Mate-bevogtning adfærd spiller en vigtig rolle i reproduktion af intertidale vandlopper af slægten Tigriopus. Metoder til at studere denne opførsel har dog ikke været godt beskrevet. Her beskriver vi metoder til: 1) individuel kultur af Jomfru Tigriopus dyr, og 2) kvantitativ analyse af deres mate-bevogtning adfærd.
Vandlopper af slægten Tigriopus, som er fælles zooplankton i rocky tidevand puljer, vise precopulatory mate-bevogtning adfærd hvor en mandlig spænder en potentiel mate til at danne et par. Mens dette fænomen har tiltrukket interesse af forskere, har metoder til sin analyse ikke været godt beskrevet. Her vi beskrive procedurer for: 1) individuel dyrkning og iscenesættelse af Tigriopus ungfisk og voksne og 2) video-baseret analyse af deres mate-bevogtning adfærd. Metoden dyrkningsbaserede muliggør eksperimentelle kontrol af Afklip oplevelse af dyr samt mulighed for at spore deres udvikling før adfærdsmæssige test. Den analysemetode, der tillader kvantitative evaluering af flere aspekter af mate-bevogtning adfærd, herunder indfange forsøg af hanner og svømning bane af mate-bevogtning par. Selv om disse metoder blev oprindeligt oprettet for etologiske undersøgelser på Tigriopus, med passende ændringer de kan også anvendes til undersøgelser af andre zooplankton i forskellige forskningsområder, såsom fysiologi, toksikologi, og økologisk genetik.
Intertidale copepoder af slægten Tigriopus er vidt udbredt i rocky høj intertidale pools på tværs af flere kontinenter1. Disse vandlopper udviser mate-bevogtning adfærd som en del af deres reproduktion, hvor en voksen mand fanger en potentiel mate (unge eller voksne) udnytte sine krogede første antenner før samleje (figur 1 og figur 2)2 ,3,4,5. Selv om dette fænomen har været et emne af etologiske og biokemiske undersøgelser for årtier2,3,6,7, detaljerede procedurer for undersøgelser af denne adfærd, herunder enkelte kultur af Jomfru dyr og kriterier for adfærdsmæssige begivenheder set i en mate-bevogtning forsøg på har ikke været godt beskrevet. Således, her vi indføre metoder for at aktivere undersøgelser af adfærd under en kontrolleret eksperimentel miljø.
Enkelte dyrkning og iscenesættelse af dyr
Tidligere undersøgelser af reproduktion af Tigriopus ansat konventionelt et par afmontering metode for at forberede adfærdsmæssige test yngel (copepodids) og voksne hunner og avl forsøg3,8,9 ,10. Men denne metode tillader dyr form par og potentielt parre før test (drøftet i Ito 198811), som kan ændre adfærdsmæssige egenskaber af dyr5. Derudover er der også et potentiale for at fejlbedømme udviklingsstadier af vandlopper med de konventionelle protokoller, som de er afhængige af tilsyneladende kropsstørrelse for iscenesættelse. I dette papir beskriver vi en individuel dyrkningsbaserede metoden i vores seneste undersøgelse med Tigriopus californicus5, som var designet til at løse disse begrænsninger ved at kontrollere parring oplevelse af dyr og spore deres udvikling fra copepodid til voksen faser.
Kvantitativ analyse af mate-bevogtning adfærd
Mate-bevogtede opførslen af Tigriopus arter er blevet undersøgt, ikke kun inden for etologi2,6 , men også på andre områder som økotoksikologi og evolutionær genetik3,4, 7 , 8 , 9 , 10. men de tidligere undersøgelser har forklaret løbet af problemet primært i skrevet form uden tilstrækkelig visuel illustrationer at skitsere både adfærd og metoder til at studere det, der skaber tekniske hindringer for den replikering og avancement undersøgelser. Her, leverer vi detaljerede beskrivelser af nogle af de vigtigste begivenheder i de mate-bevogtning opførsel af Tigriopus copepoder understøttet af visuelle materialer. Vi viser også udstyr og metoder til kvantitativ analyse af adfærd. Disse metoder giver mulighed for vurdering af adfærdsmæssige egenskaber af dyr under bevogtning af mate forsøg i netop replikerede eksperimenter.
Med disse metoder tilstræber vi at give en metodologisk grundlag af kontrollerede og reproducerbare studies på mate-bevogtede opførslen af slægten Tigriopus.
Enkelte dyrkning og bestemmelse af scenen og sex
Her beskrev vi den metode, der anvendes i vores tidligere undersøgelse5 for at forberede jomfru Tigriopus dyr med deres parring erfaring kontrolleret mens tracking deres udvikling (figur 4 og figur 7). Som Tigriopus arter udnyttes som model dyr i forskellige biologiske områder som toksikologi16,18, økologiske fysiologi19,20,21, og evolutionære Genetik13,22,23,24, denne metode har et potentiale til at give et værdifuldt middel til at vurdere indflydelse af miljømæssige og genetiske faktorer på disse vandlopper livscyklus.
For at opnå succesfulde iscenesættelse, almindelig søgning og indsamling af CI er copepodids fra en masse kultur (trin 1.2) kritisk, da samlingen på senere stadier kan resultere i mis iscenesættelse af dyrene. Derudover er en grundig søgning efter exuviae (trin 1.3) også afgørende for præcise iscenesættelse. Øge hyppigheden af indsamling og iscenesættelse hvis nødvendigt, så intervallet mellem molts varierer fra én til flere dage afhængigt af arter og opdræt betingelse2,25,26. Forskelle i antenner morfologi mellem copepodids og voksne hunner er ikke synligt betydelig i nogle arter og bestande af Tigriopus16,25. Iscenesættelse før kønsbestemmelse er derfor nyttigt at skelne mellem voksne hunner fra avancerede copepodids af begge køn.
Adfærdsmæssige test og manuel analyse af adfærdsmæssige egenskaber
Generelt er en af de mest kritiske dele af etologiske undersøgelser definition og beskrivelse af begivenheder af interesse. De metoder, der er indført i dette papir blev først udviklet til vores seneste undersøgelse5 og suppleres med beskrivelsen af samleje og visuelle hjælpemidler (figur 10). Desuden, at spiller konsekvensen animalsk håndtering også en vigtig rolle i adfærdsmæssige eksperimenter. For eksempel, skylning af vandlopper kan potentielt lette nogle aspekter af deres adfærd (supplerende figur 1) og er derfor ønskeligt at udføres konsekvent blandt prøver, såsom standardiseret taktfast 2.1.3. Vi forventer af materialer leveres i dette papir vil hjælpe kontrolleret og reproducerbare studies på funktionen mate-bevogtning af Tigriopus, fremme af reproduktiv og økologiske studier af denne rigelige indbygger højvande pools.
En mulig begrænsning med denne metode er lav forstørrelse af opnåede billeder. Selvom film optaget med vores system tillader identifikation af fremtrædende organ strukturer, herunder urosomes og mandlige første antenner, kan man ikke kunne observere mere subtile strukturer såsom ben og kønsorganer med vores metode, da det ikke anvender mikroskopiske forstørrelse til videooptagelse. Mens Kelly et al. rapporterede, at de var i stand til at overholde spermatophore overførsel fra hanner til hunner af T. japonicus under en mikroskopisk observation på 100 X forstørrelse (ingen video registreret)7, har vi ikke været i stand til at overholde en spermatophore i vores film, måske på grund af begrænsningen af billedopløsningen.
To-dimensionelle sporing af par
Selvom denne metode ikke tillader tre-dimensionelle sporing af dyr, det giver mulighed for to-dimensionelle bane analyse af zooplankton uden kemisk mærkning dyr (cf. Svinefedt et al. 201027) ved at udnytte programmer distribueres gratis. Hvis størrelsen af en film-fil er for stor til at blive behandlet i ImageJ, kan reducere opløsningen af fil og konvertere den til en grå skala film. Mens metoden beskrevet blev oprindeligt udviklet for voksne par af T. californicus (figur 12 og Figur 13), er det også tilgængelig for voksen-unge par og enkelte individer (supplerende figur 1) som samt andre Tigriopus arter i princippet. Vi forventer yderligere metode skal anvendes til at kortsigtede (fra millisekund til de anden tidsskalaer) bane analyse af zooplankton af andre taxa med passende justeringer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af tilskud fra Sumitomo Foundation, Japan (Grant for grundlæggende videnskab forskningsprojekter, giver nummer: 150932) og Research Institute af Marine invertebrater, Japan (2018 individuelle forskning tilskud) til STI og RSB samt et tilskud fra USA National Science Foundation (DEB-1556466) til RSB. Vi takker Ms. Kiana Michelle Woodward for feedback på metoden dyrkningsbaserede og iscenesættelse.
Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |