкл) и pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 мкг/мкл).
Примечание: Различных белков может быть выражена в обозначенные нейронов, используя различные комбинации векторов. Кроме того, различных генов может быть постучал вниз или постучал из специально в помеченных клеток5,6 (например, серия векторов для Сверхновая системы доступны, от RIKEN Биоресурс исследовательский центр и Addgene). - Выполнение регулярных МСЭ7,8,9,10,11 маркировать корковых нейронов. Для маркировки слой 4 нейронов, использование эмбриональных день-14 эмбрионов.
- Ждать доставки щенка и роста.
2. хирургия
- Анестезировать послеродовой щенка (P5) день-5, с помощью изофлюрановая газа (1,0%). Выполните тест хвост щепотка, чтобы проверить уровень анестезии. Если щенок отвечает пинча, увеличивают концентрацию изофлюрановая (до 2,0%) или подождать, пока ответ не исчезает. Поддерживать температуру тела щенка во время операции, используя грелку.
- Подкожно вводить анальгетик (carprofen, 5 мг/кг).
- Стерилизуйте щенка кожи охватывающих черепа, вытирая с 70% этанола в три раза.
- Удалите около 20 мм2 кожи, охватывающих черепа с помощью ножниц, стерилизованное с 70% этанола (рис. 1A).
- Удаление фасции черепа с использованием стерилизованные щипцы и чистый, стерильным ватным тампоном (рис. 1A).
- Примените ткань клей с помощью загрузки советы к поверхности кожи резаная чтобы остановить кровотечение. Не применяется ткань клей к области изображения (Рисунок 1B), потому что это делает открытие черепа более трудным.
- Поместите щенка на грелку (37 ° C) и позволить ему оправиться от анестезии. Подождите, пока ткань клей сушеные и затвердело (около 30 мин).
- При необходимости, применять более ткань клей и ждать для того чтобы высушить и затвердеть.
3. черепной окно подготовки
- Анестезировать щенка, с помощью изофлюрановая (1,0-2,0%) и проверьте уровень анестезии хвост щепотка испытание.
- Осторожно откройте черепа с лезвием стерилизованные бритвы, оставляя нетронутыми Дура (1 мм в диаметре) (рис. 1 c). Используйте губку желатин (нарезать на мелкие кусочки, приблизительно < 2 мм3, стерилизованные ножницами и применять их с помощью пинцета) замачивают в коре буфера12 (125 ммоль/Л NaCl, 5 ммоль/Л хлористого калия, глюкозы 10 ммоль/Л, 10 ммоль/Л HEPES, 2 ммоль/Л CaCl2 и 2 ммоль/Л MgSO4; рН 7,4; 300 мОсм/Л; комнатной температуре) чтобы остановить кровотечение. При открытии черепа, применять кору буфер, чтобы сохранить влажные поверхности мозга.
- Удалите любой буфер и кровь из дюраля поверхности губкой желатина. Примените тонким слоем 1,0% агарозном температура плавления (растворяют в буфере коры) с помощью желтого советы. С помощью машины блока тепла, поддерживать температуру агарозы раствора при 42° C до применения.
Примечание: Осушение буфер и крови должны выполняться со стороны краниотомии заботясь что сухого желатина Губка не вступают в контакт с Дура. Неспособность сделать это может повредить Дура. - Круглые стеклянные coverslip (№ 1, 3 мм в диаметре) применять слой геля агарозы. Удалите все пузыри, между coverslip и слой геля агарозы, поливая избыток геля агарозы между ними. Удалите избыток геля, торчащие из-под coverslip, с помощью пинцета (рис. 1 d и 1E).
- Безопасный coverslip с использованием стоматологического цемента (Рисунок 1F).
- Смесь цементного порошка и жидкости цемента. Примените смесь, используя желтый советы, прежде чем он становится затвердело. Не применять стоматологического цемента на Дура, потому что это может повредить мозг.
- Прикрепить стерильных Титан бар (заказ, около 30 мг, см. Рисунок 1 g) на черепные кости с использованием стоматологического цемента. Выравнивание панели титана и coverslip (на поверхности Дура) параллельно с легко захвата изображения.
- Покрытия подвергаются черепа с стоматологического цемента (рис. 1 H).
- Восстановить щенка от анестезии. Держите его на подогреватель (37 ° C) до тех пор, пока стоматологического цемента затвердевшим (1 ч).
4. два фотонных изображений
Примечание: Изображения в естественных условиях в рисунке 2 были приобретены с помощью микроскопа двух фотонов с титан сапфирового лазера (луч диаметром [1/e2]2: 1,2 мм).
- Установка двух Фотон волны. Для ППП возбуждения, использования 1000 Нм (450 МВт/мм2 на 400 мкм глубины).
Примечание: Мощность лазера должны быть сокращены, как z позиция перемещается вверх. - Протрите поверхности coverslip с 70% этиловом спирте.
- Анестезировать щенка, с помощью изофлюрановая (1,5-2,0%) и проверьте уровень анестезии, с помощью теста хвост пинча.
- Прикрепите щенка к пластине титана на стадии обработки изображений с использованием титана бар на голове щенка (рисунок 2A и 2B). Отрегулируйте головы таким образом, что coverslip параллельно с объектива, с помощью гониометра стадии (рис. 2B). Поддержание температуры тела щенка, используя грелку (37 ° C).
- Установите изофлюрановая концентрации 0,7% - 1,0%.
Примечание: Очень высокий изофлюрановая концентрации может привести к случайной смерти щенка во время визуализации. - Место этапа обработки изображений под объектив (20 X, NA 1.0) двух Фотон микроскопа (Рисунок 2B и 2 C).
- Нанесите одну каплю воды на coverslip. Используйте epi флуоресценции для поиска флуоресцентный белок меченых нейронов в районе, где был выставлен Дура.
- Приобрести z стек изображений интервалом 1,4 мкм. Для слоя 4 нейрон imaging, задайте z ширину до 150-300 мкм для изображения всего дендритных морфологии (Рисунок 2D и 2E). Использование медленное сканирование и усреднения для получения четких изображений показаны нейрональных морфологии (обычно это занимает приобрести весь дендритных морфология > 20 мин.).
Примечание: Следующие параметры рекомендуются для обработки изображений. Длина волны возбуждения: 1000 Нм, сканер: тип гальванометра, дихроичное зеркало: 690 нм, фильтр выбросов: 575-620 Нм bandpass, детектор: Хаасп типа, получить настройки > 100, изображения Размер > 512 x 512 мкм, поле зрения > 600 x 600 мкм, мкм < 1.2 пикселей резолюции.
5. восстановление и уход
- Отсоедините щенка от этапа визуализации.
- Поместите щенка на подогреватель (37 ° C) и позволить ему восстановить (15 мин).
- Кормить щенка теплого молока с использованием микропипеткой интервалы 2-h и нежно стимулировать желудок, чтобы позволить экскрецию. Убедитесь, что щенок пьёт молоко, измеряя ее массы тела.
6. Повторное создание образа
- Анестезировать щенка с изофлюрановая (1,5-2,0%) и проверьте уровень анестезии, с помощью теста хвост пинча. Приложите его к стадии обработки изображений.
- Найдите ранее образ нейронов и получить изображение z стека. Идентификация нейронов легко благодаря их разреженные маркировки с сверхновой.
- Повторите шаги 5.1-6.2 до завершения обработки изображений. Примечание: Щенок может быть imaged до 18 ч без потери веса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2D фигуры - 2F представитель результаты двух Фотон покадровой изображений корковых нейронов слоя 4 с использованием настоящего Протокола. Для целей анализа выберите нейронов с четкой дендритных морфологии на протяжении периодов изображений. Мы проанализировали дендритных морфология фотосъемка нейронов использованием морфологического анализа программного обеспечения. Представитель дендритных морфология реконструкции показан на рисунке 2F. Нейроны, показаны отключенных дендритов (рис. 2 g) должны быть исключены из анализа, поскольку отключенный дендритов указывают смерть клетки, индуцированных повреждений во время операции или изображений. Кроме того нейроны размыты дендритных советы должны быть исключены (например, нейрона с стрелки в 2D фигура).
Рисунок 1: хирургия, черепной окно подготовки и вложение титана бара (A) Эта группа показывает удаление кожи, охватывающих черепа. (B) Эта группа показывает Фиксация разрыва между кожей и черепа. Будьте осторожны, чтобы не применять связь в области обработки изображений. (C) это изображение подвергается Дура. Лезвия бритвы был вставлен между черепа и дура, и череп был хлопали открытым слева от области подвергаются (стрелки). Кости можно затем легко удаляется с помощью щипцов. (D) это схематическое дизайн показаны вертикального представления окна черепа. Разрыв между покровным стеклом и дура заполняется с тонким слоем геля агарозы. Coverslip крепится к черепу, с использованием стоматологического цемента. (E) A круглой coverslip помещается на слой геля агарозы. (F) это изображение обеспеченного coverslip. (G) Эта группа показывает дизайн панели титана. Панель титана содержит два отверстия для крепления к стадии обработки изображений (см. Рисунок 2) и один плоский прямоугольный часть, которая крепится к голове щенка. (H) прямоугольная часть Титан бар прилагается к щенка череп с использованием стоматологического цемента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: В естественных условиях двух фотонных изображений корковых нейронов в новорожденных мышей. (A) Эта группа показывает дизайн титановые пластины. Титановые пластины имеет два отверстия для винтов для крепления панели титана и четыре отверстия для винтов для крепления гониометр этапе, который находится на стадии обработки изображений. 2.5 мм (диаметр) x 2 мм (по длине) используются для фиксации. (B) это образ представителя щенка, прилагается к стадии обработки изображений. Щенка тело температура поддерживается с помощью утеплителя. (C) щенка является под наркозом с использованием изофлюрановая в в естественных условиях imaging процедуры. (D) Эта группа показывает представитель Z-стек промежуток времени изображение слоя 4 корковых нейронов P5 щенка. Стрелка указывает нейрона с размытым дендритов, которые должны быть удалены из анализа. (E) Эта группа показывает увеличение покадровой изображения нейрон со стрелками на панели D. Голубые стрелки: Дендритные советы, которые убираются в 4,5 ч, Желтые стрелки: Дендритные советы, которые вытянутые в 4,5 ч, небольшие белые стрелки: аксона соседние ячейки. (F) это 3-D модель дендритных трассировки нейрона на левом рисунке группы Е. Синие круги показывают положение тела клетки. (G) Эта группа показывает представитель нейронов с отключенным дендритов, которые не включены в анализ. Образец данных в панели D - G содержат NR1 (основные Субблок рецептор глутамата NMDA-тип) - нокаут - нейронов (из-за ограниченных данных от авторов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшие шаги в протоколе и устранения неполадок:
Наиболее важным этапом протокола является удаление черепа (протокол шаг 3.2). После вставки лезвие бритвы часто придерживается Дура, вызывая дурального кровотечение и повреждение головного мозга. Этого можно избежать путем добавления капли буфера коры на черепе и удаления черепа в буфере коры.
Кровотечение из Дура и кожи после подготовки черепной окна приводит к окклюзии окна. Чтобы избежать этого, ткань клей и стоматологического цемента используется должно быть позволено полностью сухой, прежде чем перейти к следующему шагу. Несколько щенков с черепной окна должны быть подготовлены так, как это трудно полностью избежать кровотечения. В общем если окно черепной остается четкой и стабильной для 2-3 ч после операции, щенок может использоваться для покадровой изображений.
Значение метода в отношении существующих/альтернативные методы:
Здесь мы описали метод в естественных условиях двух фотонных изображений неонатальной коры. Этот протокол имеет несколько преимуществ по сравнению с методами, о которых сообщалось ранее. Они перечислены ниже.
1) корковых нейронов может быть малонаселенных и ярко помечены transfecting сверхновой векторов с использованием МСЭ. МСЭ был широко используется для маркировки корковых нейронов при разработке этапов. Однако простой МСЭ непригодна для визуализации отдельных нейронов, так как нейроны могут быть помечены слишком плотно7,8,9,10. Кроме того с помощью системы сверхновой, различные типы флуоресцентных белков может использоваться для маркировки разреженные популяций нейронов. Например, используя сверхновой опосредованной разреженные маркировки генетически закодированный кальция индикатора GCaMP13,14, мы недавно провели функциональный анализ отдельных нейронов в развивающихся коры слой 4 (P3 P13) 15.
2) метод, описанный в настоящем исследовании подходит для Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе развития нейронов цепи. Сверхновая система позволяет малонаселенных помеченных клеток конкретных нокаут любого гена. Таким образом прослеживается динамика нейрон, содержащие нарушения конкретных генов. Для этой цели на основе генетики систем, таких как MADM16 и пятно17 ранее сообщалось. Однако поскольку разведение мыши линии имеет важное значение для этих систем, они требуют много времени и затрат, чем протокол, описанных здесь.
3) это исследование использует лезвие для удаления черепа. Это минимизирует кровотечение из Дура и позволяет открытие широкую область черепа (< 2 мм в диаметре). С помощью этой процедуры, можно было наблюдать спонтанной активности слоя 4 нейронов в районе всю большую бочку в соматосенсорной коры15.
Ограничения метода:
Недостаток в vivo томографии головного мозга новорожденных мыши, по сравнению с работой с образами прозрачный животных, таких как данио рерио личинок и Xenopus головастиками — Нижняя пространственного и временного разрешения. Медленное сканирование и усреднения должны выполняться для уступая четкие изображения нейрональных морфологии, потому что более светорассеивающих происходит в мозге мыши. Рассеяние света возможно может быть уменьшена с помощью больше длины волны лазера для возбуждения флуоресцентных белков и белки с больше флуоресценции выбросов длин волн.
Еще одно ограничение настоящего Протокола может быть, что операция имплантации черепной окно может повлиять на формирование нормальных корковых цепи из-за воспаления мозга12. Однако существует высокая вероятность того, что в естественных условиях изображений является более физиологических по сравнению с работой с образами в vitro как промежуток времени визуализации мозга фрагмент подготовки, которая должна также привести к тяжелое воспаление ишемии и нарезки. Он также сообщил, что повторяющиеся воздействия изофлюрановая могут влиять на несколько нейрональные процессы18. Для проверки адекватности результатов, полученных в vivo изображений следует эксперименты контроля. В случае нашего изображения слой 4 нейронов соматосенсорной коры, мы подтвердили нормальное увеличение общей длины дендритных и приобретение смещения ориентации дендритных прогнозов колючий севрюга нейронов5,20.
Недавние исследования сообщили > 1 мм-Глубина изображения в мозге взрослого мышь, которой Дура был удален во время операции19. С другой стороны мы были в состоянии сообщить до 400-мкм Глубина изображения в5новорожденных. Так как Дура не могут быть удалены в новорожденных и это, в свою очередь, приводит к высокой рассеяния света, мы считаем, что глубокие изображений у новорожденных является более сложной, чем у взрослых. Дальнейшее улучшение в флуоресцентных зондов и лазеры, детекторы должны позволить глубоких изображений в неонатальная мозги.
До настоящего времени мы сообщили 18-часовое покадровой изображений, используя настоящий протокол5. Недавно мы добились успеха в 72-часовой промежуток времени изображений путем улучшения протокола20. Мы будем продолжать уточнить протокол представленные здесь (например, долгосрочные, больше времени, или пространственное разрешение) для выявления динамических механизмов нейронов цепи развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят т. Сато, м. Kanbayashi и S. Kouyama за их технической помощи. Эта работа была поддержана JSP-страницы KAKENHI Грант номера JP15K14322 и JP16H06143, научный фонд Такэда, Уэхара Мемориальный фонд и проект совместных исследований Ниигата университета мозга исследовательский институт 2017-2923 (H.M.) и по KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 и JP15H04263 и Грант в научных исследований в области инноваций «Динамическое регулирование функции мозга на металлолом и построения системы» (JP16H06459) от МПКСНТ (T.I.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pK031. TRE-Cre | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | - | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | - | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | - | |
| Titanium bar | Authors | - | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | - | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | - | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
