साथी की रखवाली व्यवहार जीनस Tigriopusके ज्वारीय copepods के प्रजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हालांकि, इस व्यवहार के अध्ययन के लिए विधियां अच्छी तरह से वर्णित नहीं किया गया है । यहां हम के लिए तरीकों का वर्णन: 1) वर्जिन Tigriopus पशुओं के व्यक्तिगत संस्कृति, और 2) उनके साथी की रखवाली व्यवहार की मात्रात्मक विश्लेषण ।
Copepods की जीनस Tigriopus, जो चट्टानी ज्वार पूल में आम zooplankton हैं, precopulatory मेट-पहरा व्यवहार जहां एक पुरुष एक जोड़ी बनाने के लिए एक संभावित दोस्त अकवार दिखाता है । हालांकि इस घटना ने शोधकर्ताओं की रुचि को आकर्षित किया है, इसके विश्लेषण के लिए तरीके भी नहीं बताए गए हैं । यहां हम के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन: 1) व्यक्तिगत संवर्धन और Tigriopus किशोरों और वयस्कों के मचान, और 2) वीडियो अपने साथी के विश्लेषण-व्यवहार की रखवाली आधारित है । संवर्धन विधि व्यवहार परीक्षणों से पहले उनके विकास को ट्रैक करने की क्षमता के साथ ही पशुओं के कतरन अनुभव के प्रायोगिक नियंत्रण में सक्षम बनाता है । विश्लेषण विधि साथी की रखवाली व्यवहार के कई पहलुओं की मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है, पुरुषों और मेट के तैराकी पथ-रक्षा जोड़े द्वारा प्रयास पर कब्जा भी शामिल है । हालांकि इन तरीकों मूलतः Tigriopusपर ethological अध्ययन के लिए स्थापित किए गए थे, उचित संशोधनों के साथ वे भी विभिंन अनुसंधान क्षेत्रों में अंय zooplankton के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, ऐसे फिजियोलॉजी, विषविज्ञान के रूप में, और पारिस्थितिकी आनुवंशिकी.
जीनस Tigriopus के ज्वारीय copepods व्यापक रूप से कई महाद्वीपों भर में चट्टानी उच्च ज्वार पूल में वितरित कर रहे हैं1। इन copepods अपने प्रजनन, जहां एक वयस्क पुरुष एक संभावित मेट (किशोर या वयस्क) का उपयोग अपनी झुका पहले एंटीना शयन करने से पहले के एक भाग के रूप में व्यवहार की रखवाली का प्रदर्शन (चित्रा 1 और चित्रा 2)2 ,3,4,5. हालांकि इस घटना के दशकों के लिए ethological और जैव रासायनिक अध्ययन के एक विषय रहा है2,3,6,7, सहित इस व्यवहार के अध्ययन के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं, वर्जिन जानवरों की व्यक्तिगत संस्कृति और व्यवहार की घटनाओं के मानदंड एक साथी की रक्षा करने का प्रयास में देखा, अच्छी तरह से वर्णित नहीं किया गया है । इस प्रकार, यहां हम तरीकों की स्थापना के लिए एक नियंत्रित प्रयोगात्मक पर्यावरण के तहत व्यवहार के अध्ययन को सक्षम करें ।
जानवरों के व्यक्तिगत संवर्धन और मचान
Tigriopus के प्रजनन के पिछले अध्ययन पारंपरिक एक जोड़ी अलग विधि नियोजित करने के लिए किशोर (copepodids) और व्यवहार परीक्षण और प्रजनन प्रयोग के लिए वयस्क महिलाओं को तैयार कार्यरत3,8,9 ,10. हालांकि, इस विधि जानवरों जोड़े फार्म और संभावित परीक्षणों से पहले मैथुन करना करने के लिए अनुमति देता है (इतो १९८८11में चर्चा), जो5जानवरों के व्यवहार गुण बदल सकते हैं । इसके अलावा, वहां भी है एक के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ copepods के विकास के चरणों ंयायाधीश की क्षमता के रूप में वे मचान के लिए स्पष्ट शरीर के आकार पर निर्भर हैं । इस पत्र में, हम एक व्यक्ति संवर्धन Tigriopus californicus5, जो जानवरों के बाँधना अनुभव को नियंत्रित करने और उनके विकास पर नज़र रखने के द्वारा इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था के साथ हमारे हाल के अध्ययन में इस्तेमाल विधि का वर्णन copepodid से वयस्क चरणों के लिए ।
मेट-गार्डिंग व्यवहार का मात्रात्मक विश्लेषण
Tigriopus प्रजातियों के साथी की रखवाली व्यवहार न केवल ethology के क्षेत्र में अध्ययन किया गया है2,6 लेकिन यह भी ecotoxicology और विकासवादी आनुवंशिकी के रूप में अन्य क्षेत्रों में3,4, 7 , 8 , 9 , 10. हालांकि, पिछले अध्ययनों ने इस व्यवहार के पाठ्यक्रम को मुख्य रूप से पर्याप्त दृश्य चित्रण के बिना लिखित रूप में समझाया है दोनों व्यवहार और यह अध्ययन करने के लिए तरीकों की रूपरेखा, जो तकनीकी बाधाओं के लिए बनाता है पुनरावृत्ति और अध्ययन की उंनति । यहां, हम मेट में प्रमुख घटनाओं में से कुछ की विस्तृत विवरण प्रदान Tigriopus copepods के व्यवहार की रक्षा दृश्य सामग्री द्वारा समर्थित । हम भी उपकरण और व्यवहार के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए तरीकों का प्रदर्शन । इन विधियों में ठीक प्रतिरूपित प्रयोगों में मेट-गार्डिंग प्रयास के दौरान जानवरों के व्यवहार गुणों का मूल्यांकन करने की अनुमति है ।
इन तरीकों के साथ हम जीनस Tigriopusके साथी की रखवाली व्यवहार पर नियंत्रण और reproducible अध्ययन के एक methodological आधार प्रदान करने के लिए लक्ष्य ।
व्यक्तिगत संवर्धन और मंच और सेक्स के निर्धारण
यहां हम हमारे पिछले अध्ययन5 में इस्तेमाल विधि का वर्णन करने के लिए उनकी बांधना अनुभव के साथ कुंवारी Tigriopus पशुओं को तैयार नियंत्रित जबकि उनके विकास (चित्रा 4 और चित्रा 7) ट्रैकिंग । के रूप में Tigriopus प्रजातियों जैसे विषविज्ञान16,18, पारिस्थितिकी फिजियोलॉजी19,20,21, और विकासवादी के रूप में विभिंन जैविक क्षेत्रों में मॉडल जानवरों के रूप में उपयोग किया जाता है आनुवंशिकी13,22,23,24, इस विधि में इन copepods के जीवन चक्र पर पर्यावरणीय और आनुवंशिक कारकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान साधन प्रदान करने के लिए एक संभावित है ।
सफल मचान प्राप्त करने के लिए, नियमित रूप से खोज और CI copepodids के संग्रह एक जन संस्कृति से (१.२ कदम) महत्वपूर्ण है, बाद के चरणों में संग्रह के रूप में परिणाम गलत हो सकता है जानवरों की मचान । इसके अलावा, exuviae के लिए एक गहन खोज (चरण १.३) भी सटीक मचान के लिए आवश्यक है । यदि आवश्यक हो तो संग्रह और स्टैगिंग की आवृत्ति बढ़ाएँ, के रूप में molts के बीच अंतराल प्रजातियों के आधार पर एक से कई दिनों के लिए भिन्न होता है और स्थिति2,25,26पालन. copepodids और वयस्क महिलाओं के बीच एंटेना आकृति विज्ञान में अंतर कुछ प्रजातियों और16,25 Tigriopusकी आबादी में दिख महत्वपूर्ण नहीं हैं. इसलिए, सीमन से पहले मचान के लिए या तो सेक्स के उंनत copepodids से वयस्क महिलाओं भेद मददगार है ।
व्यवहार परीक्षण और व्यवहार संपत्तियों के मैनुअल विश्लेषण
सामांय में, ethological अध्ययन के सबसे महत्वपूर्ण भागों में से एक परिभाषा और ब्याज की घटनाओं का वर्णन है । इस पेपर में शुरू किए गए तरीके पहले हमारे हाल के5 अध्ययन के लिए विकसित किए गए थे और शयन और विजुअल एड्स (चित्रा 10) के विवरण के साथ पूरक थे । इसके अलावा, पशु हैंडलिंग में निरंतरता भी व्यवहार प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, copepods के धोने संभवतः उनके व्यवहार (पूरक चित्रा 1) के कुछ पहलुओं की सुविधा हो सकती है और इसलिए नमूनों के बीच एक सुसंगत तरीके से किया जा करने के लिए वांछनीय है, जैसे कदम 2.1.3 में मानकीकृत । हम इस पत्र में उपलब्ध कराई गई सामग्री की उंमीद Tigriopusके साथी की रखवाली व्यवहार पर नियंत्रण और reproducible अध्ययन की सहायता करेगा, उच्च ज्वार पूल के इस प्रचुर मात्रा में निवासी के प्रजनन और पारिस्थितिक अध्ययन को बढ़ावा देने ।
इस विधि के साथ एक संभव सीमा प्राप्त छवियों का इज़ाफ़ा कम है । हालांकि हमारे सिस्टम के साथ दर्ज की गई फिल्मों urosomes और पुरुष पहले एंटीना सहित प्रमुख शरीर संरचनाओं की पहचान की अनुमति, एक ऐसे पैर और हमारे विधि के साथ जननांग के रूप में अधिक सूक्ष्म संरचनाओं का पालन करने में सक्षम नहीं हो सकता है क्योंकि यह काम नहीं करता है वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए सूक्ष्म आवर्धन । जबकि केली एट अल. ने बताया कि वे 100X आवर्धन पर एक सूक्ष्म प्रेक्षण के तहत पुरुषों से japonicus की महिलाओं के लिए spermatophore हस्तांतरण का निरीक्षण करने में सक्षम थे (कोई वीडियो दर्ज)7, हम एक का निरीक्षण करने में सक्षम नहीं किया गया है हमारी फिल्मों में spermatophore, शायद छवि संकल्प की सीमा के कारण ।
जोड़े की दो आयामी ट्रैकिंग
हालांकि इस विधि जानवरों की तीन आयामी ट्रैकिंग की अनुमति नहीं है, यह रासायनिक लेबलिंग जानवरों के बिना zooplankton के दो आयामी पथ विश्लेषण सक्षम बनाता है (cf. चरबी एट al. २०१०27) के उपयोग से मुक्त करने के लिए वितरित कार्यक्रम । यदि चलचित्र फ़ाइल का आकार ImageJ में संसाधित किए जाने के लिए बहुत बड़ा है, तो एक फ़ाइल का रिज़ॉल्यूशन कम कर सकता है और उसे धूसर स्केल चलचित्र में कनवर्ट कर देता है । जबकि वर्णित विधि मूल रूप से californicus (चित्रा 12 और चित्रा 13) के वयस्क जोड़े के लिए विकसित किया गया था, यह वयस्क किशोर जोड़े और एकल व्यक्तियों के लिए भी उपलब्ध है (पूरक चित्रा 1) के रूप में अच्छी तरह से सिद्धांत रूप में अंय Tigriopus प्रजातियों । हम आगे विधि अल्पकालिक करने के लिए लागू होने की उंमीद (मिलीसेकंड से दूसरी बार तराजू) उचित समायोजन के साथ अंय taxa के zooplankton के पथ विश्लेषण ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम सुमितोमो फाउंडेशन, जापान (बुनियादी विज्ञान अनुसंधान परियोजनाओं के लिए अनुदान, अनुदान संख्या: १५०९३२) और समुद्री अकशेरूकीय, जापान (२०१८ व्यक्तिगत अनुसंधान अनुदान) के अनुसंधान संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित है STI और RSB, और अमेरिका से एक अनुदान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (देब-१५५६४६६) को RSB । हम संवर्धन और मचान विधि पर प्रतिक्रिया के लिए सुश्री कियाना मिशेल वुडवर्ड धंयवाद ।
Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands. Inc. | SS1-160P | For preparation of culture medium |
PRO PlecoWafers | Tetra | 16447 | Food for copepods (used after being ground in a mortar) |
Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353224 | Container for culture of gravid females and hatched nauplii |
Flat bottom 24-well cell culture plate with lid | Corning Co., Ltd. | 353226 | Container for individual culturing |
Flat bottom 48-well cell culture plate with lid | Nest Biotechnology Co., Ltd. | 748001 | Behavioral observation chambers |
LED light pad | Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. | Litup LP4 | Backlight for behavioral observation |
Camera | Canon | 0591C003 (model: Rebel T6i) | For recording of behavior |
Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | For transfer of copepods |
P10 micropipette tips | VWR | 613-0735 | For transfer of C1 stage copepodids |
ImageJ | NIH | Version 1.49t | For semi-automatic analysis of movies |
MTrackJ | Version 1.5.1 | ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands) |