Summary
Meting van insecten ontstaan patronen vereist precisie. Bestaande systemen zijn alleen semi-automatische en steekproef-grootte is beperkt. We hebben behandeld deze kwesties door het ontwerpen van een systeem met behulp van microcontrollers precies meten de tijd van de totstandkoming van grote aantallen opkomende insecten.
Abstract
Bestaande systemen voor het meten van insecten ontstaan patronen hebben beperkingen; zij zijn slechts gedeeltelijk geautomatiseerd en zijn beperkt in het maximum aantal opkomende insecten die ze kunnen detecteren. Met het oog op een nauwkeurige meting van insecten ontstaan, is het noodzakelijk voor systemen semi-automatische en kunnen voor het meten van grote aantallen van opkomende insecten. We deze kwesties aangepakt door het ontwerpen en bouwen van een systeem dat is geautomatiseerd en opkomst van maximaal 1200 insecten kan meten. We bewerkt de bestaande "vallen-bal" systeem met behulp van Arduino microcontrollers verzamelen van gegevens automatiseren en uitbreiden van de grootte van de steekproef via meerdere gegevenskanalen. Meerdere gegevenskanalen zodat de gebruiker kan niet alleen hun steekproefgrootte te verhogen, maar voorziet ook in meerdere behandelingen tegelijkertijd worden uitgevoerd in een enkel experiment. Bovendien, we gemaakt een R-script om automatisch de gegevens visualiseren als een zeepbel complot, terwijl ook het berekenen van de mediane dag en de tijd van opkomst. Het huidige systeem werd ontworpen met behulp van 3D printen, zodat de gebruiker het systeem worden aangepast voor verschillende soorten insecten kunt wijzigen. Het doel van dit protocol is te onderzoeken van belangrijke vragen in chronobiology en stress fysiologie, met behulp van deze nauwkeurige en geautomatiseerde systeem voor het meten van insecten ontstaan patronen.
Introduction
Nauwkeurig meten van de timing van terrestrische insect opkomst in experimentele instellingen is notoir moeilijk en vereist een zekere mate van automatisering. Verschillende mechanismen zijn ontworpen in het verleden, waarin beide een "vallen-bal"-principe, met behulp van dalende ballen en sensoren, of een "bang-box" met behulp van een trechter-type systeem1,2,3. Er zijn twee beperkingen met bestaande ontwerpen: 1) de gegevensverzameling is slechts gedeeltelijk geautomatiseerd, en 2) monstergrootte of het aantal opkomende insecten die kunnen worden ontdekt is beperkt. Deze problemen verminderen de precisie van gegevensverzameling, die belangrijk is aan het bestuderen van de timing van eclosion en/of ontstaan patronen. We deze problemen aangepakt door het ontwerpen van een systeem dat is geautomatiseerd en niet beperkt door de grootte van de steekproef, waardoor de gebruiker beter opkomst ritmes in antwoord op het milieu signalen te visualiseren.
Ons systeem is een verbetering aan het beginsel van vallen-bal, waarvan de meest recente versie infrarood sensoren gebruikt om te ontdekken insect opkomst in stappen van zes minuten2. Ons systeem nog gebruikt infrarood sensoren, maar bevat ook een Arduino microcontroller om vast te leggen van de datum en tijd van elk evenement van de ontstaan tot op de dichtstbijzijnde seconde. Gegevens worden automatisch opgeslagen op een veilige digitale (SD) kaart, die kan worden geëxporteerd als een door lijstscheidingstekens gescheiden bestand voor analyse. De analyse is geautomatiseerd met behulp van een aangepaste R-script, dat zal de gegevens als een zeepbel complot grafiek en identificeren van de mediane tijd en de dag van opkomst.
Meerdere kanalen kunnen gebruikers meer flexibiliteit in de data-acquisitie. Bijvoorbeeld, onze meerdere Kanaalweergave niet alleen minimaliseert de impact van een "verstopte" sensor, maar kan ook worden gebruikt om de steekproefgrootte te verhogen. Bovendien kan meerdere kanalen de gebruiker te wijzen behandelingen om specifieke kanalen zodat zij kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd in een experiment. Met behulp van alle zes kanalen voorziet in ongeveer 1200 opkomende bijen worden geregistreerd in een enkel experiment. Om onze kennis, dit is de grootte van de grootste steekproef van alle huidige systeem meten insect ontstaan en heeft ons toegestaan om te observeren boete-schaal ontstaan patronen in antwoord op het milieu signalen. Ons systeem is ten slotte profiteert van het feit dat de meerderheid van de onderdelen 3D afgedrukt zijn. Hierdoor juist formaat onderdelen, waardoor de kans op fouten (zoals detector verstopping) tijdens operaties. Het staat ook voor aanpassingen voor andere onderzoeksystemen.
Het doel van dit protocol is naar aangepaste animatie een precieze en geautomatiseerde systeem opgezet voor meting van insecten opkomst, om te onderzoeken in de chronobiology en stress fysiologie vragen. Dit systeem is geweest, en blijft van doorslaggevend belang, bij het onderzoeken van de onbeantwoorde vragen met betrekking tot insect ontstaan patronen in antwoord op het milieu signalen. Hier beschrijven we de vergadering en het gebruik voor de detectie van de opkomst van de alfalfa leaf-snijden bijen, Megachile rotundata in lab gebaseerde experimentele instellingen. Het systeem is geautomatiseerd met behulp van een programmeerbare microcontroller en aanpasbaar met behulp van 3D gedrukte delen. Gedrukte rekken houden in plaats buizen met bijen nest cellen na een metalen BB. Op de opkomst, is de metalen BB bevrijd van de rek, het passeren van een infrarood sensor die de datum en de tijd van opkomst naar een SD-kaart opname. Het huidige ontwerp is geoptimaliseerd voor M. rotundata, maar met kleine aanpassingen zou kunnen worden aangepast voor andere soorten insecten.
Protocol
1. systeem bouw
- Het volgende nummer van onderdelen voor elk kanaal wordt gebouwd met behulp van PLA filament, afdrukken: 1 verzamelaar variëteit (collector_manifold.stl), 1 eindkap (end_cap.stl) 6 platform ondersteunt (platform_support.stl), 4 buis rek grondplaten (base_plate.stl) en 4 buis rek gezicht platen (face_plate.stl). Zorg ervoor dat printer bed is groot genoeg om af te drukken een item voordat u gaat afdrukken. Alle *.stl bestanden zijn beschikbaar in aanvullende gegevens.
- Met 3 platform ondersteunt en een 33 x 30 cm stukje golfkarton plastic, gebruik van warme lijm te monteren 2 buis rek platformen per kanaal wordt gebouwd, zoals weergegeven in Figuur 2. De gegolfde kunststof kan worden gescoord aan de ene kant op elke hoek te staan voor het buigen.
- Installeer elektronica in de collector-variëteit.
- Soldeer een 120 Ω weerstand aan de anode (lange been) van zowel de infrarood-zender en de Infrarood detector en een ~ 5 cm lengte van 22 GA draad aan beide kathoden. Gebruik verschillende kleuren van de draden om te voorkomen dat verwarring ontstaat in latere stappen.
- Steek voorzichtig de detector in een aansluiting van de variëteit van de verzamelaar (gemarkeerd in blauw in Figuur 3) en de emitter in de tweede aansluiting (gemarkeerd in het rood). Beide componenten moeten zonder speling past.
- Voeden van de detector draden via de bekabeling kanaal (gemarkeerd in geel in Figuur 3) en alle vier draden trekken door het gat van de toegang (gemarkeerd in groen). Ervoor zorgen dat geen blote draden elkaar raken, met behulp van hete lijm teneinde hen in de plaats.
- Soldeer alle vier draden aan op een RJ45 (Ethernet)-aansluiting, met behulp van de achterste rij van pinnen. Beide anoden moeten worden gesoldeerd aan de meest linkse pin, de kathode van de zender naar de meest rechtse pin en de kathode van de detector op een van de center-pinnen (Figuur 4).
- Beveilig de RJ45-aansluiting over de verzamelaar spruitstuk toegang gat (gemarkeerd in het groen in Figuur 3) met hete lijm, ervoor te zorgen dat geen blote draden elkaar raken binnen de verzamelleiding.
- Construeren van dalende bal verzamelaar (1 per kanaal aangelegd) zoals afgebeeld in Figuur 5
- Met een bekabelde verzamelaar variëteit, een eindkap, en een deel van de 24 x 30 cm van gegolfde kunststof, waarmee warme lijm verbinding wordt gemaakt de basis van de eenheid (rood, groen en licht grijs onderdelen van Figuur 5).
- Een 8 x 27 cm-sectie van gegolfde kunststof gebruiken om toe te voegen een dalende helling van de bal aan de verzamelaar (donker grijs onderdeel van Figuur 5). Het einde cap en verzamelaar spruitstuk ontwerpen omvatten richels zodat de juiste plaatsing. Controleer voor een soepele overgang van de oprit naar de collector om jam tijdens het gebruik.
- Bouw van de centrale processor van het systeem (zoals aangegeven in Figuur 6).
- Het afdrukken van een aangepaste printplaat voor systeem bouw. Alle bestanden die nodig zijn voor PCB boord afdrukken zijn beschikbaar in aanvullende gegevens.
- Soldeer vrouwelijke kopteksten op de via-holes gelabeld voor de volgende installaties: Arduino Nano, temp, klok, SD module en liquid crystal display (LCD) scherm (labelloze 2 x 5 via holes gebied in de hogere linkerhoek van de PCB-bestuur).
- Snap in en soldeer zes RJ45-aansluitingen langs de onderrand van de PCB-bestuur.
- Soldeer zes 470 k ohm pulldown weerstanden in de holes door sites net boven de RJ45-aansluitingen ligt.
- Installeer de Arduino Nano, DHT-temperatuur en luchtvochtigheid sensor, klok en SD module op het bord van de PCB. DHT-temperatuur en vochtigheid sensor moet worden getest voor gebruik in experimenten om nauwkeurigheid te garanderen.
- Sluit de draad van een 10-connector lint aan de LCD scherm connector van de PCB-bestuur. Soldeer het andere uiteinde van de draad lint naar het LCD scherm zodat het scherm pinnen komen met de Arduino pinnen, overeen zoals in Figuur 4. Nadere gegevens over de LCD bedrading zijn beschikbaar op https://Learn.adafruit.com/character-lcds/wiring-a-character-lcd.
- Systeem programmering
- Download en installeer de nieuwste versie van de Arduino IDE voor het juiste besturingssysteem van www.arduino.cc.
- Bij het eerste gebruik, Arduino bibliotheken voor de real-time klok (github.com/adafruit/RTClib) en de temperatuur/luchtvochtigheid sensor (github.com/adafruit/DHT-sensor-library) te installeren. De klok instellen op de huidige lokale tijd met behulp van het ds1307 script dat meegeleverd met de bibliotheek.
- Upload het systeem Arduino script, in aanvullende gegevens beschikbaar.
2. systeem gebruik
- Bouw het systeem zoals weergegeven in afbeelding 7. Voor elk kanaal wordt gebruikt, moet één vallen-bal verzamelaar (geassembleerd in stap 1.4) aan beide zijden worden geflankeerd door een rack-platform (geassembleerd in stap 5.1). Gebruik verpakkingstape stukken bij elkaar te houden en het creëren van een gladde afgeronde rand op het rek-platform.
- Configureren van ongebruikte kanalen om te voorkomen dat valse positieve signalen. Aangezien het systeem gebaseerd is op een laag signaal te detecteren van een gebeurtenis (Infrarood detector niet een signaal ontvangt van de infrarood zender), moeten ongebruikte kanalen op de juiste wijze worden geconfigureerd om te voorkomen dat valse positieve signalen. Dit kan worden bewerkstelligd door een van twee manieren.
- Ongebruikte kanalen in de software deactiveren door commentaar uit de lijnen overeenkomt met de ongebruikte kanalen. In de Arduino IDE, kan dit worden bereikt door het toevoegen van "/ *" voorafgaand aan de onnodige lussen en "* /" aan hun einde.
- Deactiveren van ongebruikte-kanalen via een simpele hardware-accommodatie. Gewoon soldeer samen draden #6 en #8 (meestal de effen bruin en solide groene draden van een commercieel beschikbare cat 6 kabel) en invoegen in de lege RJ45-aansluiting op de centrale processor.
- Belasting en plaats buis racks onmiddellijk voorafgaand aan het uitvoeren van een experiment.
- Zorg ervoor dat alle gaten een tube van 0,5 mL microcentrifuge met het GLB verwijderd bevatten en dat de buizen zonder speling passen.
- Vul elke buis met één insect brood cel, pop geval of cocon, een airsoft pellet en tot slot één metaal BB. Zorg ervoor dat de platte rand kant (GLB) van de brood-cel is naar de richting van de airsoft pellet en metaal BB. Brengt de buis rek faceplate, met de afgeronde rand naar de bodem van het rack, met ¼ inch nylon schroeven.
- Plaats de rekken van de buis op het rek-platform, met de opening naar de collector vallen-bal gericht. Racks moeten worden geplaatst op de rand van het platform, zodat een metalen BB vrij in de collector vallen kan zonder stuiteren tegen een ander deel van de structuur (Figuur 7). Bij het plaatsen van het rek, start met de opening naar boven en vervolgens voorzichtig draaien op zijn plaats om dat metalen BBs zijn niet vrijgegeven. De rekken zijn zo ontworpen dat de buizen enigszins achteruit Slant zal wanneer correct geplaatst, vermindering van de kans van accidenteel vrijkomen van de metalen BBs.
- Plaats een SD-kaart in de adapter en start vervolgens de centrale processor door een micro-USB-connector aan te sluiten op de Arduino, en het andere uiteinde in een geschikte USB-adapter. Het LCD-scherm verschijnt nummers één tot en met 6 als u klaar bent. Een enkele metalen BB vallen de bal verzamelaar van elk kanaal en horloge voor de overeenkomstige telling op het scherm wordt weergegeven en de juiste tijd weer te geven aan de onderkant van het scherm.
- Als de juiste tijd niet wordt weergegeven, herhaalt u stap 1.6.3 en 1.6.4 opnieuw instellen van de klok.
- Als de test metaal BB is niet geregistreerd, is de verzamelaar geblokkeerd. Controleer visueel voor verstopping en herstart het systeem.
- Als een kanaal "counts" omhoog één gebeurtenis per seconde, dit geeft aan dat het kanaal is niet goed aangesloten. Controleer alle aansluitingen en herstart het systeem.
3. Experimenteer einde en Data-analyse
- Na opkomst is afgelopen (zie resultaten en figuren 8 en 9 voor voorbeelden van de tijdschaal), schakel het apparaat door het loskoppelen van de Arduino. Racks kunnen worden gedemonteerd en gereinigd voor hergebruik.
- Tijdens het experiment, worden gegevens opgeslagen op de SD-kaart in een door komma's gescheiden bestand (CSV) toegankelijk door de R-programmeertaal. De SD-kaart gebruiken om gegevens naar de computer, en RStudio tot auto-zeepbel plots van de gegevens.
- Zowel de temperatuur als de gebeurtenis gegevens worden opgeslagen in hetzelfde bestand voor gegevensintegriteit. Vandaar, sommige verwerking moet worden ingevuld vóór de analyse. De door komma's gescheiden bestand importeren in een spreadsheetprogramma. Kolommen I en J worden de datum en de tijd van opkomst voor bijen; kolommen A en B door knippen en plakken van de kolommen A-E in een tweede werkblad maken en opslaan als een afzonderlijk bestand, dit zijn de gegevens van de temperatuur.
- Titelkolom A met, "Datum" en kolom B "Tijd" en sorteren de gegevens door de kolom A vervolgens door B. opslaan als een CSV-bestand. bestand.
- Download en installeer de nieuwste versie van de RStudio van https://www.r-project.org/. Helpen met het gebruik van RStudio voor het uploaden en analyseren van gegevens kan hier gevonden worden op https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.html.
- Met behulp van de R-script beschikbaar in de aanvullende gegevens, het uploaden van de gegevens in RStudio. Wijzigen van de bestemming van de werken in de R-script aan waar de excel *. CSV-bestand zich bevindt. Het script uitvoeren en selecteer het gegevensbestand te analyseren. Typ "uitzetten" in the R console. De zeepbel plot zal worden gevestigd in de bestemming van de werken met de naam "High-res;" Hernoem dit bestand opslaan als een bestand met een hoge resolutie tiff (300 dpi).
Representative Results
Opkomst van M. rotundata is asynchrone zonder blootstelling aan een milieu cue, met opkomst voorkomende gelijkmatig gedurende de dag4. Echter wanneer blootgesteld aan een blokgolf thermoperiod (4° C thermoperiod), wordt opkomst synchroon naar de thermophase4,5. Dit resultaat is vergelijkbaar met andere studies waar insecten gevonden thermoperiod signalen kunt reguleren ontstaan, met inbegrip van de vlees-fly Sarcophaga crassipalpis6, de UI vlieg Delia atiqua7 en de boll weevil Anthonomus grandis grandis8. Een studie heeft aangetoond dat stress tijdens ontwikkeling de synchrony van volwassen opkomst in S. crassipaplpis9 beïnvloedt. Hier presenteren we de resultaten van M. rotundata die werden blootgesteld aan een stress tijdens de ontwikkeling, testen van de hypothese dat deze behandeling zorgt ervoor dat de desynchronization van volwassen ontstaan.
Succesvol uitvoeren
De gebruiker moet het LCD scherm bekijken alvorens de incubator om ervoor te zorgen dat er insecten zijn niet meer in opkomst te openen. Zodra het experiment is voltooid, de SD-kaart verwijderd en kunnen de gegevens worden geëxporteerd naar RStudio als een CSV bestand kan worden gevisualiseerd als een zeepbel complot, zoals eerder is beschreven. Figuur 8 toont bee ontstaan onder een thermoperiod van 4 ° C na blootstelling aan een koude stress tijdens de ontwikkeling. De rode dradenkruis de mediane tijd aangeven en dag van de opkomst en de bestandsnaam is de titel. Dit R-script moet worden gebruikt om de gegevens te visualiseren, maar mag niet dienen als de enige analyse. Als u wilt analyseren opkomst reactie op een milieu cue, de gegevens kan worden geanalyseerd voor rhythmicity (Zie analyse).
Complicatie
Wanneer een sensor is verstopt met metalen BBs, is het ontbreken van een signaal herhaaldelijk geteld, die aanleiding geven tot meerdere valse gegevenspunten. Figuur 9 toont dezelfde dataset gepresenteerd in Figuur 8, maar met een van de zes kanalen verstopt met BBs, waardoor de grote zeepbel op de grafiek. In het geval van een verstopte sensor, kunnen de gegevens uit dit kanaal gemakkelijk uit de analyse worden verwijderd. Opnemen van meerdere kanalen in een experiment is nuttig bij het minimaliseren van de impact van een verstopte sensor.
Analyse
Analyseren van gegevens op aanwezigheid van synchronisatie kan worden gedaan door te berekenen "parameter R," een scalaire statistiek die aangeeft of opkomst ritmische of aritmische10,11,12 is. Dit wordt gedaan door het berekenen van het hoogste aantal opkomende volwassenen in een 8-uur-venster, dit aantal te delen door het aantal volwassenen opkomende buiten het raam van 8 uur, vervolgens te vermenigvuldigen met 100. Alle personen die ontstaan dient voor de berekening van het aantal opkomende volwassenen voor elk uur van de dag worden gebundeld. Het theoretische bereik van parameter R loopt van 0 (alle opkomst treedt op binnen de poort) tot 200 (opkomst gelijkmatig is verspreid over de dag)10. R waarden < 60 worden beschouwd als ritmische opkomst, 60 < R < 90 zijn zwak ritmische, en R > 90 zijn aritmische. R-waarden geven van > 150 uniforme verdeling van opkomst10. Figuur 8 toont dat opkomst is ritmische met parameter R = 20.21 < 60. Wijten aan het feit dat dit soort gegevens wordt verspreid rond een herhalende 24-uurs klok, moet circulaire statistieken worden gebruikt voor een meer robuuste analyse (in detail beschreven in Bennett et al., 20185). Dit kan worden bereikt via circulaire statistiekenpakketten beschikbaar voor RStudio (pakket 'circulaire'-CRAN. R-project.org).
Figuur 1: additief vervaardigde onderdelen. Met behulp van PLA filament, 3D print de vereiste onderdelen voor het systeem. Voor elk kanaal wordt gebouwd, onderdelen nodig zijn 1 verzamelaar variëteit (groen), 1 eindkap (rood), 6 platform ondersteunt (oranje), 4 buis rack grondplaten (paars), en 4 buis rek gezicht platen (geel). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Tube rek Platformvergadering. Het gebruik van warme lijm te monteren van twee buis rek platforms per kanaal wordt gebouwd. Gebruik drie platform ondersteunt (weergegeven in oranje) met een deel van de gegolfde kunststof (in het grijs weergegeven). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Collector spruitstuk x-ray. Steek één Infrarood detector in een aansluiting van de verzamelaar (afgebeeld in het blauw) en de emitter in de tweede aansluiting (afgebeeld in het rood). Voeden van de detector draden via de bekabeling kanaal (getoond in het geel) en alle vier draden trekken door het gat van de toegang (gemarkeerd in groen). Ervoor zorgen dat geen blote draden elkaar raken, met behulp van hete lijm teneinde hen in de plaats. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: aansluiting bedrading. Schakelschema voor de RJ45-aansluiting vóór het aanbrengen aan de verzamelaar variëteit, gezien vanaf de onderkant van de jack en bedrading tabel voor het aansluiten van het LCD-scherm op de centrale processor. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: verzamelaar vergadering bal. Met behulp van een eindkap (afgebeeld in het rood), één verzamelaar variëteit (afgebeeld in groen) en een 24 x 30 cm stukje golfkarton plastic (in het licht grijs weergegeven) monteren de shell van de vergadering van de verzamelaar van de bal. Gebruik een 8 x 27 cm stuk gegolfde kunststof (in het donker grijs weergegeven) om toe te voegen een oprit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: bestuur van de centrale Processor PCB. Het bestuur van de PCB voor de centrale processor bestaat uit een onderlaag (afgebeeld in groen), een bovenste laag (afgebeeld in het rood) en een laag van de zeefdruk (afgebeeld in het blauw). Soldeer vrouwelijke headers om alle Pass Through-gaten, met uitzondering van die voor de RJ45-aansluitingen (langs de bodem) en voor de pull-down weerstanden (direct boven de RJ45-pads). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: eindmontage. Wanneer in gebruik, moet het apparaat worden gemonteerd met een buis rek platform aan weerszijden van elke verzamelaar van de bal wordt gebruikt. Buis rekken met bijgevoegde frontjes moeten worden geplaatst, zodat zij op de rand van de buis Rack Platform, vermindering van de mogelijkheid van dalende BBs terugkaatsen van het apparaat. De voetafdruk van het gemonteerde apparaat is ongeveer 25 cm x 35 cm, met een hoogte van 20 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: grafiek van een typische experimentele run na verwerking in R. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: grafiek van een experiment dat leed aan een verstopte detector, zoals blijkt uit de relatief grote zeepbel op dag 4. De verstopte kanaal kan worden verwijderd uit de analyse, waardoor het behoud van de resterende gegevenspunten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Presenteren we een protocol voor de vergadering en het gebruik van een systeem dat voor nauwkeurige meting van de timing van insecten ontstaan zorgt. Dit systeem is opgelost twee problemen, die vorige ontwerpen beperkte: gedeeltelijke automatisering en beperkte steekproefomvang. We deze problemen opgelost door het verzamelen van de gegevens met behulp van microcontrollers, waardoor ons vergroten van de omvang van het monster met behulp van meerdere kanalen ook automatiseren. Het huidige ontwerp heeft zes kanalen, die een totaal van 1200 bijen kunnen houden. Extra kanalen kunnen worden toegevoegd of afgetrokken indien nodig, niet alleen voor verhoogde steekproefgrootte, maar ook om de effecten van meerdere behandelingen tegelijkertijd te onderzoeken. Kritische stappen, wijzigingen, beperkingen en toekomstige toepassingen worden hieronder besproken.
Het enige deel van het systeem dat is niet geautomatiseerd is het laden van de rekken met brood cellen, metalen BBs en airsoft pellets aan het begin van het experiment. Hoewel de rekken zo ontworpen zijn dat ze leunen moet terug iets om te voorkomen dat metalen BBs vallen wanneer de rekken staan rechtop, zorg worden genomen bij het plaatsen van de rekken om te voorkomen dat de onbedoelde uitstoot van metalen BBs. Zorg er ook voor dat de rekken zijn gelijk met de rand van de plank, zodat het dalende traject van de metalen BB uitgelijnd op de landingsbaan. Tot slot, blad puin duidelijk van de baan moet worden afgeveegd en het onderstel houdt de metalen BBs uit eerdere experimenten moet worden gewist om te voorkomen dat het blokkeren van de sensor. Gegevens worden automatisch opgenomen op een SD-kaart als een CSV-bestand, en het script is geschreven, zodat de Arduino wordt niet uitgevoerd, tenzij een SD-kaart aanwezig is. Het gegevensbestand is in RStudio en gevisualiseerde met behulp van de eerder genoemde R script handmatig geïmporteerd. Dit script zal automatisch grafiek van de gegevens als een zeepbel complot en identificeren van de mediane tijd en de dag van opkomst. De Arduino script is geschreven evenement gegevens toevoegt aan het einde van het bestand, waardoor gegevens verloren gaan in geval van een stroomstoring. Dit betekent echter ook dat zodra gegevens wordt gewonnen uit de SD-kaart, alle bestanden moeten worden gewist voordat de volgende experiment.
Wijzigingen aan de SketchUp-bestanden kunnen worden aangebracht om de grootte van de rekken voor insecten van verschillende maten, met verschillende grootte buizen worden gebruikt in de gemodificeerde rekken. Bovendien is de grootte van de airsoft pellet is belangrijk, omdat het voorkomt het insect uit de buis te verlaten, en pellets, van verschillende grootte kunnen ook nodig zijn. Een breed scala aan wijzigingen kan worden gemaakt aan de R-script om het uiterlijk van de zeepbel percelen en andere grafische parameters wijzigen.
We verlaagd het risico van valse positieven door code te schrijven een ontdendering die een bepaald kanaal gedurende één seconde schakelt nadat een metaal die BB is gedetecteerd waardoor een enkele metalen BB niet worden meegeteld als meerdere gegevenspunten. Hoewel, dit biedt de mogelijkheid van een gegevenspunt als veel bijen tegelijk komen wordt gemist, maar het feit dat de kanalen zijn onafhankelijke vermindert dit risico. Een andere beperking van het huidige systeem is dat afzonderlijke gegevenspunten zijn niet waarneembaar, dat wil zeggen, een dalende metaal BB niet te herleiden naar een specifiek individu. Bovendien, het huidige systeem meet opkomst maar niet eclosion ritmes in de M. rotundata, maar zou meten eclosion ritmes in soorten waar de opkomst en eclosion synoniem zijn. Tenslotte is het huidige ontwerp niet weerbestendig, beperking van het gebruik ervan aan gecontroleerde omgevingen.
Toekomstige toepassingen zijn onder andere onderzoek naar de effecten van andere abiotische en biotische milieu signalen voor timing ontstaan van M. rotundata. Bovendien, omdat insecten uiteenlopende omgevingen bezetten, relevante milieu signalen variëren tussen soorten. Opneming van meer insecten soorten is dus belangrijk om te onderzoeken hoe circadiane systemen ontwikkeld over taxa. Weinig er is bekend over hoe developmental voorwaarden invloed op de timing van volwassen ontstaan; Daarom kan ons systeem worden gebruikt om te ontcijferen van de effecten van behandelingen op ontstaan. Bovendien, combinaties van milieu signalen kunnen beïnvloeden insect reacties, dus op toekomstige experimenten meerdere milieu signalen te begrijpen hun relatieve gevolgen van de opkomst te nemen. Tot slot, de implementatie in het veld om te observeren hoe natuurlijke instellingen bemiddelen opkomst ritmes is van belang. Het gebruiksgemak van dit systeem, en de unieke combinatie van additieve productie, open-source programmering en waarneembare biologische eigenschappen, maken een kandidaat voor gebruik in een educatieve omgeving.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen erkennen voor hun nuttige feedback over experimenten met behulp van het beschreven systeem de Insect cryobiologie en ecofysiologie werkgroep in Fargo, ND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLA printer filament | www.lulzbot.com | various | Catalog number varies by color |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | www.daigger.com | EF4254C | |
| 4.5 mm size "bb" metal pellets | www.amazon.com | B00419C1IA | Daisy 4.5 mm metal size bb pellets |
| 6.0 mm plastic "softair" pellets | www.amazon.com | B003QNELYE | Crosman 6 mm airsoft pellets |
| Plastic corregated sheet | www.lowes.com | 345710 | Corrugated plastic sheet |
| Infrared emmiter/detector pair | www.amazon.com | B00XPSIT3O | 5 mm diameter, 940 nm wavelength |
| 120 ohm resisitors | www.amazon.com | B01MSZK8DV | 120 ohm, 1/4 watt |
| 22 GA hookup wire | www.adafruit.com | 1311 | |
| RJ45 jacks | www.sparkfun.com | PRT-00643 | |
| Custom PCB board | www.pcbexpress.com | n/a | Can be printed from files included in the supplimental data |
| Arduino Nano v 3.0 | www.roboshop.com | RB-Gra-01 | |
| SD card module | www.amazon.com | DFR0071 | DFRobot SD card module |
| Real Time Clock module | www.adafruit.com | 264 | DS1307 real time clock breakout board |
| Temperature/humidity sensor | www.tinyosshop.com | G4F4494F29ED05 | DHT11 temperature/humidity sensor on breakout board |
| 470k ohm resistors | www.amazon.com | B00EV2R39Y | |
| Female headers | www.adafruit.com | 598 | Break off to desired length |
| Male headers | www.adafruit.com | 392 | Break off to desired length |
| Ribbon wire | www.amazon.com | B00X77964O | 10 wire ribbon wire with connectors |
| LCD screen | www.adafruit.com | 198 | |
| Cat6 cable | www.amazon.com | B00N2VISLW | |
| SD card | www.amazon.com | B00E9W1URM |
References
- Lankinen, P. Geographical variation in circadian eclosion rhythm and photoperiodic adult diapause in Drosophila littoralis. Journal of Comparative Physiology A. 159, 123-142 (1986).
- Watari, Y. Comparison of the circadian eclosion rhythm between non-diapause and diapause pupae in the onion fly, Delia antiqua. Journal of Insect Physiology. 48, 83-89 (2002).
- Zimmerman, W. F., Pittendrigh, C. S., Pavlidis, T. Temperature compensation of the circadian oscillation in Drosophila pseudoobscura and its entrainment by temperature cycles. Journal of Insect Physiology. 14, 669-684 (1968).
- Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Yocum, I. S., Kemp, W. P., Greenlee, K. J. Thermoperiodism synchronizes emergence in the alfalfa leafcutting bee (Hymenoptera: Megachilidae). Environmental Entomology. 45, 245-251 (2016).
- Bennett, M. M., Rinehart, J. P., Yocum, G. D., Doetkott, C., Greenlee, K. J. Cues for cavity nesters: Investigating relevant Zeitgebers for emerging leafcutting bees, Megachile rotundata (Hymenoptera: Megachilidae). Journal of Experimental Biology. 221, jeb175406 (2018).
- Miyazaki, Y., Goto, S. G., Tanaka, K., Saito, O., Watari, Y. Thermoperiodic regulation of the circadian eclosion rhythm in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis. Journal of Insect Physiology. 57, 1249-1258 (2011).
- Watari, Y., Tanaka, K. Effects of background light conditions on thermoperiodic eclosion rhythm of onion fly Delia antiqua. Entomological Science. 17, 191-197 (2014).
- Greenberg, S. M., Armstrong, J. S., Setamou, M., Coleman, R. J., Liu, T. X. Circadian rhythms of feeding, oviposition, and emergence of the boll weevil (Coleoptera: Curculionidae). Insect Science. 13, 461-467 (2006).
- Yocum, G. D., Zdarek, J., Joplin, K. H., Lee, R. E., Smith, D. C., Manter, K. D., Denlinger, D. L. Alteration of the eclosion rhythm and eclosion behavior in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis, by low and high temperature stress. Journal of Insect Physiology. 40, 13-21 (1994).
- Winfree, A. Integrated view of resetting a circadian clock. Journal of Theoretical Biology. 28, 327-374 (1970).
- Watari, Y., Tanaka, K. Interacting effect of thermoperiod and photoperiod on the eclosion rhythm in the onion fly, Delia antiqua supports the two-oscillator model. Journal of Insect Physiology. 56, 1192-1197 (2010).
- Short, C. A., Meuti, M. E., Zhang, Q., Denlinger, D. L. Entrainment of eclosion and preliminary ontogeny of circadian clock gene expression in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis. Journal of Insect Physiology. 93, 28-35 (2016).
