Summary
Comportamento do companheiro-guardando desempenha um papel importante na reprodução de copépodes intertidais do gênero Tigriopus. No entanto, métodos para estudar esse comportamento não foram bem descritos. Aqui descrevemos os métodos para: cultura 1) individual de virgem Tigriopus animais e 2) a análise quantitativa de seu comportamento de companheiro-a guardar.
Abstract
Copépodes do género Tigriopus, que são comuns zooplankton em piscinas rochosas, mostram comportamento de companheiro-guardando precopulatory onde um macho fechos um potencial parceiro para formar um par. Enquanto este fenômeno tem atraído o interesse de pesquisadores, métodos para a sua análise não foram bem descritos. Aqui descrevemos os procedimentos para: 1) individual de cultivo e preparo de Tigriopus juvenis e adultos e 2) baseado em vídeo análise de seu comportamento de companheiro-guardando. O método de cultivo permite controle experimental da experiência de animais, bem como a capacidade de controlar o seu desenvolvimento antes de testes comportamentais de emparelhamento. O método de análise permite uma avaliação quantitativa dos vários aspectos do comportamento companheiro-guardando, incluindo captura de tentativas por machos e trajetória do companheiro-guardar pares de natação. Embora esses métodos foram estabelecidos originalmente para estudos etológicos na Tigriopus, com modificações adequadas eles podem também ser aplicados aos estudos de outro zooplankton em campos de pesquisa diferentes, tais como fisiologia, toxicologia e ecológica genética.
Introduction
Copépodes intertidais do gênero Tigriopus estão amplamente distribuídos em pools de intertidais rochosos altas em vários continentes1. Estes copépodes exibem comportamento companheiro-guardando como parte de sua reprodução, onde um homem adulto capta um potencial parceiro (juvenil ou adulto) utilizando suas antenas primeiras viciadas antes da cópula (Figura 1 e Figura 2)2 ,3,4,5. Embora este fenômeno tem sido objeto de estudos etológicos e bioquímicos para décadas2,3,6,7, procedimentos detalhados para estudos do comportamento, incluindo cultura individual de animais virgens e critérios de eventos comportamentais, vistos em uma tentativa de companheiro-guardando, não foram bem descritas. Assim, aqui nós estabelecer métodos para habilitar estudos do comportamento sob um ambiente controlado e experimental.
Individual de cultivo e preparo de animais
Estudos anteriores de reprodução de Tigriopus convencionalmente empregados um par desanexar método para preparar juvenis (copepodids) e as fêmeas adultas para testes comportamentais e criação de experiências3,8,9 ,10. No entanto, esse método permite que os animais aos pares de formulário e, potencialmente, para ter relações sexuais antes de testes (discutidos em 1988 Ito11), que podem alterar propriedades comportamentais dos animais5. Além disso, há também um potencial para menosprezar os estádios de desenvolvimento de copépodes com os protocolos convencionais como eles dependem do tamanho do corpo aparente para a plataforma. Neste trabalho, descrevemos um método de cultivo individual utilizado em nosso estudo recente com Tigriopus californicus5, que foi projetado para atender a essas limitações, controlando a experiência emparelhamento dos animais e controle seu desenvolvimento de copepodid para estágios do adultos.
Análise quantitativa do comportamento do companheiro-guarda
O comportamento do companheiro-guardando Tigriopus espécie tem sido estudado não só no campo da etologia,2,6 , mas também em outros campos como Ecotoxicologia e genética evolucionária3,4, 7 , 8 , 9 , 10. no entanto, os estudos anteriores explicaram o curso desse comportamento principalmente em escritos de formas sem suficientes ilustrações visuais para delinear os métodos para estudá-lo e o comportamento que cria obstáculos técnicos para a replicação e avanço dos estudos. Aqui, nós fornecemos descrições detalhadas de alguns dos eventos-chave no comportamento companheiro-guardando de copépodes Tigriopus apoiado por materiais visuais. Também demonstramos equipamentos e métodos de análise quantitativa do comportamento. Esses métodos permitem a avaliação das propriedades comportamentais dos animais durante as tentativas de companheiro-guardando em precisamente experimentos replicados.
Com esses métodos, pretendemos fornecer uma base metodológica de estudos controlados e pode ser reproduzidos no comportamento do gênero Tigriopuscompanheiro-a guardar.
Protocol
1. preparação dos animais virgens para observação comportamental
- Obter ovos fertilizados e permitir-lhes a eclodir.
- Colete gravid fêmeas carregando ovos laranja claro (ou seja, fertilizados e em estágios avançados de desenvolvimento) (Figura 3) de uma cultura de estoque com uma pipeta Pasteur. Enxague as fêmeas pipetando-los suavemente em meio de cultura limpo para evitar a transferência de outros animais, incluindo larvas de nauplial que podem eclodiram na cultura.
Nota: No presente protocolo, água do mar artificial com uma salinidade de 35% é usada como meio de cultura. Use meio diferente (por exemplo, artificiais de água salgada com uma salinidade maior ou um soluto adicional), dependendo da finalidade de um experimento.
Nota: Ver Barreto et al 201512 para um método para o estabelecimento das unidades populacionais de cultura do laboratório e Pereira et al . 201613 para obter exemplos de sites de coleção de populações naturais de T. californicus. Peterson et al relataram também seus sites de coleção de T. californicus, T. fulvuse T. japonicus com informações de latitude e longitude9. Use pipetas de plástico com uma capacidade de cerca de 30-50 mL para coletar Tigriopus copépodes de piscinas. - Coloque cada fêmea individualmente em um poço de uma placa de cultura de células de 6-poços com meio de cultura limpa (Figura 4, à esquerda). Certifique-se de que nenhum outro animal (incluindo a larva nauplial) está a contaminar o poço.
- Manter as placas na incubadora, situado a 20 ° C, com um ciclo de claro-escuro de 12 horas à cultura as fêmeas até que eles liberam sacos de ovos. Esta etapa geralmente leva de um a dez dias dependendo da espécie e estádios de desenvolvimento de embriões. Enquanto isso, alimentar cada fêmea grávida duas vezes por semana com dois grãos de comida de peixe finamente solo (aproximadamente < 0, 5mm de diâmetro) (ver Tabela de materiais para obter detalhes).
Nota: Use diferentes temperaturas e ciclos de luz, dependendo da finalidade de um experimento. Temperaturas mais altas podem facilitar o desenvolvimento mais rápido dos embriões.
Nota: Evite deixar o excesso de comida em decomposição em poços. Se os restos de comida começa a decair, pipete fora de poços, com uma pipeta Pasteur. - Após os sacos de ovos são liberados, remova as fêmeas dos poços de cultura com uma pipeta Pasteur.
Nota: As fêmeas inseminadas são capazes de desova embreagens múltiplas da prole2,3. Se necessário, transferi as fêmeas em outros poços para coletar novas garras.
- Colete gravid fêmeas carregando ovos laranja claro (ou seja, fertilizados e em estágios avançados de desenvolvimento) (Figura 3) de uma cultura de estoque com uma pipeta Pasteur. Enxague as fêmeas pipetando-los suavemente em meio de cultura limpo para evitar a transferência de outros animais, incluindo larvas de nauplial que podem eclodiram na cultura.
- Colete copepodids para cada cultura.
- Mantenha as placas com náuplios eclodidos na incubadora e cultura os náuplios, até que eles desenvolvem para a primeira fase de copepodid (CI) (Figura 4, médio). Esta etapa geralmente leva de uma a duas semanas. Cada feed bem com vários grãos de finamente triturada comida de peixe enquanto procurava CI animais uma vez a cada dois dias. Reabasteça com água evaporada de criação com água destilada.
Nota: Se detritos flutuantes obstruam a vista, desnatado, com um pequeno pedaço de papel toalha. - Tão logo CI animais começarem a emergir, coletá-los dos poços com uma micropipeta de P-10 com seu volume de pipetagem fixado em aproximadamente 8 µ l, sob um estereomicroscópio em 10 X de ampliação X 40 (Figura 4, direita). Lavar cada animal CI pipetando suavemente em água do mar limpa artificial e colocá-lo em um poço da placa de cultura de células 24 poços contendo 2-3 mm de profundidade (aproximadamente 400-600 µ l) de água do mar artificial.
Nota: Evite carregar sobre exúvia nauplial ou outros animais nos poços para cultura individual.
- Mantenha as placas com náuplios eclodidos na incubadora e cultura os náuplios, até que eles desenvolvem para a primeira fase de copepodid (CI) (Figura 4, médio). Esta etapa geralmente leva de uma a duas semanas. Cada feed bem com vários grãos de finamente triturada comida de peixe enquanto procurava CI animais uma vez a cada dois dias. Reabasteça com água evaporada de criação com água destilada.
- Acompanhar o desenvolvimento dos indivíduos pela contagem exúvia derretida.
- Examine dentro de cada poço para exúvia derretido a cada dois ou três dias (frequência de ajuste, se necessário) pela observação stereomicroscopic sob uma iluminação de campo escuro com 10 X para ampliação de 40 X. Exúvia de copepodids é transparentes e reconhecível com cerdas de pernas, um par de caudal rocha (i.e., fino salientes estruturas na extremidade caudal), e/ou segmentação de prosome e urosome (Figura 5). Mudar o foco e iluminação para detectar exúvia em diferentes profundidades em um poço (figura 6A).
Nota: Exúvia derretida é menores do que o animal que tem molted-los. Inicie a exame do menor ampliação para um animal e sua exúvia relativamente recente e shift para maior ampliação para mais velhos (ou seja, menor) exúvia.
Nota: Se estiverem danificadas exúvia em um poço, elimine o poço do mais desenvolvimento rastreamento para evitar erro de julgamento de estádios de desenvolvimento.
Nota: Se detritos flutuantes obstruam a visão (Figura 6B), desnatado, com um pequeno pedaço de papel toalha. - Grave um número total de exúvia copepodid em cada poço com uma marca de registro na tampa da placa (Figura 7). Adicione uma linha para a marca como uma nova exúvia é encontrada no poço.
Nota: Se não houver nauplial exúvia contaminadas no poço, eliminá-los do Conde. - Alimentar de cada indivíduo com dois grãos de finamente triturada comida de peixe. Reabasteça com água evaporada de criação com água destilada para manter a salinidade.
Nota: Alimentação copepodids cada dois ou três dias para impedi-los de consumir e danificar a exúvia derretida, o que potencialmente poderia influenciar a estimativa do grau de desenvolvimento (etapa 1.3.4). - Estimar o grau de desenvolvimento do animal com base no número da exúvia. Se não há nenhum exúvia, o indivíduo é estimado em fase de CI. Se não houver exúvia de um a quatro, o indivíduo é estimado em CII para estágios de CV. Se houver cinco exúvia, o indivíduo é estimado para ser um adulto.
- Examine dentro de cada poço para exúvia derretido a cada dois ou três dias (frequência de ajuste, se necessário) pela observação stereomicroscopic sob uma iluminação de campo escuro com 10 X para ampliação de 40 X. Exúvia de copepodids é transparentes e reconhecível com cerdas de pernas, um par de caudal rocha (i.e., fino salientes estruturas na extremidade caudal), e/ou segmentação de prosome e urosome (Figura 5). Mudar o foco e iluminação para detectar exúvia em diferentes profundidades em um poço (figura 6A).
- Identifica o sexo de adultos com base na morfologia.
- Animais do sexo, examinando sua morfologia. Machos adultos Tigriopus possuem antenas primeiras geniculadas com estruturas globulares e viciadas na extremidade distal (Figura 3A). Fêmeas adultas possuem mais suaves e relativamente mais fina primeiras antenas (Figura 3B) do que os dos machos. Algumas fêmeas apresentam cor verde escura de lipídios gonadal em seus corpos (Figura 3B, 3D).
- Marca o sexo na tampa do poço (Figura 7B).
2. teste comportamental e gravação de vídeo de comportamento companheiro-guarda
- Em um dia de teste, selecione animais de palco desejado e o sexo de um teste comportamental.
- Alimentar os indivíduos selecionados em poços de cultura com comida de peixe moído finamente e permitir-lhes comer por 30 minutos. Entretanto, prossiga para a etapa 2.1.2 para preparar testes câmaras.
- Preparar duas placas de cultura de célula de fundo plano 48-bem como testes câmaras; uma placa (a seguir designada por "chapa A") é para o sexo masculino e a outra ("chapa B") para alvos (por exemplo, copepodids, fêmeas adultas, machos adultos). Adicione 400 µ l de água do mar limpa artificial com uma salinidade de 35% nos poços das placas. Coloque as placas sobre uma almofada de luz LED, coberta com uma placa de acrílico translúcida como um difusor de luz (Figura 8).
Nota: Use meio diferente dependendo de um propósito de um experimento.
Nota: Para evitar o excesso de calor, não utilize lâmpadas incandescentes ou fluorescentes como uma luz de fundo. - Após o tempo de alimentação de 30-min descrito em 2.1.1, enxágue cada animal pipetando suavemente em uma sucessão de quatro poços de uma placa de 24-poço cheio de água do mar limpa artificial (Figura 9) para evitar a transferência dos restos e exúvia dos poços de cultura.
- Coloque os indivíduos enxaguados nos poços das placas A e B no painel de luz LED. Deixe 30 minutos para adaptação dos animais aos poços.
- Defina uma câmera de vídeo acima de chapa A durante o período de ajuste (Figura 8). Use um tripé ou um carrinho para segurar a câmera.
- A câmera focalizar os machos dentro de chapa A para permitir uma observação de antenas.
Nota: Para reduzir a cintilação da luz de fundo em filmes, definir uma taxa de quadros igual a ou metade de uma frequência elétrica e usar um tempo de exposição. Além disso, mantenha o painel de luz LED, coberto com uma placa de acrílico translúcida, conforme descrito na etapa 2.1.2.
- Após o período de ajuste descrito na etapa 2.1.4, inicie a gravação de vídeo e o teste comportamental.
- Transferi as metas da chapa B para placa A com uma pipeta Pasteur. Se o experimento é sensível aos componentes químicos no meio, mude pipetas para cada par de teste.
Nota: Quando a pipetagem de um animal da placa B, não persegui-lo na água com uma pipeta Pasteur como perturbação da água pode estimular o animal e provocar o seu movimento em excesso. Segure uma ponta da pipeta ligeiramente acima da superfície da água e esperar para que o indivíduo sob a ponta. Delicadamente, pipetar-se com uma pequena quantidade de água do mar artificial e depois ejetá-lo em um poço na placa A. - De acordo com um plano experimental, permitir que um macho e um alvo interagir em cada poço, durante um período desejado do momento de observação (por exemplo, 10 minutos), após a transferência.
- Pare a gravação de vídeo, após o tempo de observação. Se necessário, descarregar os filmes gravados da câmera para um computador.
- Transferi as metas da chapa B para placa A com uma pipeta Pasteur. Se o experimento é sensível aos componentes químicos no meio, mude pipetas para cada par de teste.
3. manual análise das propriedades comportamentais
- Examinar o filme para o sincronismo quando cada alvo foi transferido para o poço na placa A.
- Examinar a iniciação e terminação calendário de eventos turísticos e calcular a latência, duração e frequência dos eventos.
- Defina a iniciação de tentativa de guarda por um macho como um contato da antena do macho com qualquer parte do corpo do alvo (Figura 10, em cima à esquerda). O contato da antena é muitas vezes precedido por um swift (< 0.5 s) perseguir ou atacar.
- Defina cessação da guarda tentativa como um ponto quando ambas as antenas dos machos desanexar do corpo de um alvo (Figura 10, canto superior direito). Calcule a frequência de tentativas como a guardar:
- Defina o início da cópula por uma curva de corpo dorsal de um homem que é seguido por uma imprensa repetitiva de um urosome contra isso do sexo feminino (Figura 10, canto inferior direito). Frequência do empurrão é várias vezes por segundo.
Nota: Um macho guardando rasteja até a extremidade caudal do corpo de uma mulher antes da cópula (Figura 10, canto inferior esquerdo). - Defina a terminação da cópula por destacamento do urosomes após os eventos descritos em 3.2.4.
Nota: As cópulas geralmente ocorre durante vários minutos em casos de T. californicus e T. japonicus.
4. bidimensional acompanhamento de indivíduos e pares
- Gere um clip de vídeo apresentando um episódio de interesse (por exemplo, os 3 primeiros s de uma tentativa de guarda) por aparar o filme gravado na etapa 2 com software de edição de filme.
- Instalar o ImageJ14 de: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Então baixe MTrackJ, um plugin de sensores de movimento para ImageJ15, por seguindo as instruções em: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
- Abra o ImageJ e importar um filme de interesse (por exemplo, arquivo > Importar > usando QuickTime; escolha "Converter 8-bit escala de cinza" para reduzir a memória necessária para o processamento de imagem).
- Realize a calibração espacial e tempo.
- Selecione a ferramenta de seleção de linha reta na janela ImageJ para calibração espacial.
- Desenhe uma linha de seleção ao longo de um objeto com um comprimento conhecido (por exemplo, o diâmetro de um poço) na janela do filme.
- Abra o menu "Definir escala" (análise > definir escala). Insira o comprimento conhecido na caixa "distância conhecido" e sua unidade (por exemplo, mm) na caixa de "Unidade de comprimento". Clique na opção "Global" para usar a escala para outros clipes de vídeo.
- Abra o menu "Propriedades" (imagem > Propriedades) para calibração de tempo. Digite o intervalo de quadro (recíproco da taxa de quadro) na caixa 'Intervalo de quadro'.
- Configure o controle com MTrackJ.
- Abra o plugin MTrackJ de Plugins > MtrackJ no ImageJ. Clique no botão "Rastreamento" na janela de diálogo de MTrackJ para abrir um controle menu de configuração.
- Definir um intervalo de rastreamento verificando "Mover para o próximo índice de tempo depois de adicionar o ponto" e inserindo um número na caixa "Tamanho do passo do tempo" na janela de diálogo de configuração. Para executar o rastreamento de frame-por-frame, digite "1" na caixa "Tamanho de passo de tempo".
- Consulte "Aplicar o cursor local rotura durante o rastreamento" e escolha "Negro centroide" como um recurso de snap. Esta opção permite uma detecção automática de centroide de um objeto escuro (ou seja, um indivíduo ou um par) dentro de uma detecção de quadrados ("intervalo snap") em torno de um cursor. Escolha um tamanho do quadrado para cobrir um inteiro par ou animal no filme (por exemplo, 31 x 31 pixels).
- Clique em "Okey" para aplicar as opções escolhidas.
- Execute rastreamento bidimensional.
- Clique no botão "Adicionar" na janela de diálogo para iniciar o acompanhamento MTrackJ.
- Coloque um cursor (Praça da deteção) para cobrir um par ou um indivíduo a ser rastreado. Clique para detectar o negro centroide do objeto dentro do quadrado.
- Repita a etapa 4.6.2 para um número desejado de quadros.
- Para gerar as tabelas de dados, clique em "Medida" na janela de diálogo MTrackJ. Os dados são exibidos em duas janelas: "MTrackJ: faixas" janela mostra um resumo da trajetória do bidimensional controlada e "pontos de: MTrackJ" mostra dados detalhados para cada ponto de tempo. Para salvar cada tabela, escolha Arquivo > salvar como... menu no ImageJ.
Nota: Consulte o manual on-line fornecido pelo desenvolvedor (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) para descrições de cada coluna de dados. - Para gerar um filme com uma trajetória controlada desenhada como uma linha colorida, clique no botão "Movie" na janela de diálogo MTrackJ. Para salvar o filme gerado, escolha Arquivo > salvar como... menu no ImageJ.
- Salve o resultado inteiro. Clique no botão "Salvar" na janela de diálogo de MTrackJ para salvar os resultados, incluindo os dados (passo 4.6.4) e a trajetória de duas dimensões controlada (etapas 4.6.2 e 4.6.3).
Representative Results
O método de cultivo individual descrito na etapa 1 permite a preparação e encenação de animais virgens sem experiência prévia de emparelhamento.
O teste comportamental descrito na etapa 2 permite a gravação de vídeo e observação do comportamento de copépodes Tigriopus companheiro-a guardar. A seguinte análise do vídeo gravado com os métodos descritos nas etapas 3 e 4 permite a análise quantitativa dos vários aspectos do comportamento mostrado na Figura 1.
A Figura 11 mostra uma diferença na duração média de guardar as tentativas entre pares de macho-fêmea e macho-macho pares de T. californicus. Uma análise manual demonstrou que os pares do macho-macho mostraram relativamente menor duração do emparelhamento do que pares masculino-feminino.
Exemplos de trajetórias controladas com o método de análise são apresentados na Figura 12 , e um resultado representativo da análise de velocidade é mostrado na Figura 13. Rastreamento espacial bidimensional de recém-formado guardando pares de T. californicus revelou que pares do macho-macho tendiam a mostrar maior velocidade do que pares masculino-feminino nos 3 primeiros s de guardar as tentativas.
Figura 1: Comportamento de companheiro-guardando em Tigriopus. (A) um homem adulto, abraçando um juvenil (copepodid) com as primeiras antenas (indicadas pelas setas azuis). Barra = 1 mm. (B) um esboço do comportamento do companheiro-a guardar. Um macho tenta capturar um indivíduo de alvo (à esquerda) e forma um par com ele (meio). Em pares de macho-macho e alguns pares de macho-fêmea, uma tentativa de guarda encerra sem cópula. Esta figura foi modificada de Tsuboko-Ishii e Burton 20175. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fases do desenvolvimento da Tigriopus. Tigriopus espécies geralmente passam por seis estágios de Náuplio (de NI a NVI), cinco estágios de copepodid (a partir de CI de CV) e uma fase adulta (CVI)16. Os machos tentam guardando para juvenis de uma fase inicial de copepodids (CI em T. japonicus e T. fulvus6,17 ) e CII em californicu de T.s3, bem como a adultos de ambos os sexos5 . Esta figura foi modificada de Tsuboko-Ishii e Burton 20175. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Morfologia dos adultos (T. californicus). (A) macho adulto. (B) fêmea adulta. (C) Gravid fêmea adulta com um saco de ovos com ovos (laranja claro) fecundados e desenvolvidos. (D) Gravid fêmea adulta com um saco de ovos não fertilizados ou subdesenvolvidos (verde escuro) ovos. As setas indicam sacos de ovos. Barra = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: esquema de preparação para a cultura individual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Molted exúvia. (A) exúvia do CI para estágios de CV de um único animal de T. californicus. Barra = 1 mm. (B) exúvia do CI para CV dos estágios em uma cultura individual bem. Detritos de branco é excremento de animal cultivado no poço (não mostrado na imagem). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: busca de exúvia sob um estereomicroscópio. Bares = 1 mm. (A) alteração Focal de um microscópio estereoscópico para a deteção de exúvia em diferentes profundidades. Magenta setas indicam exúvia focada e cinza setas indicam exúvia fora de foco. Top imagem enfoca a exúvia esquerda, que está afundado no fundo do poço. Imagem de fundo enfoca a exúvia certa, que está flutuando na superfície média. (B) imagem superior mostra um exemplo de obstrução do exame por detritos boiando na superfície média. Uma seta verde indica uma exúvia escondida debaixo dos escombros. Imagem de fundo mostra um resultado de superfície de limpeza com um pequeno pedaço de papel toalha. Uma exúvia (indicada por uma seta verde) é visível após a limpeza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: preparo e sexagem dos animais. Exemplos de como marcar o número de exúvia e sexo dos animais em uma tampa de uma placa de cultura. (A) um exemplo para um poço contendo cinco exúvia e um animal adulto. O número das linhas da marca de registro na tampa representa o número da exúvia encontrados no poço. Quando o número de exúvia atinge cinco, o sexo do animal pode ser determinado com base na morfologia de antenas (Veja também a Figura 3). (B) um exemplo de uma tampa marcado de uma placa de cultura. Linhas superiores contêm animais mais velhos (CIV para adultos) e linhas de fundo mais novo (ou seja, recém coletados) animais (CI a CIII). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: esquema de teste comportamental. Configuração para gravação de vídeo do comportamento do companheiro-guarda (à esquerda) e um esboço do teste comportamental (à direita). Esta figura foi modificada de Tsuboko-Ishii e Burton 20175. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: lavagem de animais antes de um teste comportamental Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: definição de eventos examinados na análise manual. Ilustrações de acontecimentos observados em relação à tentativa de companheiro-a guardar. Destacam-se nomes dos eventos definidos e analisados na etapa 3. Eventos fechados em uma linha pontilhada não podem ser observados em algumas tentativas de companheiro-a guardar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Diferença na proteção de duração entre pares de macho-fêmea e macho-macho pares de T. californicus. Cada símbolo de triângulo representa dados de um par de testado. Bares e bigodes representam medianas e o intervalo interquartil, respectivamente. Duração média de captura foi maior para os pares masculino-feminino (masculino-feminino (n = 22), macho-macho (n = 29); * *p < 0,01 pelo teste de Mann-Whitney U). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: trajetórias de pares nos primeiros três segundos de guardar tentativas. Exemplos de trajetórias bidimensionais controladas de pares masculino-feminino (à esquerda) e pares do macho-macho (à direita) de T. californicus. Pontos sobre as trajetórias representam pontos de tempo (30 quadros por segundo). Bares = 10 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13: Diferença na velocidade média após a iniciação de guarda entre pares de macho-fêmea e macho-macho pares de T. californicus. Cada símbolo de triângulo representa dados de um par de testado. Bares e bigodes representam medianas e o intervalo interquartil, respectivamente. Média de velocidade do par no primeiro 3 s de guardar as tentativas foi maior para os pares do macho-macho (macho-fêmea (n = 13), macho-macho (n = 35). * * *p < 0,001 pelo teste de Mann-Whitney U). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 1: Efeito de lavagem tratamento sobre o comportamento de Tigriopus. Cada símbolo de círculo ou triângulo representa dados de um indivíduo testado ou par. Bares e bigodes representam medianas e o intervalo interquartil, respectivamente. Indivíduos em "enxaguada" e "não enxaguados" grupos foram tratados da mesma maneira, exceto que o grupo "não enxaguados" não tinha experiência para o tratamento de lavagem (etapa 2.1.3) antes que o tempo de ajuste de 30 minutos (passo 2.1.4). (A) a velocidade média dos machos enxaguados tendia a ser maior do que os machos não enxaguados (lavado (n = 6), não enxaguado (n = 6), n.s.: nenhuma diferença significativa foi detectada por U de Mann-Whitney test). A velocidade foi medida por 30 s, com base nos vídeos gravados após o tempo de ajuste. (B) a velocidade média de fêmeas enxaguadas tendia a ser maior do que as fêmeas não enxaguadas (lavado (n = 6), não enxaguado (n = 6), n.s.: nenhuma diferença significativa foi detectada por U de Mann-Whitney test). A velocidade foi medida por 30 s, com base nos vídeos gravados após o tempo de ajuste, seguindo o passo 4 (intervalo de rastreamento = 0,5 s). (C) frequência de guardar as tentativas foi maior para os pares de indivíduos enxaguados (lavado (n = 6), não enxaguado (n = 6). * * p < 0,01 pelo teste de Mann-Whitney U). (D) duração de guardar as tentativas tendia a ser maiores para os pares de indivíduos enxaguados (lavado (n = 6), não enxaguado (n = 6), n.s.: nenhuma diferença significativa foi detectada por U de Mann-Whitney test). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Cultivo individual e determinação do estágio e sexo
Aqui, descrevemos o método utilizado na nossa anterior estudo5 para preparar virgem Tigriopus animais com sua experiência de emparelhamento controlada enquanto o rastreamento de seu desenvolvimento (Figura 4 e Figura 7). Como espécie de Tigriopus é utilizado como animais de modelo em várias áreas biológicas, tais como toxicologia16,18, fisiologia ecológica19,20,21e evolutiva genética13,22,23,24, este método tem um potencial de fornecer um meio valioso para avaliar a influência de fatores genéticos e ambientais sobre o ciclo de vida destes copépodes.
Para alcançar a plataforma bem sucedida, procura regular e coleção de CI copepodids de uma cultura de massa (etapa 1.2) é crítica, pois coleta em fases posteriores pode resultar em mis encenação dos animais. Além disso, uma pesquisa completa para exúvia (etapa 1.3) também é essencial para estadiamento exato. Aumente a frequência de coleta e preparo, se necessário, como o intervalo entre mudas varia de um a vários dias dependendo da espécie e a criação de condição2,25,26. Diferenças na morfologia de antenas entre copepodids e as fêmeas adultas não são visivelmente significativas em algumas espécies e populações de Tigriopus16,25. Daí, a plataforma antes da sexagem é útil para distinguir as fêmeas adultas de copepodids avançado de ambos os sexos.
Testes comportamentais e análise manual das propriedades comportamentais
Em geral, uma das partes mais críticas dos estudos etológicos é definição e descrição de eventos de interesse. Os métodos apresentados neste artigo foram primeiramente desenvolvidos para nosso recente estudo5 e complementados com a descrição de cópula e os recursos visuais (Figura 10). Além disso, a consistência na manipulação de animais também desempenha um papel importante em experimentos comportamentais. Por exemplo, lavagem de copépodes potencialmente pode facilitar alguns aspectos do seu comportamento (Supplemental Figura 1) e, portanto, é desejável a ser executada de forma consistente entre amostras, tais como padronizado na etapa 2.1.3. Esperamos que os materiais fornecidos neste documento ajudará controlados e reprodutíveis de estudos sobre o comportamento do companheiro-guardando de Tigriopus, promovendo estudos reprodutivos e ecológicos deste abundante habitante das piscinas de maré alta.
Uma limitação possível com este método é baixa ampliação das imagens obtidas. Embora filmes gravados com nosso sistema permitam a identificação de estruturas proeminentes do corpo, incluindo urosomes e antenas primeiras masculinas, um pode não ser capaz de observar estruturas mais sutis, como pernas e genitália com nosso método, desde que não emprega ampliação microscópica para gravação de vídeo. Enquanto Kelly et al . reportou que eles foram capazes de observar o espermatóforo transferir de machos para fêmeas de T. japonicus sob uma observação microscópica na ampliação de 100 X (sem vídeo gravado)7, não fomos capazes de observar um espermatóforo em nossos filmes, talvez devido à limitação da resolução da imagem.
Rastreamento bidimensional de pares
Embora este método não permite rastreamento tridimensional dos animais, permite análise bidimensional trajetória de zooplâncton sem rotulagem quimicamente animais (cf. Lard et al 201027) utilizando programas distribuídos gratuitamente. Se o tamanho de um arquivo de filme é muito grande para ser processado no ImageJ, podemos reduzir a resolução do arquivo e convertê-lo em um filme de escala de cinza. Enquanto o método descrito foi originalmente desenvolvido para adultos pares de T. californicus (Figura 12 e Figura 13), também está disponível para pares de adulto-juvenil e únicos indivíduos (Supplemental Figura 1) como bem como outras espécies de Tigriopus em princípio. Esperamos ainda mais o método de fazer análise de trajetória aplicáveis a curto prazo (a partir de milissegundos para os segundo tempo escalas) de zooplâncton de outros táxons com ajustes apropriados.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por subsídios desde a Fundação da Sumitomo, Japão (Grant para projetos de pesquisa de ciência básica, conceder número: 150932) e pesquisa Instituto de invertebrados marinhos, Japão (bolsa de pesquisa individual de 2018) RSB, STI e uma concessão dos Estados Unidos Fundação Nacional de ciência (DEB-1556466) a RSB. Agradecemos a Sra. Kiana Michelle Woodward para feedback sobre o método de cultivo e preparo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
| PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
| Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
| Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
| Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
| LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
| Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
| P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
| ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
| MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |
References
- Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus. Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).
- Fraser, J. H. The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).
- Burton, R. S. Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).
- Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida). Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).
- Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus. PLoS ONE. 12 (8), e0183758 (2017).
- Ito, T. The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17 (3), 474-500 (1970).
- Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353 (1369), 737-744 (1998).
- Kelly, L. S., Snell, T. W. Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus. Marine Biology. 130 (4), 605-612 (1998).
- Peterson, D. L., et al. Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California. Journal of Biogeography. 40 (9), 1664-1675 (2013).
- Palmer, C. A., Edmands, S. Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 136 (4), 693-698 (2000).
- Ito, T. Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus. Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).
- Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus. Molecular Ecology Resources. 15 (4), 868-879 (2015).
- Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution. Molecular Ecology. 25 (7), 1478-1493 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics. Aquatic Toxicology. 83 (3), 161-173 (2007).
- Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus. Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).
- Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang. Marine and Freshwater Research. 59 (12), 1061-1066 (1933).
- McDonough, P. M., Stiffler, D. F. Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69 (2), 273-277 (1981).
- Hagiwara, A., Lee, C. -S., Shiraishi, D. J. Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities. Fisheries Science. 61 (4), 618-622 (1995).
- Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1853), 20170236 (2017).
- Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression. Molecular Biology and Evolution. 32 (3), 613-622 (2015).
- Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus. Journal of Evolutionary Biology. 28 (12), 2196-2207 (2015).
- Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes. Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).
- Koga, F. On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda). Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).
- Powlik, J. J. Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).
- Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton. PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).
