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व्यक्तिगत संवर्धन के Tigriopus Copepods और मात्रात्मक विश्लेषण के अपने साथी की रखवाली व्यवहार

doi: 10.3791/58378 Published: September 26, 2018

Summary

साथी की रखवाली व्यवहार जीनस Tigriopusके ज्वारीय copepods के प्रजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हालांकि, इस व्यवहार के अध्ययन के लिए विधियां अच्छी तरह से वर्णित नहीं किया गया है । यहां हम के लिए तरीकों का वर्णन: 1) वर्जिन Tigriopus पशुओं के व्यक्तिगत संस्कृति, और 2) उनके साथी की रखवाली व्यवहार की मात्रात्मक विश्लेषण ।

Abstract

Copepods की जीनस Tigriopus, जो चट्टानी ज्वार पूल में आम zooplankton हैं, precopulatory मेट-पहरा व्यवहार जहां एक पुरुष एक जोड़ी बनाने के लिए एक संभावित दोस्त अकवार दिखाता है । हालांकि इस घटना ने शोधकर्ताओं की रुचि को आकर्षित किया है, इसके विश्लेषण के लिए तरीके भी नहीं बताए गए हैं । यहां हम के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन: 1) व्यक्तिगत संवर्धन और Tigriopus किशोरों और वयस्कों के मचान, और 2) वीडियो अपने साथी के विश्लेषण-व्यवहार की रखवाली आधारित है । संवर्धन विधि व्यवहार परीक्षणों से पहले उनके विकास को ट्रैक करने की क्षमता के साथ ही पशुओं के कतरन अनुभव के प्रायोगिक नियंत्रण में सक्षम बनाता है । विश्लेषण विधि साथी की रखवाली व्यवहार के कई पहलुओं की मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है, पुरुषों और मेट के तैराकी पथ-रक्षा जोड़े द्वारा प्रयास पर कब्जा भी शामिल है । हालांकि इन तरीकों मूलतः Tigriopusपर ethological अध्ययन के लिए स्थापित किए गए थे, उचित संशोधनों के साथ वे भी विभिंन अनुसंधान क्षेत्रों में अंय zooplankton के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, ऐसे फिजियोलॉजी, विषविज्ञान के रूप में, और पारिस्थितिकी आनुवंशिकी.

Introduction

जीनस Tigriopus के ज्वारीय copepods व्यापक रूप से कई महाद्वीपों भर में चट्टानी उच्च ज्वार पूल में वितरित कर रहे हैं1। इन copepods अपने प्रजनन, जहां एक वयस्क पुरुष एक संभावित मेट (किशोर या वयस्क) का उपयोग अपनी झुका पहले एंटीना शयन करने से पहले के एक भाग के रूप में व्यवहार की रखवाली का प्रदर्शन (चित्रा 1 और चित्रा 2)2 ,3,4,5. हालांकि इस घटना के दशकों के लिए ethological और जैव रासायनिक अध्ययन के एक विषय रहा है2,3,6,7, सहित इस व्यवहार के अध्ययन के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं, वर्जिन जानवरों की व्यक्तिगत संस्कृति और व्यवहार की घटनाओं के मानदंड एक साथी की रक्षा करने का प्रयास में देखा, अच्छी तरह से वर्णित नहीं किया गया है । इस प्रकार, यहां हम तरीकों की स्थापना के लिए एक नियंत्रित प्रयोगात्मक पर्यावरण के तहत व्यवहार के अध्ययन को सक्षम करें ।

जानवरों के व्यक्तिगत संवर्धन और मचान

Tigriopus के प्रजनन के पिछले अध्ययन पारंपरिक एक जोड़ी अलग विधि नियोजित करने के लिए किशोर (copepodids) और व्यवहार परीक्षण और प्रजनन प्रयोग के लिए वयस्क महिलाओं को तैयार कार्यरत3,8,9 ,10. हालांकि, इस विधि जानवरों जोड़े फार्म और संभावित परीक्षणों से पहले मैथुन करना करने के लिए अनुमति देता है (इतो १९८८11में चर्चा), जो5जानवरों के व्यवहार गुण बदल सकते हैं । इसके अलावा, वहां भी है एक के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ copepods के विकास के चरणों ंयायाधीश की क्षमता के रूप में वे मचान के लिए स्पष्ट शरीर के आकार पर निर्भर हैं । इस पत्र में, हम एक व्यक्ति संवर्धन Tigriopus californicus5, जो जानवरों के बाँधना अनुभव को नियंत्रित करने और उनके विकास पर नज़र रखने के द्वारा इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था के साथ हमारे हाल के अध्ययन में इस्तेमाल विधि का वर्णन copepodid से वयस्क चरणों के लिए ।

मेट-गार्डिंग व्यवहार का मात्रात्मक विश्लेषण

Tigriopus प्रजातियों के साथी की रखवाली व्यवहार न केवल ethology के क्षेत्र में अध्ययन किया गया है2,6 लेकिन यह भी ecotoxicology और विकासवादी आनुवंशिकी के रूप में अन्य क्षेत्रों में3,4, 7 , 8 , 9 , 10. हालांकि, पिछले अध्ययनों ने इस व्यवहार के पाठ्यक्रम को मुख्य रूप से पर्याप्त दृश्य चित्रण के बिना लिखित रूप में समझाया है दोनों व्यवहार और यह अध्ययन करने के लिए तरीकों की रूपरेखा, जो तकनीकी बाधाओं के लिए बनाता है पुनरावृत्ति और अध्ययन की उंनति । यहां, हम मेट में प्रमुख घटनाओं में से कुछ की विस्तृत विवरण प्रदान Tigriopus copepods के व्यवहार की रक्षा दृश्य सामग्री द्वारा समर्थित । हम भी उपकरण और व्यवहार के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए तरीकों का प्रदर्शन । इन विधियों में ठीक प्रतिरूपित प्रयोगों में मेट-गार्डिंग प्रयास के दौरान जानवरों के व्यवहार गुणों का मूल्यांकन करने की अनुमति है ।

इन तरीकों के साथ हम जीनस Tigriopusके साथी की रखवाली व्यवहार पर नियंत्रण और reproducible अध्ययन के एक methodological आधार प्रदान करने के लिए लक्ष्य ।

Protocol

1. व्यवहार अवलोकन के लिए वर्जिन जानवरों की तैयारी

  1. निषेचित अंडे प्राप्त करने और उंहें हैच करने की अनुमति ।
    1. ले लीजिए gravid मादा स्पष्ट नारंगी (यानी, निषेचित और विकास के उंनत चरणों में) अंडे (चित्रा 3सी) एक पाश्चर पिपेट के साथ एक शेयर संस्कृति से । महिलाओं के लिए धीरे से कुल्ला उंहें स्वच्छ संस्कृति माध्यम में pipetting nauplial लार्वा है कि संस्कृति में रचा हो सकता है सहित अंय पशुओं के हस्तांतरण से बचने के लिए ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, ३५% की एक लवणता के साथ कृत्रिम समुद्री जल संस्कृति माध्यम के रूप में प्रयोग किया जाता है । प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर विभिन्न माध्यमों (जैसे कृत्रिम समुद्री जल एक उच्च लवणता या एक अतिरिक्त घुला हुआ पदार्थ) का उपयोग करें ।
      नोट: californicusकी प्राकृतिक आबादी के संग्रह स्थलों के उदाहरण के लिए प्रयोगशाला संस्कृति भंडार और परेरा एट अल. २०१६13 की स्थापना के लिए एक विधि के लिए Barreto एट अल. २०१५12 देखें । पीटरसन एट अल. इसके अलावा अक्षांश और देशांतर जानकारी9के साथ californicus, टी fulvus, और टी japonicus के अपने संग्रह साइटों की सूचना दी । रॉक पूल से Tigriopus copepods इकट्ठा करने के लिए लगभग 30-50 मिलीलीटर की क्षमता के साथ प्लास्टिक पिपेट का प्रयोग करें ।
    2. प्रत्येक महिला को व्यक्तिगत रूप से एक अच्छी तरह से स्वच्छ संस्कृति माध्यम के साथ एक 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में प्लेस (4 चित्रा, बाएं) । सुनिश्चित करें कि कोई अंय जानवर (nauplial लार्वा सहित) अच्छी तरह से दूषित हो रहा है ।
    3. बनाए रखने के एक मशीन में प्लेटें 20 डिग्री सेल्सियस पर एक 12 घंटे की रोशनी के साथ संस्कृति को अंधेरे चक्र महिलाओं जब तक वे अंडे sacs जारी । इस कदम को आम तौर पर प्रजातियों और भ्रूण के विकास के चरणों के आधार पर एक से दस दिन लगते हैं । इस बीच, प्रत्येक gravid महिला को सप्ताह में दो बार बारीकी से जमीन (लगभग < ०.५ mm के व्यास में) मछली खाना (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) के साथ फ़ीड करें ।
      नोट: एक प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर विभिन्न तापमान और प्रकाश चक्र का उपयोग करें. उच्च तापमान भ्रूण के अधिक तेजी से विकास की सुविधा कर सकते हैं ।
      नोट: कुओं में अतिरिक्त भोजन चरमरा जाने से बचें. यदि भोजन का मलबा क्षय होने लगता है तो उसे कुएं से बाहर पिपेट पाश्चर पिपेट ।
    4. अंडा sacs के बाद जारी कर रहे हैं, एक पाश्चर पिपेट के साथ संस्कृति कुओं से महिलाओं को हटा दें ।
      नोट: Inseminated महिलाओं वंश2,3के कई चंगुल पैदा करने में सक्षम हैं । यदि आवश्यक हो, तो अन्य कुओं में महिलाओं को स्थानांतरित करने के लिए आगे चंगुल इकट्ठा ।
  2. व्यक्तिगत संस्कृति के लिए copepodids लीजिए ।
    1. जब तक वे पहली copepodid (CI) चरण (चित्रा 4, मध्य) को विकसित करने के लिए मशीन और संस्कृति nauplii में रची nauplii के साथ प्लेट रखें । इस चरण में सामान्यतः एक से दो सप्ताह तक का समय लगता है. हर दो दिन में एक बार CI जानवरों के लिए खोज करते हुए पतले जमीन मछली के भोजन के कई अनाज के साथ एक अच्छी तरह से फ़ीड । आसुत जल के साथ पानी के पीछे भाप से भरा फिर से भरना ।
      नोट: अगर तैरते मलबे को देखने नुकसान पहुंचा, यह कागज तौलिया का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ मलाई उतारा ।
    2. जैसे ही CI पशुओं के उभरने के लिए शुरू, उंहें एक पी के साथ कुओं से इकट्ठा-10 micropipette अपनी pipetting मात्रा लगभग 8 µ एल पर सेट के साथ, एक stereomicroscope के तहत 10x में 40X आवर्धन (चित्रा 4, सही) । धीरे से स्वच्छ कृत्रिम समुद्री जल में यह pipetting द्वारा प्रत्येक CI जानवर धो और यह 24 के एक अच्छी तरह से सेल संस्कृति 2-3 मिमी गहराई युक्त थाली (लगभग 400-600 µ एल) कृत्रिम समुद्री जल के रूप में जगह है ।
      नोट: व्यक्तिगत संस्कृति के लिए कुओं में nauplial exuviae या अन्य जानवरों पर ले जाने से बचें ।
  3. molted exuviae गिनती के द्वारा व्यक्तियों के ट्रैक विकास ।
    1. प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से molted exuviae के लिए हर दो तीन दिनों के अंदर की जांच करें (आवृत्ति को समायोजित अगर जरूरत) stereomicroscopic अवलोकन द्वारा एक काले क्षेत्र रोशनी में 10x 40X आवर्धन के तहत । copepodids के Exuviae पारदर्शी और bristled पैरों के साथ पहचानने योग्य हैं, caudal रामी की एक जोड़ी (यानी, caudal अंत में पतली फैलाई संरचनाओं), और/या कुछ और urosome (चित्रा 5) के विभाजन । एक अच्छी तरह से (चित्रा 6A) में अलग गहराई पर exuviae का पता लगाने के लिए ध्यान और प्रदीप्ति बदलें.
      नोट: Molted exuviae जानवर है कि उंहें Molted है की तुलना में छोटे हैं । एक जानवर और उसके अपेक्षाकृत हाल ही में exuviae और पुराने (यानी, छोटे) exuviae के लिए उच्च आवर्धन के लिए बदलाव के लिए कम आवर्धन से परीक्षा शुरू करो ।
      नोट: एक अच्छी तरह से क्षतिग्रस्त कर रहे हैं में exuviae, विकास के चरणों के फैसले से बचने के लिए आगे विकास ट्रैकिंग से अच्छी तरह से खत्म.
      नोट: यदि अस्थायी मलबे नुकसान पहुंचा दृश्य (चित्रा घमण्ड), यह कागज तौलिया का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ मलाई उतारा ।
    2. प्लेट लिड (चित्रा 7) पर एक टैली मार्क के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से copepodid exuviae की कुल संख्या रिकॉर्ड करें । मार्क के लिए एक पंक्ति जोड़ें के रूप में एक नया exuviae कुआं में पाया जाता है ।
      नोट: अगर वेल में nauplial exuviae दूषित हैं तो उन्हें काउंट से खत्म करें ।
    3. बारीकी से जमीन मछली खाना के दो अनाज के साथ प्रत्येक व्यक्ति को खिलाओ । रिफिल पानी आसुत जल के साथ लवणता बनाए रखने के लिए पानी के पीछे काफूर ।
      नोट: फ़ीड copepodids हर दो तीन दिनों के लिए उंहें उपभोक्ता और हानिकारक molted exuviae, जो संभवतः विकासात्मक चरण (चरण 1.3.4) के आकलन को प्रभावित कर सकता से रोकने के लिए ।
    4. exuviae की संख्या के आधार पर पशु का हमरा विकासात्मक चरण । यदि कोई exuviae नहीं है, तो व्यक्ति को सीआई स्तर पर होने का अनुमान है । यदि एक से चार exuviae हैं, तो व्यक्ति को सीआईआई में सीवी चरणों का अनुमान है । यदि पांच exuviae हैं, तो व्यक्ति को वयस्क होने का अनुमान है ।
  4. आकृति विज्ञान के आधार पर वयस्कों के सेक्स की पहचान ।
    1. उनकी आकृति विज्ञान की जांच करके सेक्स जानवरों । वयस्क Tigriopus नर बाहर के अंत (चित्रा 3ए) में कांटे की शकल और गोलाकार संरचनाओं के साथ geniculate पहले एंटीना के अधिकारी । वयस्क महिलाओं पुरुषों की तुलना में चिकनी और अपेक्षाकृत पतले पहले एंटीना (चित्र बी) के अधिकारी । कुछ महिलाओं को भी अपने शरीर में जननांगों लिपिड से गहरे हरे रंग का प्रदर्शन (चित्र 3बी, 3d) ।
    2. सेक्स को अच्छी तरह से (फिगर 7B) के ढक्कन पर मार्क करें ।

2. व्यवहार परीक्षण और साथी की रखवाली व्यवहार की वीडियो रिकॉर्डिंग

  1. एक परीक्षण के दिन पर, एक व्यवहार परीक्षण के लिए वांछित चरण और सेक्स के जानवरों का चयन करें ।
    1. संस्कृति कुओं में पतले जमीन मछली खाना के साथ चयनित व्यक्तियों फ़ीड और उंहें 30 मिनट के लिए खाने के लिए अनुमति देते हैं । इस बीच, परीक्षण कक्षों को तैयार करने के लिए 2.1.2 चरण पर आगे बढ़ें ।
    2. तैयार २ ४८-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे कक्ष संस्कृति प्लेट्स परीक्षण कक्षों के रूप में; एक थाली (इसके बाद बुलाया "प्लेट A") पुरुषों और अंय के लिए है ("प्लेट बी") लक्ष्य के लिए है (जैसे copepodids, वयस्क महिलाओं, वयस्क पुरुषों) । प्लेटों के कुओं में ३५% की एक लवणता के साथ स्वच्छ कृत्रिम समुद्री जल के ४०० µ एल जोड़ें । एक एलईडी प्रकाश एक प्रकाश विसारक (8 अंक) के रूप में एक पारदर्शी एक्रिलिक बोर्ड के साथ कवर पैड पर प्लेट रखें ।
      नोट: प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर विभिन्न माध्यमों का उपयोग करें ।
      नोट: अतिरिक्त गर्मी से बचने के लिए, एक backlight के रूप में गरमागरम या फ्लोरोसेंट लैंप का उपयोग नहीं करते ।
    3. 30 के बाद ंयूनतम खिला समय 2.1.1 में वर्णित है, धीरे से प्रत्येक जानवर कुल्ला एक 24 के चार कुओं के उत्तराधिकार में अच्छी तरह से साफ कृत्रिम समुद्री जल से भरा थाली (9 अंक) को रोकने के लिए ले जाने के मलबे और संस्कृति कुओं से exuviae ।
    4. एलईडी लाइट पैड पर प्लेट ए और बी के कुंए में कुल्ला करने वाले व्यक्तियों को रखें । कुओं के लिए पशुओं के समायोजन के लिए 30 मिनट की अनुमति दें ।
    5. समायोजन अवधि (चित्रा 8) के दौरान एक प्लेट के ऊपर एक वीडियो कैमरा सेट करें । एक तिपाई या एक स्टैंड का उपयोग करने के लिए कैमरे पकड़ ।
    6. प्लेट A के अंदर पुरुषों पर कैमरे के एंटीना के एक अवलोकन की अनुमति के लिए ध्यान केंद्रित.
      नोट: फिल्मों में backlight के फ़्लिकर को कम करने के लिए, एक फ्रेम दर के बराबर या एक बिजली आवृत्ति के आधे सेट और अब जोखिम समय का उपयोग करें । इसके अलावा, एलईडी प्रकाश पैड चरण 2.1.2 में वर्णित के रूप में एक पारदर्शी एक्रिलिक बोर्ड के साथ कवर रखें ।
  2. चरण 2.1.4 में वर्णित समायोजन अवधि के बाद, वीडियो रिकॉर्डिंग और व्यवहार परीक्षण प्रारंभ करें ।
    1. एक पाश्चर पिपेट के साथ प्लेट बी से प्लेट ए करने के लिए लक्ष्य हस्तांतरण । यदि प्रयोग मध्यम में रासायनिक घटकों के प्रति संवेदनशील है, तो प्रत्येक परीक्षण युग्म के लिए पिपेट बदलें ।
      नोट: जब प्लेट बी से एक जानवर pipetting, पानी में गड़बड़ी जानवर को उत्तेजित और अपने अतिरिक्त आंदोलन को बढ़ावा देने के रूप में कर सकते हैं के रूप में एक पाश्चर पिपेट के साथ जल में पीछा नहीं करते. पानी की सतह से थोड़ा ऊपर पिपेट के एक टिप पकड़ो और व्यक्ति को टिप के नीचे आने के लिए रुको । धीरे से यह कृत्रिम समुद्री जल की एक छोटी राशि के साथ पिपेट और फिर इसे एक अच्छी तरह से प्लेट a पर बेदखल ।
    2. एक प्रायोगिक योजना के अनुसार, एक पुरुष और एक लक्ष्य के लिए एक अच्छी तरह से अवलोकन समय (जैसे 10 मिनट) के हस्तांतरण के बाद एक वांछित अवधि के लिए बातचीत के लिए अनुमति देते हैं ।
    3. अवलोकन के समय के बाद वीडियो रिकॉर्डिंग रोकें । यदि आवश्यक हो, कैमरे से दर्ज की गई फिल्मों को एक कंप्यूटर पर डाउनलोड करें ।

3. व्यवहार संपत्तियों का मैनुअल विश्लेषण

  1. समय के लिए फिल्म की जांच करें जब प्रत्येक लक्ष्य प्लेट ए पर अच्छी तरह से हस्तांतरित किया गया था ।
  2. ब्याज की घटनाओं की दीक्षा और समाप्ति के समय की जांच करें और अवधि, विलंबता, और घटनाओं की आवृत्ति की गणना ।
    1. लक्ष्य के किसी भी शरीर के हिस्से के साथ पुरुष एंटीना के एक संपर्क के रूप में एक पुरुष द्वारा की रखवाली प्रयास की दीक्षा को परिभाषित (चित्रा 10, ऊपर छोड़ दिया). antennal संपर्क अक्सर एक स्विफ्ट (< 0.5 s) चेस या झपट्टा से पहले होता है ।
    2. एक बिंदु के रूप में की रक्षा करने का प्रयास की समाप्ति को परिभाषित जब एक लक्ष्य (10 चित्रा, ऊपर सही) के शरीर से पुरुष अलग के दोनों एंटेना । के रूप में प्रयास की रक्षा की आवृत्ति की गणना:
      Equation
    3. एक पुरुष है कि महिला के खिलाफ एक urosome की एक दोहराव प्रेस द्वारा पीछा किया जाता है की एक पृष्ठीय शरीर मोड़ द्वारा शयन की दीक्षा परिभाषित (आंकड़ा 10, नीचे सही) । धक्का की आवृत्ति प्रति सेकंड कई बार है ।
      नोट: एक पहरा पुरुष शयन करने से पहले एक महिला के शरीर के caudal अंत करने के लिए नीचे क्रॉल (चित्रा 10, नीचे छोड़ दिया) ।
    4. 3.2.4 में वर्णित घटनाओं के बाद urosomes की टुकड़ी द्वारा शयन की समाप्ति को परिभाषित करें ।
      नोट: शयन आम तौर पर टी. californicus और टी. japonicusके मामलों में कई मिनट के लिए जगह लेता है ।

4. व्यक्तियों और जोड़े की दो आयामी ट्रैकिंग

  1. एक वीडियो क्लिप के हित के एक प्रकरण की विशेषता उत्पंन (एक गार्ड का प्रयास के पहले 3 एसउदाहरण के लिए) फिल्म संपादन सॉफ्टवेयर के साथ कदम 2 में दर्ज की फिल्म trimming द्वारा ।
  2. ImageJ14 से स्थापित करें: https://imagej.nih.gov/ij/download.html । तो MTrackJ डाउनलोड, एक प्रस्ताव ImageJ15के लिए प्लगइन ट्रैकिंग पर निर्देशों का पालन करके: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/।
  3. ओपन ImageJ और ब्याज की एक फिल्म आयात (जैसे, फ़ाइल > आयात > QuickTime का उपयोग; छवि प्रसंस्करण के लिए आवश्यक स्मृति को कम करने के लिए "कंवर्ट 8-बिट ग्रेस्केल" चुनें) ।
  4. स्थानिक और समय अंशांकन निष्पादित करें ।
    1. स्थानिक अंशांकन के लिए ImageJ विंडो में सीधी लाइन चयन उपकरण का चयन करें ।
    2. एक ज्ञात लंबाई के साथ एक वस्तु के साथ एक चयन लाइन ड्रा (एक अच्छी तरह से) फिल्म खिड़की में व्यासजैसे
    3. "सेट स्केल" मेनू खोलें (विश्लेषण > सेट स्केल) । "ज्ञात दूरी" बॉक्स में ज्ञात लंबाई दर्ज करें और इसकी इकाई (उदा. mm) "लंबाई की इकाई" बॉक्स में । अंय वीडियो क्लिप्स के लिए स्केल का उपयोग करने के लिए "वैश्विक" चेकबॉक्स क्लिक करें ।
    4. समय अंशांकन के लिए "गुण" मेनू (छवि > गुण) खोलें । "फ़्रेम अंतराल" बॉक्स में फ़्रेम अंतराल (फ़्रेम दर का पारस्परिक) दर्ज करें ।
  5. MTrackJ के साथ ट्रैकिंग कॉंफ़िगर करें ।
    1. Plugins से MTrackJ प्लगइन > MTrackJ पर ImageJ खोलें । एक ट्रैकिंग कॉन्फ़िगरेशन मेनू खोलने के लिए MTrackJ संवाद विंडो में "ट्रैकिंग" बटन पर क्लिक करें ।
    2. "बिंदु जोड़ने के बाद अगली बार अनुक्रमणिका में ले जाएं" और कॉंफ़िगरेशन संवाद विंडो में "समय चरण आकार" बॉक्स में कोई संख्या दर्ज करके एक ट्रैकिंग अंतराल सेट करें । फ़्रेम-दर-फ़्रेम ट्रैकिंग निष्पादित करने के लिए, "समय चरण आकार" बॉक्स में "1" दर्ज करें ।
    3. जांच "ट्रैकिंग के दौरान स्थानीय कर्सर तड़क लागू करें" और एक स्नैप सुविधा के रूप में "डार्क केन्द्रक" चुनें । इस विकल्प के एक कर्सर के आसपास एक पता लगाने वर्ग ("स्नैप रेंज") के भीतर एक अंधेरे वस्तु (यानी, एक व्यक्ति या एक जोड़ी) के केन्द्रक का एक स्वत: पता लगाने की अनुमति देता है । फिल्म (उदा. 31 x 31 पिक्सेल) में एक पूरी जोड़ी या जानवर को कवर करने के लिए वर्ग का एक आकार चुनें ।
    4. चुने गए विकल्पों को लागू करने के लिए "ठीक" क्लिक करें ।
  6. दो-आयामी ट्रैकिंग निष्पादित करें ।
    1. ट्रैकिंग प्रारंभ करने के लिए MTrackJ संवाद विंडो में "जोड़ें" बटन क्लिक करें ।
    2. एक जोड़ी या एक व्यक्ति को ट्रैक किया जा करने के लिए कवर करने के लिए एक कर्सर (डिटेक्शन स्क्वायर) प्लेस । वर्ग के भीतर वस्तु के गहरे केन्द्रक का पता लगाने के लिए क्लिक करें ।
    3. फ़्रेम की एक इच्छित संख्या के लिए चरण 4.6.2 दोहराएँ ।
    4. डेटा तालिकाओं को जनरेट करने के लिए, MTrackJ संवाद विंडो में "माप" बटन क्लिक करें । डेटा दो खिड़कियों में प्रदर्शित किया जाता है: "MTrackJ: पटरियों" खिड़की ट्रैक दो आयामी पथ का एक सारांश से पता चलता है और "MTrackJ: अंक" हर समय बिंदु के लिए विस्तृत डेटा से पता चलता है. प्रत्येक तालिका को सहेजने के लिए, फ़ाइल चुनें > ImageJ पर मेनू के रूप में सहेजें.. ।
      नोट: प्रत्येक डेटा स्तंभ के विवरण के लिए डेवलपर (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) द्वारा प्रदान किए गए ऑनलाइन मैनुअल को देखें ।
    5. एक रंगीन लाइन के रूप में तैयार ट्रैक पथ के साथ एक फिल्म उत्पंन करने के लिए, MTrackJ संवाद विंडो में "मूवी" बटन पर क्लिक करें । जनरेटेड चलचित्र सहेजने के लिए, फ़ाइल चुनें > ImageJ पर मेनू के रूप में सहेजें.. ।
  7. पूरे रिजल्ट को सेव कर लीजिये. डेटा (चरण 4.6.4) और ट्रैक किए गए दो-आयामी पथ (चरण 4.6.2 और 4.6.3) सहित परिणामों को सहेजने के लिए MTrackJ संवाद विंडो में "सहेजें" बटन पर क्लिक करें.

Representative Results

व्यक्तिगत संवर्धन विधि चरण 1 में वर्णित तैयारी और बाँधना का कोई पूर्व अनुभव के साथ कुंवारी जानवरों के मचान की अनुमति देता है ।

चरण 2 में वर्णित व्यवहार परीक्षण वीडियो रिकॉर्डिंग और Tigriopus copepods के साथी की रखवाली व्यवहार की निगरानी की अनुमति देता है । चरण 3 और 4 में वर्णित विधियों के साथ रिकॉर्ड किए गए वीडियो की निंन परीक्षा में चित्र 1में दिखाए गए व्यवहार के कई पहलुओं का मात्रात्मक विश्लेषण सक्षम करता है ।

चित्रा 11 californicusके पुरुष-महिला जोड़े और पुरुष-पुरुष जोड़े के बीच प्रयास की रक्षा की औसत अवधि में एक अंतर से पता चलता है । एक मैनुअल विश्लेषण से यह दर्शाया गया कि पुरुष-पुरुष जोड़े नर-मादा जोड़े से बाँधने की अपेक्षाकृत कम अवधि दर्शाते हैं.

विश्लेषण विधि के साथ ट्रैक किए गए पथ के उदाहरण 12 चित्रा में प्रस्तुत कर रहे हैं और वेग विश्लेषण का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 13में दिखाया गया है. californicus के नव गठित गार्डिंग जोड़े के दो आयामी स्थानिक ट्रैकिंग से पता चला कि पुरुष-पुरुष जोड़े की रक्षा के प्रयास के पहले 3 एस में पुरुष महिला जोड़े की तुलना में उच्च वेग दिखाने के लिए खड़ा था ।

Figure 1
चित्रा 1: Tigriopusमें साथी की रखवाली व्यवहार । (एक) एक वयस्क पुरुष पहले एंटीना के साथ एक किशोर (copepodid) अकवार (नीले तीर से संकेत). बार = 1 मिमी. (ख) मेट की रखवाली व्यवहार की एक रूपरेखा. एक पुरुष एक लक्ष्य व्यक्ति पर कब्जा करने की कोशिश करता है (बाएं) और इसके साथ एक जोड़ी रूपों (मध्य) । पुरुष-पुरुष जोड़े में और कुछ नर-मादा जोड़े, शयन के बिना एक पहरा लगाने का प्रयास समाप्त हो जाता है. यह आंकड़ा Tsuboko-Ishii और बर्टन २०१७5से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Tigriopusके विकास के चरणों । Tigriopus प्रजातियों आम तौर पर छह nauplius चरणों (NI से NVI), पांच copepodid चरणों (CI से CV), और एक वयस्क चरण (CVI)16से गुजरना । नर copepodids ( japonicus में सीआई और टी. fulvus6,17 और सीआईआई में californicuएस3), के रूप में अच्छी तरह से दोनों लिंगों के वयस्कों के लिए के एक प्रारंभिक चरण से किशोरों के लिए प्रयास की रक्षा करना5 . यह आंकड़ा Tsuboko-Ishii और बर्टन २०१७5से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: वयस्कों (californicus) के आकृति विज्ञान । (क) वयस्क पुरुष । (ख) वयस्क स्त्री । (ग) निषेचित और विकसित (साफ नारंगी) अंडे के साथ एक अंडा थैली के साथ Gravid वयस्क महिला । (घ) Gravid के साथ एक अंडा थैली के साथ वयस्क मादा unfertiliz या अविकसित (गहरे हरे रंग) अंडे । तीर अंडे sacs संकेत मिलता है । बार = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 4
चित्रा 4: व्यक्तिगत संस्कृति के लिए तैयार करने की रूपरेखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा ५: Molted exuviae. (क) Exuviae सीआई से californicusके एक भी जानवर के CV चरणों में । बार = 1 मिमी. (ख) CI से Exuviae एक व्यक्ति संस्कृति में अच्छी तरह से CV चरणों के लिए । सफेद मलबे एक अच्छी तरह से (छवि में नहीं दिखाया गया है) में संस्कृति जानवर का मलमूत्र है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: एक stereomicroscope के तहत exuviae के लिए खोज । सलाखों = 1 मिमी. (क) अलग गहराई पर exuviae का पता लगाने के लिए एक stereomicroscope के फोकल परिवर्तन । रानी तीर ध्यान केंद्रित exuviae और भूरे रंग के तीरों का संकेत infocus exuviae. शीर्ष छवि के बाईं exuviae पर केंद्रित है, जो अच्छी तरह के तल पर धंसा हुआ है । नीचे की छवि सही exuviae पर केंद्रित है, जो मध्यम सतह के नीचे तैर रही है । (ख) शीर्ष छवि मध्यम सतह पर तैरते मलबे द्वारा परीक्षा की रुकावट का एक उदाहरण दिखाता है । एक हरे तीर मलबे के नीचे छिपा एक exuviae इंगित करता है । नीचे छवि कागज तौलिया का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ सतह की सफाई का एक परिणाम से पता चलता है । एक exuviae (एक हरे तीर से संकेत) सफाई के बाद दिखाई देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: मचान और जानवरों की सीमन । कैसे exuviae और एक संस्कृति की थाली के एक ढक्कन पर जानवरों की सेक्स की संख्या को चिह्नित करने के लिए उदाहरण । (क) एक अच्छी तरह से पांच exuviae और एक वयस्क जानवर युक्त के लिए एक उदाहरण है । ढक्कन पर टैली मार्क में लाइनों का नंबर वेल में मिले exuviae की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । जब exuviae की संख्या पांच तक पहुंच जाती है, तो पशु के लिंग को एंटीना आकृति विज्ञान के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है ( चित्रा 3भी देखें) । (ख) एक संस्कृति की थाली के एक चिह्नित ढक्कन का एक उदाहरण है । शीर्ष पंक्तियां पुराने होते है (वयस्क करने के लिए CIV) जानवरों और नीचे पंक्तियों छोटे होतेहै (यानी, नव एकत्र) पशु (CIII को CI) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: व्यवहार परीक्षण योजना । मेट-गार्डिंग व्यवहार (बाएं) और व्यवहार परीक्षण (दाएं) की एक रूपरेखा के वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए सेटअप । यह आंकड़ा Tsuboko-Ishii और बर्टन २०१७5से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्रा 9: एक व्यवहार परीक्षण करने से पहले पशुओं के कुल्ला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्रा 10: मैनुअल विश्लेषण में जांच की घटनाओं की परिभाषा । साथियों के संबंध में मनाया घटनाओं के चित्र-की रक्षा करने का प्रयास । परिभाषित घटनाओं और चरण 3 में विश्लेषण के नाम पर प्रकाश डाला है । एक बिंदीदार रेखा में संलग्न घटनाओं कुछ साथी की रक्षा के प्रयास में नहीं देखा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11: T. californicusके पुरुष-महिला जोड़े और पुरुष-पुरुष जोड़ों के बीच अवधि की रखवाली में अंतर । प्रत्येक त्रिभुज प्रतीक एक परीक्षण जोड़ी से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । सलाखों और मूंछ क्रमशः माध्य और interquartile रेंज का प्रतिनिधित्व करते हैं । कैप्चर की औसत अवधि पुरुष-महिला जोड़े (पुरुष-महिला (n = 22), पुरुष-पुरुष (n = 29); * *p < ०.०१ द्वारा मान-Whitney यू परीक्षण) के लिए अधिक है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्र 12: प्रयास की रक्षा के पहले तीन सेकंड में जोड़े की गति । californicusके पुरुष-महिला जोड़े (बाएं) और पुरुष-पुरुष जोड़े (दाएं) के ट्रैक किए गए दो-आयामी पथ के उदाहरण । पथ पर डॉट्स समय अंक (प्रति सेकंड 30 फ्रेम) का प्रतिनिधित्व करते हैं । सलाखों = 10 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 13
चित्रा 13: californicusके पुरुष-महिला जोड़े और पुरुष-पुरुष जोड़े के बीच पहरा की दीक्षा के बाद मतलब वेग में अंतर । प्रत्येक त्रिभुज प्रतीक एक परीक्षण जोड़ी से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । सलाखों और मूंछ क्रमशः माध्य और interquartile रेंज का प्रतिनिधित्व करते हैं । रक्षा के प्रयास के पहले 3 एस में जोड़ी का औसत वेग पुरुष-पुरुष जोड़े के लिए अधिक था (पुरुष-महिला (n = 13), पुरुष-पुरुष (n = 35). * * *p < ०.००१ द्वारा मान-Whitney U test) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Suppl Figure 1
पूरक चित्रा 1: Tigriopusके व्यवहार पर कुल्ला उपचार का प्रभाव । प्रत्येक चक्र या त्रिकोण प्रतीक एक परीक्षण व्यक्ति या जोड़ी से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । सलाखों और मूंछ क्रमशः माध्य और interquartile रेंज का प्रतिनिधित्व करते हैं । "कुल्ला" और "नहीं कुल्ला" समूहों में व्यक्तियों को एक ही तरीके से नियंत्रित किया गया, सिवाय इसके कि "नहीं कुल्ला" समूह 30 मिनट के समायोजन के समय (चरण 2.1.4) से पहले धोने उपचार (चरण 2.1.3) का अनुभव नहीं था । (एक) कुल्ला पुरुषों के औसत वेग के लिए नहीं कुल्ला पुरुषों (कुल्ला (n = 6), नहीं कुल्ला (n = 6), एन एस: कोई महत्वपूर्ण अंतर मान द्वारा पता लगाया गया था की तुलना में अधिक हो-Whitney यू टेस्ट) । समायोजन समय के बाद दर्ज किए गए वीडियो के आधार पर 30 एस के लिए वेग मापा गया था । (ख) कुल्ला महिलाओं के औसत वेग से अधिक नहीं कुल्ला महिलाओं (कुल्ला (n = 6), नहीं कुल्ला (n = 6), एन एस: कोई महत्वपूर्ण अंतर मान द्वारा पता लगाया गया था-Whitney यू परीक्षण) । वेग 30 के लिए मापा गया था वीडियो समायोजन समय के बाद दर्ज के आधार पर, चरण 4 (ट्रैकिंग अंतराल = ०.५ s) के बाद. (ग) की रक्षा के प्रयास की आवृत्ति कुल्ला व्यक्तियों के जोड़े के लिए अधिक से अधिक था (कुल्ला (n = 6), नहीं कुल्ला (n = 6). * * p < ०.०१ मान द्वारा-Whitney यू टेस्ट) । (घ) के प्रयास की रखवाली की अवधि के लिए कुल्ला व्यक्तियों के जोड़े के लिए अधिक है (कुल्ला (n = 6), नहीं कुल्ला (n = 6), एन एस: कोई महत्वपूर्ण अंतर मान द्वारा पता लगाया गया था-Whitney यू परीक्षण) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

व्यक्तिगत संवर्धन और मंच और सेक्स के निर्धारण

यहां हम हमारे पिछले अध्ययन5 में इस्तेमाल विधि का वर्णन करने के लिए उनकी बांधना अनुभव के साथ कुंवारी Tigriopus पशुओं को तैयार नियंत्रित जबकि उनके विकास (चित्रा 4 और चित्रा 7) ट्रैकिंग । के रूप में Tigriopus प्रजातियों जैसे विषविज्ञान16,18, पारिस्थितिकी फिजियोलॉजी19,20,21, और विकासवादी के रूप में विभिंन जैविक क्षेत्रों में मॉडल जानवरों के रूप में उपयोग किया जाता है आनुवंशिकी13,22,23,24, इस विधि में इन copepods के जीवन चक्र पर पर्यावरणीय और आनुवंशिक कारकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान साधन प्रदान करने के लिए एक संभावित है ।

सफल मचान प्राप्त करने के लिए, नियमित रूप से खोज और CI copepodids के संग्रह एक जन संस्कृति से (१.२ कदम) महत्वपूर्ण है, बाद के चरणों में संग्रह के रूप में परिणाम गलत हो सकता है जानवरों की मचान । इसके अलावा, exuviae के लिए एक गहन खोज (चरण १.३) भी सटीक मचान के लिए आवश्यक है । यदि आवश्यक हो तो संग्रह और स्टैगिंग की आवृत्ति बढ़ाएँ, के रूप में molts के बीच अंतराल प्रजातियों के आधार पर एक से कई दिनों के लिए भिन्न होता है और स्थिति2,25,26पालन. copepodids और वयस्क महिलाओं के बीच एंटेना आकृति विज्ञान में अंतर कुछ प्रजातियों और16,25 Tigriopusकी आबादी में दिख महत्वपूर्ण नहीं हैं. इसलिए, सीमन से पहले मचान के लिए या तो सेक्स के उंनत copepodids से वयस्क महिलाओं भेद मददगार है ।

व्यवहार परीक्षण और व्यवहार संपत्तियों के मैनुअल विश्लेषण

सामांय में, ethological अध्ययन के सबसे महत्वपूर्ण भागों में से एक परिभाषा और ब्याज की घटनाओं का वर्णन है । इस पेपर में शुरू किए गए तरीके पहले हमारे हाल के5 अध्ययन के लिए विकसित किए गए थे और शयन और विजुअल एड्स (चित्रा 10) के विवरण के साथ पूरक थे । इसके अलावा, पशु हैंडलिंग में निरंतरता भी व्यवहार प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, copepods के धोने संभवतः उनके व्यवहार (पूरक चित्रा 1) के कुछ पहलुओं की सुविधा हो सकती है और इसलिए नमूनों के बीच एक सुसंगत तरीके से किया जा करने के लिए वांछनीय है, जैसे कदम 2.1.3 में मानकीकृत । हम इस पत्र में उपलब्ध कराई गई सामग्री की उंमीद Tigriopusके साथी की रखवाली व्यवहार पर नियंत्रण और reproducible अध्ययन की सहायता करेगा, उच्च ज्वार पूल के इस प्रचुर मात्रा में निवासी के प्रजनन और पारिस्थितिक अध्ययन को बढ़ावा देने ।

इस विधि के साथ एक संभव सीमा प्राप्त छवियों का इज़ाफ़ा कम है । हालांकि हमारे सिस्टम के साथ दर्ज की गई फिल्मों urosomes और पुरुष पहले एंटीना सहित प्रमुख शरीर संरचनाओं की पहचान की अनुमति, एक ऐसे पैर और हमारे विधि के साथ जननांग के रूप में अधिक सूक्ष्म संरचनाओं का पालन करने में सक्षम नहीं हो सकता है क्योंकि यह काम नहीं करता है वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए सूक्ष्म आवर्धन । जबकि केली एट अल. ने बताया कि वे 100X आवर्धन पर एक सूक्ष्म प्रेक्षण के तहत पुरुषों से japonicus की महिलाओं के लिए spermatophore हस्तांतरण का निरीक्षण करने में सक्षम थे (कोई वीडियो दर्ज)7, हम एक का निरीक्षण करने में सक्षम नहीं किया गया है हमारी फिल्मों में spermatophore, शायद छवि संकल्प की सीमा के कारण ।

जोड़े की दो आयामी ट्रैकिंग

हालांकि इस विधि जानवरों की तीन आयामी ट्रैकिंग की अनुमति नहीं है, यह रासायनिक लेबलिंग जानवरों के बिना zooplankton के दो आयामी पथ विश्लेषण सक्षम बनाता है (cf. चरबी एट al. २०१०27) के उपयोग से मुक्त करने के लिए वितरित कार्यक्रम । यदि चलचित्र फ़ाइल का आकार ImageJ में संसाधित किए जाने के लिए बहुत बड़ा है, तो एक फ़ाइल का रिज़ॉल्यूशन कम कर सकता है और उसे धूसर स्केल चलचित्र में कनवर्ट कर देता है । जबकि वर्णित विधि मूल रूप से californicus (चित्रा 12 और चित्रा 13) के वयस्क जोड़े के लिए विकसित किया गया था, यह वयस्क किशोर जोड़े और एकल व्यक्तियों के लिए भी उपलब्ध है (पूरक चित्रा 1) के रूप में अच्छी तरह से सिद्धांत रूप में अंय Tigriopus प्रजातियों । हम आगे विधि अल्पकालिक करने के लिए लागू होने की उंमीद (मिलीसेकंड से दूसरी बार तराजू) उचित समायोजन के साथ अंय taxa के zooplankton के पथ विश्लेषण ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम सुमितोमो फाउंडेशन, जापान (बुनियादी विज्ञान अनुसंधान परियोजनाओं के लिए अनुदान, अनुदान संख्या: १५०९३२) और समुद्री अकशेरूकीय, जापान (२०१८ व्यक्तिगत अनुसंधान अनुदान) के अनुसंधान संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित है STI और RSB, और अमेरिका से एक अनुदान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (देब-१५५६४६६) को RSB । हम संवर्धन और मचान विधि पर प्रतिक्रिया के लिए सुश्री कियाना मिशेल वुडवर्ड धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Sea Salt Spectrum Brands. Inc. SS1-160P For preparation of culture medium
PRO PlecoWafers Tetra 16447 Food for copepods (used after being ground in a mortar)
Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid Corning Co., Ltd. 353224 Container for culture of gravid females and hatched nauplii
Flat bottom 24-well cell culture plate with lid Corning Co., Ltd. 353226 Container for individual culturing
Flat bottom 48-well cell culture plate with lid Nest Biotechnology Co., Ltd. 748001 Behavioral observation chambers
LED light pad Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd. Litup LP4 Backlight for behavioral observation
Camera Canon 0591C003 (model: Rebel T6i) For recording of behavior
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A For transfer of copepods
P10 micropipette tips VWR 613-0735 For transfer of C1 stage copepodids
ImageJ NIH Version 1.49t For semi-automatic analysis of movies
MTrackJ Version 1.5.1 ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands)

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References

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व्यक्तिगत संवर्धन के <em>Tigriopus</em> Copepods और मात्रात्मक विश्लेषण के अपने साथी की रखवाली व्यवहार
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Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior. J. Vis. Exp. (139), e58378, doi:10.3791/58378 (2018).More

Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior. J. Vis. Exp. (139), e58378, doi:10.3791/58378 (2018).

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