Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

استزراع والتلاعب بالخلايا Crest العصبي O9-1

Published: October 9, 2018 doi: 10.3791/58346
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California

ERRATUM NOTICE

Summary

O9--1 خط خلية crest العصبي ماوس مولتيبوتينت. هنا يمكننا وصف بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة لاستزراع خلايا O9--1، والتفريق بين الخلايا O9-1 في أنواع محددة من الخلايا والتلاعب وراثيا O9-1 الخلايا باستخدام siRNA بوساطة ضربة قاضية أو تحرير الجينوم كريسبر-Cas9.

Abstract

وتهاجر الخلايا العصبية كريست (الصافية) الخلايا الجذعية البالغة multipotent التي يمكن أن تفرق في أنواع مختلفة من الخلايا وتؤدي إلى العديد من الأنسجة والأعضاء. خط الخلية O9-1 مشتق من الذاتية الفأر الجنينية البلدان المتبرعة الصافية ويحافظ على مولتيبوتينسي. بيد أن ظروف ثقافة معينة، خلايا O9-1 يمكن أن تفرق في أنواع مختلفة من الخلايا وأن تستخدم في طائفة واسعة من التطبيقات البحثية. في الآونة الأخيرة، مع الجمع بين الدراسات الماوس وخلية O9--1، أننا أظهرنا أن فرس النهر مما يشير إلى مسار المستجيبة ياب وطاز تلعب أدواراً هامة في التنمية الجمجمة المستمدة من قمة العصبية. على الرغم من أن عملية تثقيف للخلايا O9-1 أكثر تعقيداً من التي تستخدم لخطوط الخلايا الأخرى، خط الخلية O9-1 نموذج قوية للتحقيق في البلدان المتبرعة الصافية في المختبر. نقدم هنا، على بروتوكول لاستزراع خط الخلية O9-1 المحافظة على ستيمنيس، فضلا عن البروتوكولات للتفريق بين الخلايا O9-1 إلى أنواع الخلايا المختلفة، مثل خلايا العضلات الملساء وخلايا الاوستيوبلاستس. وبالإضافة إلى ذلك، يرد وصف بروتوكولات لإجراء دراسات فقدان لوظيفة الجينات في الخلايا O9-1 باستخدام الحذف كريسبر-Cas9 وضربه قاضية بوساطة الرنا التدخل الصغيرة.

Introduction

الخلايا العصبية كريست (الصافية) هي الخلايا الجذعية مثل multipotent مع قدرة المهاجرة رائعة ووجود عابر أثناء التطور الجنيني. البلدان المتبرعة الصافية تنشأ بين الأديم الظاهر السطحي والانبوب العصبي وتهاجر إلى مناطق أخرى للجنين أثناء التطور الجنيني1. استناداً إلى تلك المجالات الوظيفية، ويمكن تصنيف البلدان المتبرعة الصافية إلى عدة أنواع مختلفة، بما في ذلك الجمجمة والجذع، تحفيزه، وعجزي، والقلب البلدان المتبرعة الصافية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن البلدان المتبرعة الصافية تفرق في الأنساب خلية متعددة، مثل خلايا العضلات الملساء، وخلايا العظام، والخلايا العصبية، وتؤدي إلى مختلف الأنسجة2،3. تنمية البلدان المتبرعة الصافية يتسم بسلسلة معقدة من الأحداث مورفوجينيتيك التي يتم ضبطها بالإشارات الجزيئية المختلفة. نظراً لتنظيم معقد من البلدان المتبرعة الصافية ومساهماتها الهامة لهياكل عديدة، يمكن أن تؤدي التقلبات التنمية NCC عادة إلى العيوب الخلقية عند الولادة، التي تمثل ما يقرب من 30 في المائة من جميع العيوب الخلقية الخلقية البشرية. تشوهات أثناء تطوير crest العصبي يمكن أن يؤدي إلى شق الشفة/الحنك، معيبة بعيوب تشكيل الآنف، المتلازمات، مثل تدفق القلب المعيبة المسالك أو وفيات الرضع حتى1،،من45، 6 , 7-فهم الآليات الجزيئية للتنمية NCC مهم لتطوير علاجات للأمراض الناجمة عن عيوب في تنمية البلدان المتبرعة الصافية. مع استخدام مختلف في المختبر و في فيفو النهج8،،من910،11،،من1213،14 15من ،، وقد تم إحراز تقدم كبير في لجنة التنسيق الوطنية للبحث. في فيفو، نماذج حيوانية، بما في ذلك الدواجن والبرمائيات، الزرد، والفئران، قد استخدمت للتحقيق في البلدان المتبرعة الصافية1. وعلاوة على ذلك، استخدمت الأجنة البشرية لدراسة عملية الهجرة الصافية في التنمية الجنين البشري المبكر16. في المختبر، نماذج الخلية للبلدان المتبرعة الصافية، مثل البلدان المتبرعة الصافية البشرية التي نشأت من الدهون تحت الجلد المريض، قد استخدمت للتحقيق في مرض باركنسون17. الخط NCC O9--1، والتي استمدت أصلاً من الثقافات الجماعية من البلدان المتبرعة الصافية الذاتية معزولة عن E8.5 الماوس الأجنة18، نموذج خلية قوية لدراسة البلدان المتبرعة الصافية. الأهم من ذلك، تحت ظروف ثقافة عدم التمييز، وخلايا O9-1 مولتيبوتينت الشبيهة الجذعية البلدان المتبرعة الصافية. ومع ذلك، تحت ظروف الثقافة المختلفة، الخلايا O9-1 يمكن أن تكون متباينة في أنواع الخلايا المتميزة، مثل خلايا العضلات الملساء وخلايا الاوستيوبلاستس، تشوندروسيتيس، والخلايا الدبقية18. ونظرا لهذه الخصائص، خلايا O9-1 على نطاق واسع استخدمت الدراسات المتصلة بالبلدان المتبرعة الصافية، مثل التحقيق في الآلية الجزيئية لعيوب الجمجمة الوجه19،20.

وترد هنا، بروتوكولات مفصلة للحفاظ على الخلايا O9-1 والتفريق بين الخلايا O9-1 إلى أنواع مختلفة من الخلايا، والتلاعب الخلايا O9-1 عن طريق إجراء دراسات فقدان لوظيفة الجينات مع تحرير الجينوم كريسبر-Cas9 والحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA)- بوساطة تقنيات ضربة قاضية. وكمثال ممثل، هو وصف استخدام الخلايا O9-1 دراسة ياب و طاز الخسارة-من-وظيفة. ياب وطاز هي المصب المستجيبة لفرس النهر مما يشير إلى المسار، الذي يلعب دوراً حاسما في انتشار الخلايا، والتمايز، والمبرمج. كما تبين في مسار فرس النهر لتكون هامة في التنمية والتوازن عدة من مختلف الأنسجة والأعضاء، وكذلك في الآلية المرضية لأمراض مختلفة20،،من2122،23 ،،من2425،26،،من2728. تتضمن العناصر الأساسية لفرس النهر مما يشير إلى مؤنزم 20-مثل العقيمة ورم القامع Mst1/2 وبروتين سقالة السلفادور التي تحتوي على المجال WW مؤنزم homolog (Lats1/2) القامع الورم كبير. فرس النهر مما يشير إلى يحول دون نشاط ياب وطاز، وتروج عن التدهور في السيتوبلازم. دون القمع من فرس النهر، يمكن أن ترانسلوكاتي إلى نويات ياب وطاز وتعمل كوسائل تفعيل المشارك النسخي. ونحن مؤخرا أظهرت أن يخمد تحديداً فرس النهر إشارات المستجيبة ياب وطاز في الماوس البلدان المتبرعة الصافية باستخدام Wnt1لجنة المساواة العرقية والسائقين Wnt1Cre2SOR أسفرت عن الفتك الجنينية في E10.5 مع شديد 20من عيوب الجمجمة. ونحن أيضا بإجراء دراسات باستخدام خلايا O9-1 للتحقيق في دور ياب وطاز في البلدان المتبرعة الصافية. دراسة دالة ياب وطاز في انتشار NCC والتمايز و ياب وضربه قاضية طاز خلايا تم إنشاؤها في الخلايا O9-1 باستخدام siRNA، وخلايا خروج المغلوب ياب تم إنشاؤها بواسطة استخدام تحرير الجينوم كريسبر-Cas9. يمكن تطبيق نفس الاستراتيجيات فقدان لوظيفة الجينات على الجينات المستهدفة المختلفة في مسارات أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق مكسب للدالة دراسات وفحوصات تعداء الخلايا O9-1 لدراسة وظيفة الجينات والتنظيم. البروتوكولات المذكورة هنا تهدف إلى استخدام المحققين كأدلة لاستزراع خلايا O9-1 المحافظة على ستيمنيس مولتيبوتينت، لتمييز الخلايا O9-1 إلى أنواع أخرى من الخلايا تحت ظروف مختلفة من الثقافة، ودراسة وظيفة الجينات و الآليات الجزيئية للبلدان المتبرعة الصافية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد قبل زراعة الخلايا O9-1

ملاحظة: القاعدية الوسائط المستخدمة لزراعة الخلايا O9-1 يجب أن يكون قد تكيف ب Sandos فطري الفئران ثيوجوانيني/واباين-مقاومة (ستو) الماوس تنتجها الخلايا الليفية الخلايا؛ ولذلك، تحتاج خلايا ستو الحصول عليها وإعدادها كما هو موضح أدناه قبل البدء في زراعة الخلايا O9-1.

  1. ستو الخلية النشطة والثقافة
    1. إعداد الوسائط لاستزراع الخلايا ستو النشطة بجعل كاملة دولبيكو تعديل النسور (دميم) مع 7% مصل بقرى الجنين (FBS) (الخلايا الجذعية الجنينية ثقافة الصف)، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، ومم 2 لتر-الجلوتامين (تركيزات النهائي يتم الإشارة إلى).
      ملاحظة: يتم استخدام متوسط ستو لزراعة الخلايا المغذية ستو النشطة. البنسلين، ستربتوميسين، ولام الجلوتامين قد تشكل هطول الأمطار في التخزين؛ حل تماما قبل بيبيتينج قبل الاستخدام.
    2. معطف صفيحة ثقافة خلية قياسي 100 ملم مع الجيلاتين 0.1% لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد فترة الحضانة، نضح الجيلاتين إضافي. استخدم اللوحة فورا بعد الطلاء.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، تغطي اللوحة مع وسائل الإعلام ستو وترك اللوحة في حاضنة هوميديفيد لتجنب تجفيف اللوحة (هذا هو المقصود فقط لتخزين قصيرة الأجل وليس لتخزين لوحات بريكواتيد).
    3. ذوبان الجليد الخلايا ستو سريعاً في حمام مائي 37 درجة مئوية؛ مسح كريوفيال مع الإيثانول 70% قبل الافتتاح، ونقل فورا القنينة كاملة من الخلايا إلى أنبوب الطرد مركزي.
    4. إضافة وسائط الإعلام ستو dropwise إلى أنبوب الطرد المركزي؛ النسبة من حجم الخلايا لوسائل الإعلام 01:10.
    5. الطرد المركزي الخلايا في 180 x ز لمدة 3 دقائق في الرايت
    6. مزيج من الخلايا بيبيتينج ونقل لطيف للوحة المغلفة بالجيلاتين.
    7. السماح للخلايا ستو تنمو على 24 ساعة في حاضنة قياسية (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2).
    8. تغيير المتوسطة (إلا بعد الانضمام الخلايا) 24 ساعة بعد البذر وتجاهل المتوسطة القديمة.
    9. فحص خلايا ستو كل يوم تحت المجهر والمرور في كونفلوينسي 80%.
      1. قبل البدء باساجينج خلية ستو، معطف لوحات مع الجيلاتين 0.1% (حجم الجيلاتين يساوي نصف حجم وسائط النمو لتلك السفينة) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      2. لمرور الخلايا ستو، نضح وسائط النمو وتغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرتين (إضافة برنامج تلفزيوني في وحدة تخزين متساوية من وسائط النمو).
      3. نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 0.25% التربسين-يدتا (ضبط حجم وفقا لحجم السفينة)؛ ثم احتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
        ملاحظة: للوحة 100 مم، استخدام 10 مل وسائط النمو و 3 مل من محلول التربسين. لوحة 150 مم، استخدام 20 مل وسائط النمو و 8 مل من محلول التربسين. حجم المخزن المؤقت الغسيل المستخدمة مساوية لحجم نمو وسائل الإعلام.
      4. إلغاء تنشيط التربسين مع تساوي حجم الوسائط ستو. بذور ستو الخلايا للوحات الجديدة بنسبة 1:3 إلى 01:10.
        ملاحظة: مخطط توسيع مشترك توسيع من كريوفيال واحد في لوح 100 مليمتر واحد، ثم إلى 150 مم لوح واحد، ثم إلى أربع لوحات 150 مم، وأخيراً إلى 16 مم 150 لوحات.
  2. المنظمة وتجميد الخلايا ستو
    1. لإعداد 2 × تجميد وسائل الإعلام، أضف التالي إلى وسائل الإعلام ستو (يتم الإشارة إلى تركيزات النهائي): 20% FBS، 20% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]).
    2. بعد خلط، تصفية تعقيم 2 × تجميد وسائل الإعلام (المسامية الحجم 0.22 ميكرومتر) وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. جعل 2 x تجميد وسائل الإعلام في نفس اليوم من استخدام وتجاهل وسائل الإعلام تجميد غير المستخدمة.
    3. إعداد حل mitomycin C في برنامج تلفزيوني في تركيز من 0.5 ملغ/مل. حل mitomycin C في برنامج تلفزيوني، الشريط الزجاجة على فورتيكسير ودوامه في انخفاض إعداد لما يقرب من 45 دقيقة إلى حل الجزيئات تماما.
      ملاحظة: هو ضوء ميتوميسين ج حساسة ومن الصعب حل.
      تنبيه: ميتوميسين ج حادة السمية وقد يسبب السرطان. التعامل فقط مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    4. إلغاء تنشيط الخلايا ستو بإضافة تركيز 0.01 ملغ/مل ميتوميسين ج نهائي لوسائط الإعلام القائمة. احتضانها ح 2 داخل حاضنة قياسية (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2).
    5. غسل الأطباق (150 مم) مع 20 مل برنامج تلفزيوني مرتين بعد المنظمة مع ميتوميسين جيم
    6. نضح الحل برنامج تلفزيوني، وفصل الخلايا باستخدام 8 مل من 0.25% التربسين-يدتا، واحتضان لمدة 5 دقائق داخل حاضنة هوميديفيد قياسية (37 درجة مئوية، 5% CO2).
    7. إلغاء تنشيط التربسين مع 8 مل الإعلام ستو.
    8. نقل الحل خلية إلى أنبوب الطرد مركزي. الجمع بين أكثر من لوحة في أنبوب الطرد المركزي واحد توفيرا للوقت. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 180 x ز.
    9. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل برنامج تلفزيوني.
    10. استخدام 10 ميليلتر من الحل خلية لعد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. عد الخلايا في ساحة الشبكية المركزية ومضاعفة عدد التي حصل عليها 104 لتحديد عدد الخلايا في 1 مل. عد مرتين ومتوسط الرقمين للحصول على تقدير نهائي لعدد الخلايا في المليلتر.
    11. الطرد المركزي خلايا لمدة 5 دقائق في 180 x ز.
    12. نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 1:1 (من حيث الحجم) ستو وسائل الإعلام و 2 x تجميد بيليه الخلية. ضبط حجم الصوت لتركيز خلية الأخيرة من 4 × 106 خلية/مل (هذا المبلغ جيد للوح واحد 100 ملم).
      ملاحظة: على سبيل المثال، من أربعة ألواح 150 ملم الغلة ما مجموعة 60 × 106 خلايا، تجميد 4 × 106 خلايا كل كريوفيال، مع كل كريوفيال التي تحتوي على 1 مل من محلول الخلية. أربعة ألواح تسفر عن حوالي 15 كريوفيالس (60/4 = 15). إضافة 7.5 مل من الوسائط ستو و 7.5 مل من 2 × تجميد وسائل الإعلام إلى الخلية بيليه، ريسوسبيند، وقاسمه 1 مل في كل كريوفيال.
    13. ريسوسبيند التي بيبيتينج وسائل الإعلام تجميد مع بيليه الخلية ببطء. نقل 1 مل من محلول الخلية بكل كريوفيال وقم بتسمية تبعاً لذلك.
    14. ضع كريوفيالس داخل غطاء مربع البوليستيرين (وهذا يوفر معدل تبريد بطيئا، مما يحسن من بقاء الخلية). نقل المربع لثلاجة-80 درجة مئوية على الأقل 24 ساعة قبل نقل كريوفيال إلى النتروجين السائل.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، التقليل إلى أدنى حد الخلية عد الوقت، فضلا عن الوقت بين إضافة 2 x وسائط التجميد إلى الخلايا ونقل القوارير إلى-80 درجة مئوية.

2-ثقافة الخلية O9-1

  1. تحضير الوسائط القاعدية لثقافة الخلية O9-1 بإضافة ما يلي في دميم (يتم الإشارة إلى تركيزات النهائي): 15% FBS، البنسلين يو/مليلتر 100، 100 يو/مليلتر، ملم 55 بيتا-mercaptoethanol مم 0.1 الوسائط الأساسية الدنيا (MEM) الأحماض الأمينية غير الأساسية، بيروفات صوديوم 1 مم ستربتوميسين، 2 مم ل الجلوتامين، 10 وحدة/مل3 اللوكيميا العوامل المثبطة (LIF؛ إضافة فورا قبل الاستخدام، لا تقم بإضافة إلى زجاجة الأسهم)، وأساسية-عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية نانوغرام/مل 25 (بفجف؛ إضافة فورا قبل الاستخدام، لا تقم بإضافة إلى زجاجة الأسهم).
  2. فلتر تعقيم وسائل الإعلام القاعدي (المسامية الحجم 0.22 ميكرومتر) والتفاف في إحباط لحماية من الضوء.
  3. تجمع الوسائط القاعدية مكيفة من المعطل ستو الخلايا.
    ملاحظة: المضي قدما إلا بعد الحصول على خلايا ستو المعطل. O9--1 القاعدية التي جمعت من ألواح الخلية ستو وسائل الإعلام هو يشار مكيفة وسائل الإعلام القاعدية.
    1. ذوبان غير نشط خلايا ستو سريعاً كما هو موضح أعلاه (كريوفيال واحد يحتوي على 4 × 106 خلايا جيدة للوح 100 مليمتر واحد وينتج حوالي 100 مل مكيفة وسائل الإعلام القاعدية بعد 10 أيام جمع). إبطال بذور الخلايا ستو إلى لوحة المغلفة بالجيلاتين باستخدام وسائط ستو. السماح بإرفاق بين عشية وضحاها في حاضنة هوميديفيد قياسية (37 درجة مئوية، 5% CO2) الخلايا.
    2. 24 ساعة بعد ذوبان الخلايا ستو، تجاهل وسائل الإعلام ستو الموجودة واستبدال مع وسائط الإعلام القاعدية.
      ملاحظة: لا تقم بإضافة ليف وبفجف إلى المعطل ستو خلية ثقافة الأطباق؛ إضافة إلى O9-1 خلية ثقافة الأطباق فقط.
    3. تغيير الوسائط باستخدام وسائط القاعدية O9-1 كل 24 ساعة، وجمع وسائل الإعلام القاعدي من ألواح الخلية ستو في زجاجة. التفاف زجاجة تحتوي على وسائط الإعلام القاعدي مكيفة في إحباط لحماية من الضوء. تخزين كافة الوسائط التي تم جمعها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لأنه تم إلغاء تنشيطه الخلايا، قد لا يظهر بصحة جيدة كما فعلوا بعد عدة أيام من جمع؛ وهذا ما يمكن توقعه.
    4. بشكل اختياري للتحقق من وجود تلوث، جمع وسائل الإعلام القاعدي لكل يوم جمع في أنابيب مختلفة (بدلاً من زجاجة واحدة) ملفوفة في إحباط. باستخدام لوحة 24-حسنا، ضع 1 مل من وسائل الإعلام من كل يوم في كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة قياسية للتحقق من التلوث البكتيري تحت المجهر.
      ملاحظة: وسائط الإعلام يبقى لون أحمر إذا لم يكن هناك لا تلوث ولكن التغييرات الأصفر إذا كانت موجودة بالتلوث البكتيري.
    5. بعد جمع مكيفة وسائل الإعلام القاعدية لمدة 10 أيام، تجاهل الخلايا ستو. الجمع (إذا كان قابلاً للتطبيق) كل تجمع وسائط القاعدية الشرطي وتصفية تعقيم (المسامية الحجم 0.22 ميكرومتر) في زجاجة معقمة. لف الزجاجة في إحباط لحماية من الضوء. الحفاظ على وسائل الإعلام القاعدي المكيفة التي تمت تصفيتها في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها شهر واحد من تاريخ التصفية.

3-الحفاظ على الخلايا O9-1

ملاحظة: يعمل الإعلام القاعدي O9-1 هو تصفية تعقيم مكيفة وسائل الإعلام القاعدية، والتي ليف (تركيز نهائي 103 وحدات/mL) وتضاف بفجف (التركيز النهائي 25 نانوغرام/ملليلتر) فورا إلى الطبق ثقافة الخلية قبل الاستخدام. هذه الوسائط بحاجة إلى الحماية من الضوء والمخزنة في 4 درجات مئوية.

  1. استرداد خلايا O9-1
    1. ببطء الذوبان زجاجة الأسهم من المصفوفة الغشاء (مثلاً، ماتريجيل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تحضير مختبرين.
    2. إضافة 5 مل دميم مع 10% FBS إلى 5 مل الغشاء مصفوفة الغشاء الأسهم. مزيج جيد من قبل بيبيتينج مع نصائح ماصة الباردة المخزنة في-20 درجة مئوية. تبقى هذه الأنابيب زجاجة وقاسمه الأصلي على الجليد. تجميد مختبرين في أحجام مختلفة (0.5 مل أو 1 مل مختبرين) اعتماداً على احتياجات التجربة. تجنب ذوبان تجميد مصفوفة الغشاء عدة مرات.
      ملاحظة: مصفوفة الغشاء بوليميريزيس سريعاً في درجة حرارة الغرفة؛ استخدام تلميحات ماصة الباردة وإبقاء الأنابيب الباردة عندما تعمل على تلافي البلمرة غير مقصود.
    3. ذوبان الجليد قاسمة مصفوفة الغشاء عند 4 درجة مئوية أو على الجليد ح 2 قبل البدء في التجربة. لا تقم بتخزين المصفوفة في 4 درجات مئوية لفترة طويلة.
    4. استخدام عامل تصفية تعقيم دميم مع 10% FBS تمييع المصفوفة الغشاء إلى تركيز 0.5 ملغ/مل معطف اللوحات نهائي. لوحات معطف مع المصفوفة الغشاء (0.5 ملغ/مل) في درجة حرارة الغرفة حاء 1 التأكد من أنها تغطي كامل اللوحة (كما هو موضح في الشكل 1).
    5. إمالة اللوحة عند يسفط المصفوفة غشاء الطابق السفلي لتجنب لمس السطح المطلي؛ لوحات الجافة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لا جاف الإفراط لوحات المغلفة.
      ملاحظة: تابع فقط عندما جميع وسائل الإعلام والمواد الكاشفة على استعداد لاستخدام (مكيفة وسائط الإعلام القاعدية، والعقيمة التي تمت تصفيتها 10% FBS في دميم وليف بفجف).
    6. استعادة الخلايا O9-1 سريعاً عن طريق وضع كريوفيال في حمام مائي 37 درجة مئوية؛ ببطء عباب القنينة حتى الحل الكامل يتحول إلى سائل، والشروع فورا في الخطوة التالية.
    7. نقل جميع الحل خلية من كريوفيال (حوالي 1 مل) إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل. إضافة 5 مجلدات من دميم مع 10% FBS (فلتر تعقيم مع حجم مسام تصفية 0.22 ميكرومتر) وريسوسبيند.
    8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 180 x ز. نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية. ريسوسبيند بيليه الخلية (عن طريق التنصت) في وسائل الإعلام القاعدي مكيفة وتستكمل مع ليف وبفجف. حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
      ملاحظة: وسائل الإعلام القاعدية مكيفة تستكمل مع ليف وبفجف حاسم للحفاظ على مولتيبوتينسي خط خلية O9--1. استخدام الرعاية لإضافة الوسائط الصحيحة لتجنب التفريق الخلية غير مقصود.
    9. خلايا البذور من 10000 إلى 15,000 خلية/سم2 للوحة 6-جيدا. السماح بإرفاق وتنمو في حاضنة ثقافة خلية قياسية (37 درجة مئوية، 5% CO2) الخلايا بين عشية وضحاها قبل تغيير الوسائط.
    10. ضمان أن يتم إرفاق الخلايا قبل الشروع في تغيير الوسائط (الخلايا المرفقة صحية تبدو مثل تلك المبينة في الشكل 2).
    11. دائماً تغيير ثقافة وسائل الإعلام في اليوم التالي بعد استعادة الخلايا O9-1 (استخدام الوسائط القاعدية مكيفة تستكمل مع ليف وبفجف).
  2. مرور الخلايا O9-1
    1. عندما تصل الخلايا O9-1 إلى 80% كونفلوينسي، ذوبان الجليد المصفوفة الغشاء وإعداد لوحة المغلفة بمصفوفة غشاء كما هو موضح أعلاه. إضافة وسائط القاعدية مكيفة تستكمل مع ليف وبفجف إلى السفينة. وبدلاً من ذلك، قم بإضافة دميم دون FBS إبقاء المصفوفة الغشاء من تجفيف وتخزين داخل حاضنة هوميديفيد قياسية لمدة لا تزيد عن 3 أيام.
    2. شطف الآبار المحتوية على O9-1 (6-جيدا لوحة) مع 2 مل من الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) مرتين ولطف "الماصة؛" لتجنب فقدان الخلايا.
    3. فصل الخلايا مع 1 مل من 0.05% التربسين-يدتا في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 3 تحييد التربسين مع مبلغ مساو من دميم مع 10% FBS. مرارا وتكرارا "الماصة؛" السائل على السطح كله من البئر لننأى بالعديد من الخلايا من لوحة قدر الإمكان.
      ملاحظة: يتم تركيز التربسين 0.05% بدلاً من 0.25%. استخدم دببس لتمييع من زجاجة الأسهم.
    4. تجنب توليد فقاعات عند فصل الخلايا من اللوحة.
    5. نقل كل خلية الحل إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 180 x ز. نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية. ريسوسبيند بيليه الخلية في أنبوب الطرد المركزي التي بيبيتينج لطيف في وسائل الإعلام القاعدي مكيفة وتستكمل مع ليف وبفجف.
    6. استخدام هيموسيتوميتير لحساب عدد الخلايا الإجمالي كما هو موضح أعلاه. خلايا البذور (10,000 إلى 15,000 الخلايا/سم2) للوحة المغلفة إعداد كما هو موضح في الخطوات 3.1.4 إلى 3.1.8. بئر واحدة للوحة 6-جيدا سيتطلب 100,000 الخلايا للبذور.
    7. السماح للخلايا بإرفاق وتنمو في حاضنة ثقافة خلية قياسية (37 درجة مئوية، 5% CO2). دائماً تغيير ثقافة وسائل الإعلام في اليوم التالي بعد باساجينج O9-1 الخلايا.
  3. تجميد الخلايا O9-1
    1. لإعداد 2 × تجميد وسائل الإعلام للخلايا O9--1، تضعف ما يلي في دميم (يتم الإشارة إلى تركيزات النهائي): 40% FBS و 20% [دمس].
    2. فلتر تعقيم 2 × تجميد وسائل الإعلام وإبقائه في 4 درجات مئوية. 2 × تجميد وسائل الإعلام يجب أن يتم في اليوم الذي يتم استخدامه. تجاهل كافة وسائل التجميد غير المستخدمة.
      ملاحظة: تجميد الخلايا O9-1 في كونفلوينسي 80%.
    3. شطف الآبار مع دببس مرتين؛ ماصة برفق لتجنب فقدان الخلايا.
    4. فصل الخلايا التي تحتوي على 0.05% التربسين-يدتا في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم تحييد التربسين بمبلغ مساو لنسبة 10% FBS في دميم. مرارا وتكرارا "الماصة؛" السائل على السطح كله من البئر لننأى بالعديد من الخلايا من لوحة قدر الإمكان.
    5. نقل جميع محتويات اللوحة إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 180 x ز. نضح المادة طافية وإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني وريسوسبيند عن طريق التنصت.
    6. استخدام 10 ميليلتر من حل خلية لعد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير النحو المبين أعلاه.
    7. الطرد المركزي حل خلية لمدة 3 دقائق في 180 x ز. نضح المادة طافية وضبط الكمية من وسائل الإعلام القاعدية اللازمة؛ ثم إضافة مبلغ مساو من 2 x التجميد في وسائل الإعلام.
      ملاحظة: يتم تجميد الخلايا بتركيز 1 × 106 خلايا/مل (1 مل كل كريوفيال).
    8. نقل الخلايا إلى كريوفيالس والتسمية تبعاً لذلك. ضع كريوفيالس داخل مربع البوليستيرين غطاء لبطء معدل تبريد في-80 درجة مئوية على الأقل 24 ساعة قبل نقل إلى النتروجين السائل.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، التقليل إلى أدنى حد الخلية عد الوقت والوقت بين إضافة 2 × تجميد وسائل الإعلام ونقل القوارير إلى-80 درجة مئوية.

4-التلاعب بالخلايا O9-1

  1. أداء siRNA ضربة قاضية في الخلايا O9-1
    1. ذوبان الجليد ومعطف صفيحة 24-جيدا مع مصفوفة الغشاء كما هو موضح أعلاه (الخطوات 3.1.4–3.1.8) قبل البدء التجربة. استرداد والبذور O9-1 الخلايا، مما يتيح لها أن تنمو بنسبة 60% إلى 80% كونفلوينسي.
    2. تمييع الدهنية في وسائل الإعلام خالية من المصل وفقا لحجم المناسبة جيدا. تمييع siRNA في وسائل الإعلام الحرة المصل إلى النهائي. إضافة siRNA المخفف الدهنية المخفف في نسبة الذي أوصت به الشركة المصنعة. مزيج جيد من قبل بيبيتينج واحتضان.
      ملاحظة: اتبع دليل الشركة المصنعة على وحدة التخزين المستخدمة والوقت ودرجة الحرارة للحضانة.
    3. إضافة وحدة تخزين مناسبة من مجمع siRNA الدهنية إلى خلايا وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    4. احتضان خلايا ح 24 في حاضنة ثقافة خلية قياسية (37 درجة مئوية، 5% CO2). نفذ الخطوات النهائية كمناسبة (استخراج الحمض النووي الريبي، استخراج البروتينات، تلوين، إلخ.)
      ملاحظة: يمكن أن تختلف مرات ضربة قاضية siRNA وتركيزات اعتماداً على التجربة الفردية.
  2. أداء خروج المغلوب الجينات في الخلايا O9-1 باستخدام تحرير الجينوم كريسبر-Cas9
    ملاحظة: تشير إلى البروتوكول تم نشرها مسبقاً لاستخدام كريسبر-Cas9 في خلايا الثدييات خطوط29. شرط هنا وصف مبسط لتحرير كريسبر-Cas9 الجينوم والخطوات ذات الصلة.
    1. الحصول على تسلسلات سجرنا باستخدام أداة تصميم سجرنا.
    2. اضطر سجرنا إلى pSpCas9 ناقل بروتينات فلورية خضراء (بب) 2-أ-30.
    3. ترانسفيكت O9-1 الخلايا مع الموجه باستخدام بروتوكول ليبوفيكتيون قياسية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    4. احتضان خلايا في حاضنة ثقافة خلية قياسية عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ح 24.
    5. إجراء الفرز fluorescence تنشيط الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) يستند إلى التجارة والنقل/7-عاد. بروتينات فلورية خضراء + خلايا البذور مفردة في لوحات 96-جيدا.
    6. تنمو الخلايا في الحاضنة لمدة 4 يوما إضافيا. تجاهل جميع الآبار التي لديها أكثر من مستعمرة.
    7. إجراء PCR مع الإشعال مصممة للكشف عن الحذف. بعد بكر، تشغيل منتجات PCR على [اغروس] هلام لتقييم حجم الفرقة. التحقق من كفاءة خروج المغلوب يتحقق عن طريق استخدام اديتينجبي كريسبر-Cas9 أداء غربي النشاف (مثال ياب خروج المغلوب النتائج تظهر في الشكل 3).

5. تمايز الخلية O9-1

  1. التفريق بين الخلايا O9-1 إلى خلايا الاوستيوبلاستس
    1. لتحضير الوسائط osteogenic التمايز، تضعف ما يلي في ألفا-الفنزويلية (يتم الإشارة إلى تركيزات النهائي): دكساميثازون 0.1 مم، 100 نانوغرام/مليلتر العظام morphogenetic البروتين 2 (BMP2)، وحمض الأسكوربيك ميكروغرام/مل 50، 10 ملم ب-جليسيروفوسفاتي، 10% FBS، يو 100/مل البنسلين، و 100 مغ/مل والستربتوميسين.
    2. الكشف عن علامة osteoblast، osteocalcin، في خلايا الاوستيوبلاستس المتباينة التي إيمونوستاينينج كما هو موضح في الشكل 4.
      ملاحظة: التمايز Osteogenic يمكن أيضا تقييم باستخدام علامات أخرى من خلايا الاوستيوبلاستس أو مع صبغة الأليزارين الأحمر أو تلطيخ الفوسفاتيز القلوية.
  2. التفريق بين الخلايا O9-1 في تشوندروسيتيس
    1. لتحضير الوسائط التمايز تشوندروسيتي، تضعف ما يلي في ألفا-الفنزويلية (يتم الإشارة إلى تركيزات النهائي): مصل العجل الجنين 5% (FCS)، 1% الأنسولين-ترانسفيرين-السيلنيوم (البحث عن)، 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 ملغ/مل، تحويل 10 نانوغرام/مل عامل النمو بيتا (TGF-b3) وحمض الأسكوربيك 50 ملغ/مل، 10 نانوغرام/مل BMP2، دكساميثازون 0.1 ملم، وبيروفات صوديوم 1 مم.
    2. الأول للثقافة أحادي الطبقة O9-1 الخلايا مع وسائل الإعلام أوستيوجينيك لمدة 3 أيام وثم تريبسينيزي والثقافة كتنسيق ميكروماس في تشوندروسيتي التمييز بين وسائل الإعلام لمدة 7 يوما إضافيا.
    3. تقويم تشوندروجينيك التمايز مع تلطيخ السيان الأزرق أو علامات chondrocytes.
  3. التفريق بين الخلايا O9-1 في خلايا العضلات الملساء
    1. لتحضير الوسائط تمايز خلايا العضلات الملساء، تضعف ما يلي في دميم (يتم الإشارة إلى تركيزات النهائي): 100 البنسلين U/mL، ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل و 10% FBS.
    2. تقويم العضلات الملساء تمايز الخلية مع الفلورة التلوين باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات لخلايا العضلات الملساء، مثل العضلات الملساء أكتين (SMA)، سيظهر كمثال في الشكل 5.
  4. التفريق بين الخلايا O9-1 في الخلايا الدبقية
    1. لتحضير الوسائط تمايز الخلايا الدبقية، تضعف ما يلي في DMEM/F12 (يتم الإشارة إلى تركيزات النهائي): 1 x الملحق B-27، مم 2 لتر-الجلوتامين، 50 نانوغرام/مل BMP2، 100 البنسلين يو/مليلتر، ستربتوميسين 100 ملغ/مل، 50 نانوغرام/مل ليف، و 1% الحرارة إبطال FBS.
    2. تقييم تمايز الخلايا الدبقية بأداء الفلورة تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد علامات الخلية الدبقية مثل البروتين الأحماض الدهنية 7 (FABP7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان هدف تجاربنا ضربة قاضية والضربة القاضية دراسة آثار ياب طاز الخسارة-من-وظيفة وفي الخلايا O9--1. قبل التجارب ضربة قاضية والضربة القاضية، لدينا للتأكد من أن التحضير لوسائط الإعلام القاعدية، وخلايا الثقافة O9-1 كما هو موضح أعلاه (على سبيل المثال، الغشاء مصفوفة الاحتياجات لتغطية لوحة كاملة كما هو مبين في الشكل 1، والخلايا O9-1 استردادها من النتروجين السائل كما هو مبين في الشكل 2). نحن أجرى تجارب ضربة قاضية كما هو موضح أعلاه الذي ياب وطاز كانت في نفس الوقت ترسيتها. وأضيفت كميات متساوية من ياب siRNA و siRNA طاز إلى وحدة التخزين النهائي الذي أوصت به الشركة المصنعة. وأضيف إلى لوحة التحكم، بتساوي حجم siRNA نونتارجيتينج.

ياب-خط الخلية O9-1 فارغة تم إنشاؤها بواسطة حذف إكسون 3 ياب باستخدام تحرير الجينوم كريسبر/Cas9، كما وصف وانغ et al. 20-نحن أجرى تجارب بالضربة القاضية باستخدام Cas9 كريسبر الجينوم التحرير كما هو موضح أعلاه وفي وانغ et al. 20-قمنا باستخدام التسلسل التالي سجرنا، الذي يحف إكسون 3 ياب: 5-كاككجتجاتاكجتججتاتجت-3 '(sgRNA1 إلى الأمام)، 5-آآكاكاتاكككاكجتاتككاك-3' (sgRNA1-عكس)، 5-كاككجاجاتجتكتاتجتاجتجا-3 ' (sgRNA2 إلى الأمام)، 5- 3-آآكتكاكتاكاتاجاككاتكتك (sgRNA2-عكس)

كاكك تمت إضافة إلى حبلا إلى الأمام، وأضيفت AAAC إلى حبلا عكس. ز أضيفت في نهاية 5 'حبلا إلى الأمام نظراً اليغو لم تبدأ مع ز، وتمت إضافة ج 3' نهاية حبلا عكس. خلال الجينوم كريسبر-Cas9 تحرير الخطوات المذكورة أعلاه وفي وانغ et al. 20، كانت الخلايا في وسائل الإعلام القاعدي مكيفة للخلايا O9-1 تستكمل مع ليف وبفجف لتجنب التفريق غير المرغوب فيها. استخدمت كبسولة تفجير PCR التالية للكشف عن الحذف ياب : 5-آآآكاجتكتككاكتاككككت-3 '(إلى الأمام) و 5'-جككاتكاتاجاتككتجاكج-3 ' (العكسية). وموقف سجرناس من قاعدة #7973399 إلى #7974433 على الماوس كروموسوم 9. ويتمثل موقف التمهيدي بكر على الكروموسوم من قاعدة #7973306 إلى #7974478. بعد بكر، ظهرت الفرقة PCR للتقديم ياب مع إكسون 3 حذف كعصابة 138-بي بي على [اغروس] هلام؛ وبدأ ياب البرية من نوع كعصابة 1173-بي بي. تم التحقق من صحة كفاءة ياب بالضربة القاضية باستخدام تحرير الجينوم كريسبر-Cas9 مع النشاف الغربية، كما هو مبين في الشكل 3.

كما هو موضح أعلاه، يمكن استزراع الخلايا O9-1 في الإعلام الذي يحفز التمايز محددة لتعزيز التمايز إلى أنواع معينة من الخلايا. يمكن أن يتم تقييم التمايز باستخدام نهج مختلف، مثل PCR الكمي أو إيمونوستينينج من علامات خلية محددة. ويبين الشكل 4 كمثال، O9-1 الخلايا التي تم مثقف في وسائل الإعلام الذي يحفز osteoblast ومتمايزة إلى خلايا الاوستيوبلاستس، التي تم تقييمها من قبل الخلايا إيمونوستاينينج مع الجسم ضد osteocalcin (Ocn، علامة osteoblast). جنبا إلى جنب مع ضربة قاضية الجينات وخروج المغلوب الخلايا الموصوف أعلاه، O9-1 تجارب يمكن على نطاق واسع استخدام الجينات الدالة الدراسات والتحليلات المظهرية. على سبيل مثال، كلا من نوع البرية و ياب-فارغة O9-1 الخلايا المستزرعة في وسائل الإعلام تمايز خلايا العضلات الملساء وتقييمها من قبل الخلايا إيمونوستينينج مع الأضداد ضد العضلات الملساء أكتين (SMA، علامة خلية العضلات الملساء). معظم الخلايا O9-1 البرية من نوع أدت إلى خلايا العضلات الملساء إيجابية SMA (الشكل 5A)، في حين، ياب-فارغة O9-1 الخلايا لم تفرق في خلايا العضلات الملساء إيجابية SMA (الشكل 5B)، التي أشارت إلى أن ياب يلعب أهمية كبيرة بالنسبة دور في التفريق بين البلدان المتبرعة الصافية في خلايا العضلات الملساء.

Figure 1
رقم 1: ماتريجيل الكامل الذي يغطي صفيحة 35 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: O9-1 الخلايا 24 ساعة بعد الشفاء من النيتروجين السائل- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: بيانات لطخة غربية عرض التقديم الفعال (كو) ياب في الخلايا O9-1 باستخدام تحرير الجينوم كريسبر-Cas9- wt: البرية من نوع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الفلورة تلطيخ osteoblast ماركر osteocalcin (Ocn) تشير إلى أن الخلايا O9-1 تثير الخلايا osteoblast تحت ظروف التمايز أوستيوجينيك. الخلايا كانت ملطخة بجسم Ocn ماركر osteoblast (الأخضر)، وكانت الملون الأنوية مع DAPI (أزرق). تشير الأسهم إلى خلايا Ocn-إيجابية. Osteocalcin (Ocn، علامة osteoblast)؛ DAPI (′، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5- تلوين الفلورة للعضلات الملساء أكتين (SMA) تشير إلى أن ظروف تمايز الخلية العضلات الملساء، معظم البرية من نوع O9-1 خلايا أدت إلى خلايا العضلات الملساء (A)، بينما ياب-فشل فارغة O9-1 الخلايا تفرق في خلايا العضلات الملساء (ب). كانت ملطخة الخلايا بجسم SMA (أحمر)، وكانت الملون الأنوية مع DAPI (أزرق). تشير الأسهم إلى خلايا SMA-إيجابية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لجنة التنسيق الوطنية أحد مساهمين الرئيسيين وتنوعاً لمختلف الأنسجة والأعضاء خلال morphogenesis الجنينية. خط الخلية O9-1 يحافظ على قدرته على التفريق في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ويحاكي في فيفو خصائص البلدان المتبرعة الصافية، يجعلها أداة مفيدة في المختبر لدراسة وظيفة الجينات والتنظيم الجزيئي في البلدان المتبرعة الصافية. قد تتوافق مع حالة مختلفة من الخلايا O9-1 إلى مختلف العصبي كريست ذرية في فيفو، تبعاً لظروف الثقافة من الخلايا O9--1. يمكن الحفاظ على الخلايا O9-1 في حالة multipotent عندما مثقف تحت ظروف ثقافة عدم التفريق، مماثلة لزراعة الخلايا الجذعية العادية. قد تتوافق مع الخلايا O9-1 عدم التفريق إلى بريميجراتوري والمهاجرة multipotent الشبيهة الجذعية البلدان المتبرعة الصافية في فيفو. وعلاوة على ذلك، يمكن التمييز بين الخلايا O9-1 في العديد من أنواع الخلايا المختلفة تحت ظروف محددة التمايز الثقافة، التي هي ميزة هامة لدراسة وظيفة الجينات والتنظيم خلال التفريق بين البلدان المتبرعة الصافية من الجذعية multipotent نوع الخلايا في خلية محددة متمايزة. تمييز الخلايا O9-1 قد تتوافق مع بوستميجراتوري العصبي كريست ذرية في فيفو، الذي يكون مصير خلية مختلفة للتمييز في مختلف أنواع الخلايا. تبعاً للاهتمامات البحثية، ويمكن التلاعب بها خلايا O9-1 ومثقف بشكل مختلف لتكملة الدراسات في فيفو NCC مع نماذج حيوانية.

وهناك طرق مختلفة التعامل مع الخلايا O9-1 لدراسة أحداث لجنة التنسيق الوطنية، بما في ذلك الجينات فقدان للوظيفة والكسب للدالة. وهنا ترد أمثلة في siRNA التي أجريت ضربة قاضية والجينات Cas كريسبر 9 تجارب التحرير في الخلايا O9-1 لفرس النهر ممر المستجيب ياب الدراسات خسارة للدالة20. مع الجمع بين استخدام نموذج ماوس وخلايا O9--1، أوضحت دراستنا ياب يلعب دوراً حاسما في تنظيم انتشار NCC والتمايز في العضلات الملساء خلايا20. كما بينت دراسات أخرى في نماذج مختلفة تبين دور هام ياب في البلدان المتبرعة الصافية. ياب تكون مطلوبة للماوس كريست العصبية العضلية الملساء التمايز31 وتعزيز الإنسان مصير والهجرة الصافية32. وعلاوة على ذلك، أعرب عن ياب خلال التنمية النمو المبكر33. يدعم كفاءة الجينات ضربة قاضية وخروج المغلوب في الخلايا O9--1، جنبا إلى جنب مع توفير الراحة لأداء سائر التقنيات الجزيئية المصب مثل PCR الكمي (qPCR) النشاف، والغربية إيمونوستينينج أن خط الخلية O9-1 ممتازة نموذج لجنة التنسيق الوطنية التي يمكن أن تكون بسهولة التلاعب في المختبر. بالإضافة إلى الدراسات خسارة للدالة التي وصفناها أعلاه و20، مختلف التطبيقات الأخرى من الخلايا O9-1 قد سبق وصف لدراسة الخلايا الصافية. O9-1 يمكن أن تستخدم كبديل فعال للتجارب التي تتطلب كمية كبيرة نسبيا من الأنسجة، مثل إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين التسلسل (الرقائق-seq). ومع ذلك، في فيفو خلية أحداث كثيرة مثل الهجرة الصافية تعتمد على التفاعلات المعقدة بين الأنسجة للأنسجة، حيث مازال من غير الواضح مدى الخلايا O9-1 يمكن أن تحاكي بدقة في فيفو الهجرة الصافية. بسبب القيود المفروضة الدراسات في المختبر مع خلايا O9--1، من المستحسن للتحقق من صحة الملاحظات مع O9-1 الخلايا في الجسم الحي باستخدام نماذج حيوانية.

عند استخدام خط الخلية O9-1 لدراسة البلدان المتبرعة الصافية في المختبر، الحفاظ على مولتيبوتينسي الخلايا خلال الثقافة الروتينية أمر بالغ الأهمية. يمكن اختبار مولتيبوتينسي O9-1 الخلايا في بداية عام الثقافة بتقييم التعبير عن الجينات ماركر NCC مثل AP-2a و Sox9. وبالمثل، يمكن اختبار قدرة تمييز الخلايا O9-1 قبل التفريق منها إلى أنواع معينة من الخلايا. لتجنب التفريق غير المرغوب فيها أثناء روتينية استزراع الخلايا O9--1، الإجراءات التجريبية التي يجب أن يتم بما يتفق مع بروتوكول المحددة الموصوفة هنا. التحضير بعناية لوسائط الإعلام القاعدي مكيفة وجديدة إضافة التركيزات الصحيحة لليف وبفجف ذات أهمية حاسمة للحفاظ على مولتيبوتينسي الخلايا O9--1. وباﻹضافة إلى ذلك، المخطط الزمني التجريبي يحتاج إلى التخطيط بعناية، نظراً لأن استزراع الخلايا O9-1 يتطلب أولاً إعداد الخلايا ستو تغذية غير نشطة وجمع الوسائط القاعدية مكيفة، وهو أمر جيد لمدة شهر واحد فقط. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الطابق السفلي مصفوفة الغشاء مهم للحفاظ على وقف التمييز المحتملة للعضلات والخلايا العصبية السلائف، فضلا عن الوسيطة الخلايا34،،من3536. في سياق البروتوكول الموصوفة هنا، يوفر منبرا للخلايا O9-1 إرفاق مصفوفة الغشاء ويساعد في الحفاظ على التمايز المحتملة. ولذلك، مصفوفة الغشاء هو عامل هام يمكن أن تؤثر على النتائج التجريبية واتساقها عند تكرار. نحن نوصي بإعداد مصفوفة الغشاء تماما وفقا للبروتوكول الوارد وصفها أعلاه، وتجنب عدة دورات تجميد أذاب مصفوفة الغشاء. أيضا، عند استعادة الخلايا O9-1 من الدولة المجمدة للثقافة، عملية نقل الخلايا من النيتروجين السائل إلى حمام مائي 37 درجة مئوية يحتاج إلى القيام به بسرعة، تجنب أي فورتيكسينج خلال العملية بأكملها. وبالإضافة إلى ذلك، يحتاج فرط نمو الخلايا O9-1 أيضا التي ينبغي تجنبها للحفاظ على مولتيبوتينسي الخلايا O9-1. عندما باساجينج الخلايا O9--1، ضمان أن تركيز التربسين هو المخفف إلى 0.05% بدلاً من 0.25 في المائة، وأن تظهر الخلايا نات بشكل صحيح. بيبيتينج مرارا وتكرارا بلطف جداً لتحقيق تعليق خلية واحدة أمر ضروري لتجنب تشكيل الخلايا المجمعة. وبصفة عامة، العملية برمتها من التعامل مع خط الخلية O9-1 يحتاج إلى القيام بذلك بلطف وعناية.

في ملخص، خط الخلية O9-1 أداة مفيدة جداً لدراسة البلدان المتبرعة الصافية في المختبر، لا سيما عندما تستخدم كوسيلة مكملة للدراسات في فيفو الخلايا الصافية. O9-1 مزايا واضحة مثل السهولة التي يمكن الوصول إليها والسهولة يمكن الحصول على أرقام مع الخلية التي تكفي للتجارب. نظراً لقدرات تمايز الخلايا O9--1، لديهم إمكانات كبيرة لاستخدامها في طائفة واسعة من التطبيقات في مختلف المجالات للبحث. يمكن استخدام خلايا O9-1 مريح لتطبيقات مثل المخدرات سريعة الاختبار والفحص، seq رقاقة، الكروماتين ترانسبوساسي موجوداً مع التسلسل الفائق (أتاك-seq) وتسلسل الحمض النووي الريبي (الرنا-Seq)، الجينات مكسب للدالة وفقدان لوظيفة الدراسات، فضلا عن إشارات تنظيم الدراسات. وسيسهل استخدام بروتوكول موحد وكاملة للتعامل مع الخلايا O9-1 إمكانية تكرار نتائج الدراسات التي تستخدم فيها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نيكول ستانسل، دكتوراه، ELS، المنشورات العلمية في معهد القلب تكساس، تقدم الدعم التحريري. ونشكر أيضا مصادر التمويل التالية: "منحة تطوير عالم مركز جمعية القلب الأمريكية الوطنية" (14SDG19840000 إلى وانغ ياء)، "جائزة البحوث لورانس" 2014 من رولانت وبيردون لورانس العظام المرض البرنامج من تكساس (إلى وانغ جيه )، والمعاهد الوطنية للصحة (DE026561 و DE025873 إلى وانغ جي، DE016320، و DE019650 إلى ماكسسون ر.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active STO feeder cells ATCC ATCC CRL-1503 Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
DMEM, high glucose, no glutamine Gibco 11960-044
DMEM, high glucose Hyclone SH30243.01
FBS (fetal bovine serum) Millipore Sigma ES-009-B
Penicillin - streptomycin Gibco 15140-122
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Gelatin from porcine skin Sigma G1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS Genesee Scientific 25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesium Lonza 17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100Xx Gibco 11140-050
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Mitomycin C Roche 10107409001
Matrigel matrix Corning 356234
DMSO (dimethylsulfoxide) Millipore Sigma MX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
Opti-MEM I (1x) Gibco 31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamine Corning 10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA Dharmacon L-041057
ON-TARGETplus Non-targeting Pool Dharmacon D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA Dharmacon L-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
  2. Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
  3. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  4. Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
  5. Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
  6. Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
  7. Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
  8. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
  9. Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
  10. Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
  11. Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
  12. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
  13. Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
  14. Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
  15. Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
  16. Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
  17. Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
  18. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  19. Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
  20. Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
  21. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
  22. Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
  23. Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
  24. Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
  25. Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
  26. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  27. Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
  28. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  29. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
  30. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  31. Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
  32. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
  33. Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
  34. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
  35. Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
  36. Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).

Tags

علم الوراثة، العدد 140، كريسبر، Cas9، O9-1 الخلايا، خروج المغلوب الجينات، الجينات الخلايا العصبية كريست ضربة قاضية،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

استزراع والتلاعب بالخلايا Crest العصبي O9-1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. … More

Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (140), e58346, doi:10.3791/58346 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter