Her, er en morfin aircondition sted præference (CPP) protokol beskrevet til at måle inkubation af begær i rotter.
En væsentlig årsag til gentagne tilbagefald er en trang til stoffet. Drug trang øges gradvist i perioden afholdenhed, et fænomen betegnes inkubation af narkotika trang. Her, beskriver vi en morfin aircondition sted præference (CPP) protokol til måling af inkubation af begær i rotter. I denne protokol bruges en CPP paradigme hovedsagelig beskæftiger somatosensoriske stikord til at etablere et langsigtet belønning hukommelse af morfin. En tre-kammer CPP kasse, der adskiller sig i teksturen af kammeret ordet er konstrueret. Først, dyrene er testet for deres baseline præference for to kamrene i tre på hinanden følgende dage. Derefter, er de sprøjtet intraperitoneal med morfin/saltvand og lagt i deres ikke-foretrukne/foretrukne kammer for 45 min. Efter 6 dage af conditioning, er deres præference til side kamre testet for 15 min på forskellige tidspunkter efter den sidste conditioning session. Med dette paradigme, kunne belønning hukommelse af morfin vare i mindst 18 dage. For at teste, om de ovennævnte protokol kan model øget trang, tælles antallet af indgange i to kamrene i perioden, afholdenhed. Resultaterne viser, at indgangene øges, tyder på, at CPP paradigme kunne efterligne inkubation af trang. Fremtidige studier kan ansætte denne model til at studere neurale mekanismer, der ligger til grund for langtidshukommelsen og inkubation af trang.
Stofmisbrug er en kronisk sygdom1 med flere forskellige faser2: binge/forgiftning, tilbagetrækning/negativ indflydelse og optagethed/forventning. I den indledende binge/forgiftning fase af narkotika afhængighed cyklus tage fag stoffer på grund af den forstærkende virkning2. I stadiet tilbagetrækning/negativ indflydelse opleve emner negative somatiske og følelsesmæssige stater, drug tilbagetrækning, som fremmer negativ forstærkning mekanismer forbundet med udvikling af afhængighed3. I stadiet optagethed/forventning genindfører emner stof-søger efter udryddelse, der kunne være udløst af drug-associeret stikord eller stressfaktorer. I dyreforsøg med narkotikamisbrug, konditioneret sted præference (CPP) paradigmer bruges til at efterligne den positive forstærkende effekt af medicin4,5,6 , og det bruges altså til at modellere den indledende fase af stoffet afhængighed cyklus. Morfin, et medlem af familien opioid producerer et positivt forstærkende effekt ved at aktivere opioid-receptorerne i hjernen7,8.
CPP paradigme er baseret på princippet om klassisk (pavlovsk) conditioning og almindeligt anvendt til at måle den givende effekt af medicin misbrug, såsom morfin4,5,9,10, på grund af dens let tilgængelighed på tværs af laboratorier. En typisk CPP paradigme består af tre faser: før conditioning, aircondition og testfaserne. Fasen conditioning er de givende egenskaber af et lægemiddel (unconditioned stimulus) parret med en eller flere neutrale kontekstuelle stimuli, som få givende egenskaber efter flere conditioning bindinger og tjene som konditioneret stimuli. I løbet af testfasen, dyrenes præference for narkotika-parret rum målt og afspejles som deres belønning hukommelse. Af denne grund bruges CPP paradigme også til at undersøge mekanismerne for indlæring og hukommelse. For at etablere et langsigtet belønning hukommelse af morfin, variabler, der påvirker etablering af CPP er blevet justeret og optimeret med den nedenfor beskrevne protokol11. Kontekstuelle stimuli er en kombination af visuelle, taktile og lugt stikord. Variationer af kontekstuelle stimuli og afprøvning tidspunkter er lavet efter forskellige forskningsformål. For eksempel i vores tidligere undersøgelse12, var de somatosensoriske stikord (anden sal teksturer) hovedsagelig benyttes som kontekstuelle stimuli til at undersøge rollen, den caudale del af økarakter cortex, et område af hjernen med somatosensoriske funktion, i erhvervelse og vedligeholdelse af belønning langtidshukommelse. Design af apparatet og Tildelingen af rotter til foretrukne/ikke-foretrukne sider påvirker etablering af CPP. En tre-kammer apparat i stedet for en to-kammer apparatet bruges i den under protokollen at undgå tvungne valg. Balancen mellem to side kamre og den oprindelige tildeling af dyr ind i dem påvirker erhvervelse af CPP4,13. Således anvendes en afbalanceret design side kamre og forudindtaget tildeling af dyr i denne protokol til at erhverve en stærke sted præference. Vedligeholdelse af langsigtede belønning hukommelse kræver mere conditioning forsøg fasen conditioning. For at reducere tid, omkostningen under conditioning fase, foretages to conditioning forsøg pr. dag og morfin/saltvand indsprøjtninger er modvægt for at undgå akutte tilbagetrækning effekt af morfin i saltvand parrede forsøg4.
Genansættelse dyremodeller14 har fastslået for at modellere optagethed/forventning fase af narkotika afhængighed cyklus. CPP er også udnyttet til at studere genansættelse, der modeller tilbagefald til vanedannende opførsel5. Tilbagefald er en af barriererne i behandling af narkotikamisbrug. Trang er en af årsagerne til gentagne tilbagefald. Trangen til narkotika stiger konstant i perioden afholdenhed, et fænomen betegnes inkubation af trang15,16. Inkubation af trang er almindeligt studerede i stof selvforvaltning paradigme men ikke CPP paradigme. Brugen af CPP paradigme afspejler inkubation af trang blev først foreslået af Li et al. 17. deres resultater17 viste, at CPP snesevis af lave doser af morfin (1 mg/kg og 3 mg/kg), men ikke en høj dosis (10 mg/kg) øges gradvist i løbet af de første 14 dage af afholdenhed. På samme måde mus injiceres med en lav dosis af kokain viste øget CPP scores over tid18. De øgede CPP snesevis af de lave doser af morfin blev brugt til at afspejle rugede trang17. Varighed brugt i såvel antallet af poster i drug-associeret miljøet er foreslået for at afspejle de forstærkende konditioneret svar i CPP paradigme19. De fleste af de seneste undersøgelser bruger CPP scores direkte eller indirekte afspejler tid tilbragt i lægemiddel-parret kamre mens antallet af poster til side kamre som en parameter er ofte forsømt. Af disse grunde, en morfin dosis på 10 mg/kg blev brugt og antallet af poster blev målt i vores undersøgelse11. Resultaterne viser, at indgangene til rotter til side kamre steg betydeligt i afholdenhed perioden11. Dette tyder på at både CPP scores og antallet af poster er nyttige parametre i vurderingen af øget trangen til narkotika og CPP paradigme er relevant at modellere inkubation af trang fænomen. Men for at reducere antallet af dyr kræves, en gruppe af morfin-oplevet dyr testes gentagne gange; virkningen udryddelsestruede kan således ikke udelukkes med nuværende inden for emnet design. A mellem emne design med den samme protokol kan overvinde denne begrænsning.
I det følgende beskrives de CPP protokol, der etablerede langtidshukommelse belønning og modelleret øget trang. Kort, efter tre pre conditioning dage, rotter gå igennem seks conditioning dage med to conditioning forsøg pr. dag og derefter er testet på forskellige tidspunkter efter sidste conditioning retssagen. I denne CPP paradigme, en tre-kammer polyvinylchlorid (PVC) boksen bruges som CPP apparat er konstrueret og gulvet i apparatet er afbalanceret. Apparatet består af to store sorte side kamre (30 cm × 25 cm × 30 cm, L × B × H) og en midterste hvide kammer (11 cm × 25 cm × 30 cm, L × B × H) med hvid glat PVC gulv. To side afdelingerne har forskellige gulvet teksturer som somatosensoriske stikord: en med et gitter plexiglas gulvet, den anden med en hård PVC gulv.
Her, er en metode, ved hjælp af en morfin CPP paradigme beskrevet til at etablere langsigtede belønning hukommelse i rotte med somatosensoriske stikord som konditioneret kontekst. For at bygge sådan en langsigtet belønning hukommelse, en tidligere protokol21 med en afbalanceret CPP apparater er ændret og saltvand og morfin-sessioner er sæt mindst 10 h fra hinanden. Derudover føjes mere conditioning sessioner fasen conditioning hen til forøge associative læring. Ud over CPP scores, indgangene til to side kamre er målt og mønster af øget indgange til side kamre er ens med de øgede aktive svarene i selvforvaltning paradigme.
Flere faktorer påvirke etablering af CPP paradigme nævnt ovenfor. En nøglefaktor er designet af apparatet: rotter i almindelighed bør have lignende præference til begge side kamre til at sørge for apparatet er afbalanceret. En ubalanceret apparater kan maskere erhvervelse af CPP på grund af den oprindelige høj præference til ene kammer13. Derfor, ekstreme præference til én side kammer (mere end 90% af den samlede tid i nogen af to kamrene) bør undgås, når du vælger teksturen af gulvet eller andre kontekstuelle tidskoder. For forskellige eksperimentelle formål, kan eksperimentatorer balance CPP apparatet ved at ændre de kontekstuelle stimuli. For afbalanceret apparater er to måder at eksperimentelle design almindeligt anvendte4. En partisk måde er at par narkotika med de ikke-foretrukne kammer med alle fag; en fordomsfri måde er at parre halvdelen af dyr med narkotika i de ikke-foretrukne kammer, anden halvdelen med den foretrukne kammer. Begge måder kan etablere CPP13 men undersøgelser17,25 med den sidstnævnte design udelukke altid mange emner på grund af deres stærke præference til ene kammer. Der findes enkelte sårbarhed over for narkotika afhængighed26,27,28 , blev en forudindtaget design valgt i denne undersøgelse at undgå udstødelse af raske forsøgspersoner. En begrænsning af partiske design er effekten af inkonsekvent præference til side kamre. Som vist i figur 2, har rotter i gruppen saltvand konsekvent lav CPP noder for de oprindelige ikke-foretrukne kammer. Således, at inkonsekvent præference til side kamre kan påvirke CPP scores i gruppen morfin er udelukkes ved at indstille den saltholdige kontrol. For at undgå loft effekten af den foretrukne kammer, bruger vi den første ikke-foretrukne kammer som morfin parrede kammer. For at undgå effekten af nyhed og stress på baseline præference til side kamre, tre pre conditioning sessioner er udført, og den tredje samling er anvendt som baseline. Den fjerde faktor er intervallet mellem morfin og saltvand sessioner. I vores paradigme vælger vi intervaller på mindst 10 timer at undgå tilbagetrækning virkning i perioden saltvand conditioning. Dosering af morfin er også en vigtig faktor. Ekstremt lave doser af morfin, såsom 0,01 mg/kg6, ikke fremkalde sted præference. En dosis på 10 mg/kg induceret højeste CPP score17 i rotter og er almindeligt anvendt i rotte morfin CPP undersøgelser17,21,23. Dog kunne 10 mg/kg morfin (i.p.) fremkalde respiratorisk depression i ca. 5% af rotter. Lavere doser af morfin, såsom 5 mg/kg, kunne bruges i fremtidige undersøgelser. For andre arter såsom tree spidsmus, bør tolerance over for narkotika overvejes, når bygningen CPP paradigme. Da tree spidsmus udvikler hurtig tolerance til morfin, øget doser morfin bør anvendes under konditioneringen fase29,30.
Med den ændrede protokol, er en belønning langtidshukommelse etableret i mindst 18 dage efter 6 dage af conditioning11 (figur 2). Fremtidige studier bør måle, om CPP kunne opretholdes i længere tid. Gentagne tilbagefald er den største barriere i behandling af narkotikamisbrug. Stress, miljømæssige stikord og narkotika kunne fremkalde tilbagefald. Efter udryddelse af CPP hukommelse, kan denne model bruges til at modellere tilbagefald fremkaldt af stress eller narkotika.
Indgangene til stof-parret afdelingerne i gruppen morfin øget afholdenhed periode11 (figur 3), som er lig med øget aktiv svarene i selvforvaltning paradigme. Men indgange til saltvand-parret kammer også steg med CPP paradigme i både rotter og tree spidsmus11, som er forskellig fra de inaktive svar af selvforvaltning paradigme. Denne forskel kan skyldes de forskellige grundlæggende principper bag de to paradigmer: ene er klassisk konditionering, den anden er operant betingning. Desuden viser tree spidsmus med mad CPP oplever ikke sådan et mønster af øget indgange30. Derfor, de øgede indgange til begge side kamre i morfin-oplevet dyr menes at repræsentere rugede trang af narkotika. Selv om begrænsning af ved hjælp af gentagne foranstaltninger i et fag ikke udelukkes, mønstret af øget poster blev bevaret i rotter11, tree spidsmus11,30 og aber31. Ikke desto mindre en mellem emne design under afholdenhed periode er stærkt anbefales til fremtidige undersøgelser for at udelukke extinction effekten af gentagne målinger.
Bortset fra de øgede indgange, CPP scorer med lave doser af morfin (1 mg/kg og 3 mg/kg) steg gradvist i afholdenhed perioden17. Disse resultater tyder på, at CPP paradigme også kunne model inkubation af trang fænomen. En øget CPP score kan også repræsentere en øget hukommelse for konditioneret stimulus. I dette aspekt ligner indgange til side kamre i en tre-kammer apparater, der svarer til aktive svar i selvforvaltning paradigme, mere søgning efter narkotika eller den givende effekt af narkotika. Det ville være interessant at kontrollere udviklingen af indgange til side kamre i afholdenhed periode rotte CPP paradigmer af lavere doser af morfin. Fremtidige undersøgelser med andre stoffer og mus bør gøres for at kontrollere, om dette fænomen er bevaret på tværs af narkotika misbrug/arter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (NSFC) 31741058 (Y.Z.), Shenzhen statslige tilskud (JCYJ20170818162613877 og JCYJ20170818163217196) og Kina postdoc Science Foundation Grant 2017 M 622826 (K.Z.).
Morphine | Shenyang First Pharmaceutical Factory | ||
CPP apparatus/Camera | Anlai Technology Company | ||
SPSS | IBM Inc |