Summary
Hier beschreiben wir den Bau und Betrieb eines Windkanals für Geruch Behavioral Assays mit Insekten vermittelt. Der Windkanal-Design erleichtert die Freigabe der Geruch Quellen durch verschiedene Methoden, mit und ohne visuelle Reize. Windkanal-Experimente sind wichtige Methoden, verhaltensorientierte aktive flüchtige Chemikalien zu identifizieren.
Abstract
Geruchssinn ist der wichtigste sensorische Mechanismus, durch den viele Insekten interagieren mit ihrer Umwelt und ein Windkanal ist ein hervorragendes Werkzeug, um Insekten chemische Ökologie zu studieren. Insekten können Punktquellen in einer dreidimensionalen Umgebung durch die sensorische Interaktion und anspruchsvolle Verhalten suchen. Die Quantifizierung dieses Verhaltens ist ein Schlüsselelement in der Entwicklung von neuen Werkzeugen für Pest Control und Decision Support. Windkanal mit einem passenden Flug-Abschnitt mit laminar Air Flow, Visual cues für während des Fluges Feedback und eine Vielzahl von Optionen für die Anwendung von Gerüchen kann verwendet werden, um komplexe Verhalten zu messen, die anschließend die Identifizierung von attraktiven gestatten oder abstoßende Gerüche, Insekten Flugeigenschaften, Visual-Geruch-Interaktionen und Interaktionen zwischen Lockstoffe und Gerüche als Hintergrund Gerüche in der Umgebung verweilen. Ein Windkanal hält der Vorteil des Studiums des Geruchs Verhaltensrepertoire eines Insekts in einer Laborumgebung vermittelt. Verhaltensbezogene Maßnahmen in einer kontrollierten Umgebung stellen Sie die Verbindung zwischen dem Insekt Physiologie und Feldeinsatz. Ein Windkanal muss ein flexibles Instrument und sollte leicht unterstützen die Änderungen auf die Einstellungen und Hardware zu verschiedenen Fragestellungen zu passen. Der Hauptnachteil im Windkanal-Setup hier beschrieben wird, ist der sauberen Geruch Hintergrund der besondere Aufmerksamkeit erfordert, bei der Entwicklung einer synthetischen flüchtigen Mischung für Feldeinsatz.
Introduction
Der Windkanal ist ein wichtiges Instrument im Insekt chemische Ökologie Studien, die es ermöglichen, Labortests von Insekten Flug Antworten auf Botenstoffe. Durch die Freigabe Gerüche in einen kontrollierten Wind Strom, kann die Insekten Verhalten als Reaktion auf diese Reize direkt überwacht werden, durch das Studium ihrer Luv Fluges in Richtung der Quelle. Geruchssinn ist der wichtigste sensorische Mechanismus, durch den viele Insekten mit ihren biotischen Umwelt1interagieren. Insekten nutzen Geruch Hinweise auf um geeignete Partner zur Paarung zu finden. Ebenso nutzen sie Geruch Sträuße aus Host-Ressourcen um Nahrung für sich selbst oder die Nachkommen zu finden. Pflanzen lassen Sie blumige Gerüche in Kombination mit Nektar und Pollen Belohnungen Insektenbestäubung Effizienz zu sichern. Diese flüchtige Hinweise diffundieren passiv in die Umwelt und Insekten müssen identifizieren und interpretieren ihre individuelle Bedeutung. Flüchtigen Stoffen in die Umwelt freigesetzt werden, Reisen die Moleküle mit dem Wind als Filamente, Beibehaltung der ursprünglichen Konzentration auf Langstrecken Windrichtung, bevor schließlich aufgelöst und durch Turbulenzen und Diffusion2verdünnt. Insekten können kurzfristige Änderungen in der volatilen signalisieren und richten Sie ihre Bewegung gegen den Wind, auf die Quelle erkennen. Insekten zeigen ein Flugverhalten mit schnell Aufwind Überspannungen bei Kontakt mit einem attraktiven Geruch, und3,4plume Gießen seitwärts auf den Verlust, den Geruch zu verlagern. Die Co lokalisierte Anordnung der olfaktorischen Neuronen in den Sensillen von Insekten Antennen kann Verhaltensreaktionen zu der Entstehung und Verlust von Plume Kontakt mit bemerkenswert hoher Auflösung5 erleichtern und ermöglichen die Insekten zu ähnlichen unterscheiden Geruchsmoleküle aus verschiedenen Quellen6. Visuelles Feedback während im Flug, genannt Optomotor Anemotaxis, ist grundlegend für die relative Verschiebung2,7, Windrichtung und Objekten zu identifizieren. Durch die Verwendung von sensorischen Interaktion und anspruchsvolle Verhalten können Insekten Punktquellen in einer dreidimensionalen Umgebung suchen.
Die Identifizierung von Insekten Lockstoffe und Repellentien kann mehrere wichtige angewandte Aspekte haben. Sexualpheromone (intraspezifische Signale) von vielen Schadinsekten können synthetisiert und in die Luft, die Paarung Verhalten8stören freigesetzt. Pheromone und Kairomone (interspezifischen Signale) eignet sich für Masse abfangen, gewinnen und bei der Überwachung der fallen, direkte Auskunft des Schädlings-Status zu töten. Insektenschutzmittel, wie z. B. Mücken9, können auch im Windkanal Bioassays untersucht werden. Diese Methoden spielen eine wichtige Rolle von integrated Pest Management und Entscheidung Unterstützungssysteme für die Landwirte.
Windkanal Bioassays, wo der Geruch vermittelten Verhalten Repertoire einer Spezies überwacht werden kann, ist eine leistungsfähige Methode identifizieren potenzielle neue Werkzeuge zur Schädlingsbekämpfung zu ersetzen oder Verringerung der Auswirkungen der Verwendung von Pestiziden.
Die theoretischen Überlegungen hinter dem Windkanal-Design ist gründlich beschrieben10. Hier beschreiben wir den Wind Tunnelbau, Geruch Anwendung und Flugverhalten, die in mehreren Experimenten verwendet wurde, um die Windkanal-Bioassay-Protokoll bestimmen. Windkanal (Abbildung 1) Nibio (Ås, Norwegen) ist aus kratzfestem Polycarbonat hergestellt. Die Flugarena ist 67 cm hoch, 88 cm breit und 200 cm lang. Vor dem Flugarena gibt es ein zusätzliche Polycarbonat Abschnitt, 30 cm lang. Dieser Teil des Windkanals dient als Dienstprogramm Abschnitt für die Anwendung von Gerüchen. Wenn die flüchtigen Bestandteile in die Polycarbonat Kontakt Gehäuse in der Flugarena sie später wieder freigesetzt werden und zwischen den Sitzungen kontaminieren. Daher gibt es an jedem Ende des Abschnitts Dienstprogramm einem perforierten Metallgitter. Beide Netze den Luftstrom zu beschränken und leichtem Überdruck auf der Luv-Seite zu erstellen. Dies führt zu erhöhten Laminar-Flow auf der Lee-Seite. Luv Raster besteht aus einem Lochblech mit 8 mm Bohrungen gleichmäßig über den Querschnitt des Tunnels verstreut, 54 % offene Fläche zu bieten. Der Abwind Raster hat Löcher von 3 mm und eine 51 % offene Fläche. Dies reduziert die Turbulenzen und sorgt dafür, dass den Geruch plume Reisen zentral über die gesamte Länge der Flugarena. Der Geruch Plume haben die Form eines schmalen Kegel und kann durch den Einsatz von Rauch sichtbar gemacht werden. Auf dem Boden des Fluges sind Arena, Kunststoff oder Papier Kreise in verschiedenen Größen (von 5 bis 15 cm im Durchmesser) angelegt, um Insekten während des Fluges visuelles Feedback geben. Gibt es ein 25 x 50 cm-Zugangstür auf Luv Ende der Flugarena und im Abschnitt Dienstprogramm. Zwischen dem downwind Ende der Flugarena und die Auspuff-Filter-Sektion ist eine 60 cm Freifläche für Insekten Handling. Dieser Zugang ist an den Seiten mit einem 0,8 mm verzahnt Stoff um die Insekten in den Raum entweichen zu verhindern abgedeckt.
Luft wird durch einen Ventilator in das erste Filtergehäuse gezogen. Die Luft strömt durch ein Staubfilter, bevor es durch 24 hohe Kapazität Aktivkohlefilter gereinigt und im Tunnel freigegeben. Die Luft, die den Tunnel verlassen wird durch eine ähnliche Filtergehäuse vor der Freigabe zurück in den Raum geleitet. Es wäre vorteilhaft für die Abluft an der Außenseite des Gebäudes durch eine Abzugshaube. Die Lüfter auf beide Filtergehäuse sind mit gleichen Fluss laufen. Beide Lüfter haben einen kontinuierlichen Dimmer und an unterschiedliche Windgeschwindigkeiten mit einem Durchflussmesser kalibriert sind. Die Luftgeschwindigkeit ist abhängig von der Spezies getestet. 30 cm s-1 ist oft ein guter Ausgangspunkt. Für kleine Insekten die ideale Luftgeschwindigkeit kann reduziert werden, und für starke Flyer, die Fluggeschwindigkeit kann höher sein, um die relative Fluchtdistanz zu erhöhen.
Der Windkanal-Raum erleichtert die Kontrolle der Temperatur, Feuchtigkeit und Lichtstärke. LED-Streifen befinden sich hinter einem 3 mm opak Poly(methyl methacrylate) Bereich erstelle ich eine diffuse Lichtquelle oben und die Flugarena. Beide Lichtquellen können unabhängig voneinander gesteuert werden.
Geruch-Anwendung kann auf verschiedene Weise erreicht werden. Gerüche sind in der Regel, in den Luftstrom in der Mitte des Luv Ende der Flugarena veröffentlicht. Je nach der Forschungsfragen zur hand kann die Freigabestelle ausgesetzt oder abgedeckt werden. Ein Glaszylinder (10 cm Durchmesser, 12,5 cm lang) mit einem Metallgitter (2 × 2 mm Maschenweite) auf der Lee-Seite können visuell blockieren die Geruch-Quelle und zur gleichen Zeit als eine Landeplattform für Insekten dienen. In vielen Experimenten kann eine horizontale Glas-Plattform für die Präsentation von Geruch Quellen oder optische Signale in der Nähe der Freigabe verwendet werden. Es gibt auch die Möglichkeit, zwei Gerüche lassen Sie gleichzeitig nebeneinander, Wahl-Assays zu erleichtern. Die stellen werden dann 20 cm auseinander gesetzt und die Geruch Federn überlappen von auf halbem Weg durch den Tunnel. Die Wahl kann dann identifiziert werden, durch welche Fahne das Insekt gegen den Wind folgt.
Der Windkanal-Design ermöglicht zahlreiche flüchtige Release Methoden. Zum Beispiel kann ein spezifischen Geruch vor einen Hintergrund Geruch wie von einer Ernte Pflanze11,12emittiert freigegeben werden. Auch können verschiedene visuelle Reize getesteten13,14. Der Versuchsaufbau muss jede Spezies und Forschung Frage angepasst werden.
Natürlicher Geruch Quellen, z. B. Pflanzenteile und synthetischen Gerüche aus Spender können direkt in der Flugarena eingeführt werden. Um Geruch vermittelt Verhaltensweisen von visuellen zu isolieren, die Geruch-Quelle gedeckt werden kann, oder die flüchtigen Bestandteile in der Flugarena über eine Holzkohle gefilterten Labor Luftzufuhr von außen getragen. Die Geruch Quelle beschränkt sich dann auf ein Glas und die Luft wird durch das Glas in den Windkanal über Teflon-Schläuche und Glaspfeifen gedrückt. Die Fluggeschwindigkeit bei der Freigabe Punkt sollte die Windgeschwindigkeit in der Arena übereinstimmen.
Um Gerüche in spezifische Mischung Verhältnissen zu lösen, kann eine Spritze verwendet werden. Die Spritze ist ein Ultraschall Düse eine konische Spitze mit einem eingefügten Microbore ein Flüssigkeitsstrom bei 10 µL min-1zu erleichtern. Die Düse ist mit einem Breitband-Ultraschall-Generator verbunden und arbeitet mit 120 kHz. Eine Spritzenpumpe drängt die Geruch-Probe in die Sprayer Düse. Fluorierte Ethylen-Propylen (FEP) Schlauch mit 0,12 mm Innendurchmesser verbindet die gasdichte 1 mL-Spritze und die Düse. Schlauch-Adaptern, die Schwellen in Ethanol und in der Luft, schrumpfen zu eng anliegende mit keine Innenvolumen erleichtern. Die Aerosol-Tropfengröße erzeugt aus der Schwingung der Düse ist frequenzabhängig und hängt das bestimmte Lösungsmittel verwendet. Die kleinen Tröpfchen verdunsten und durch den Wind Tunnel als flüchtige gebracht. Gibt es auch andere Sprayer-Designs und eine billigere Version unter Verwendung einen Piezo getrieben Glas Kapillare bietet eine ähnliche Lösung15.
Synthetische Mischungen oder Headspace-Sammlungen können mit der Spritze verwendet werden. Die Proben sind mit reinem Ethanol auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt. Mit flüchtigen Sammlungen kann die Probe verdünnt werden, um die Abholzeit zu entsprechen. Dies bedeutet, dass eine flüchtige Sammlung Stichprobe über 3 h um 1800 µL verdünnt werden sollte mit einer Version aus der Spritze bei 10 µL min-1 3 h entspricht.
Die Identifizierung der das Flugverhalten kann direkt durch manuelle Beobachtung oder durch post-hoc-video-Analyse erfolgen. Orientierte Flug sollte von zufälligen Flug unterschieden werden. Geruch vermittelt Verhalten kann durch die folgenden Merkmale erkannt werden: Zick-Zack-Flug über den Geruch plume, direkt am Wind Flug innerhalb der Wolke und Schleife zurück, wenn der Kontakt mit der Fahne verloren geht. Beim Ausfall einer attraktiven Plume können die Insekten auch in Zick-Zack mit zunehmender Bögen mit der verlorenen Plume3,4wiederherstellen starten. Dieses Verhalten ist von grundlegender Bedeutung in einem Feld Einstellung wo brauchen die Insekten einen attraktiven Geruch nach Turbulenzen und wechselnden Windrichtungen zu bewältigen. Die Flugmuster ist nicht einheitlich und variiert die Insektenordnungen. Als Beispiel starke Flyer wie Schmeißfliegen haben eine schneller Wind Orientierung mit breiter Gießen Muster als Motten und die Windgeschwindigkeit sollte erhöht werden, um eine längere relative Flugbahn zu erleichtern.
Der Flug eines Insekts kann auch gefilmt werden. Mit einer einzigen Kamera können einfache Flugeigenschaften durch Plotten der X-y-Koordinaten-16beschrieben werden. Mithilfe von zwei Kameras mit synchronisierten Frame Capture kann der 3D Flug mit einem externen Software-17rekonstruiert werden. Flug-Track kann dann analysiert werden, um Informationen über die Fluggeschwindigkeit und Distanz, die Flug-Winkel in Bezug auf die Windrichtung und die Details über die Flugeigenschaften in Bezug auf den Geruch Plume. Es gibt benutzerdefinierte und kommerzielle Geräte und Software zur Verfügung, die automatische Frame für Frame-Tracking aktiviert. Die Kalibrierung Frames sollte zur realen Welt Platz zu verweisen und geradlinige Weitwinkel-Objektive verwendet werden, um die Verzeichnung des Objektivs zu minimieren. Sorgfalt sollte um visuelle Hintergrundgeräusche, wie Ecken und Kanten im Bereich Windkanal zu reduzieren und Insekt zum Hintergrund Diskriminierung zu maximieren. Durch den Einsatz einer Infrarot-Lichtquelle, die Reflexion (zB., von nachtaktiven Mücken) mit monochromen CCD Kameras17gefilmt werden können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereitung Glasröhren
- Bereiten Sie die Glasröhren (zB., 2,8 cm Durchmesser, 13 cm lang) und schließen Sie ein Ende mit Kunststoff Snap Cap.
- Trennen Sie 10 Insekten in der verschlossenen Glasröhrchen und decken Sie das andere Ende mit Gaze mit einem Gummiband. Lassen Sie die Insekten, der Temperatur, Lichtverhältnisse und Feuchte im Windkanal Raum für mindestens 2 Stunden akklimatisieren.
Hinweis: Die Anzahl der Insekten in jede Röhre richtet sich hinsichtlich der Arten und Forschung.
2. Vorbereitung Geruch Quellen
- Sprayer-Protokoll.
- Füllen der gasdichten Spritze, 1 mL mit einer verdünnten Headspace-Sammlung oder eine Mischung von synthetischen Geruch.
Hinweis: Der Inhalt des verdünnten Headspace oder synthetischen Geruch Mischung hängt von Insekt Arten und Forschung Frage. Im Allgemeinen sollte die Konzentrationen verwendet die natürliche Freisetzungsraten der authentischen Geruch Quelle entsprechen. - Schließen Sie die Spitze der Spritze an die FEP-Schläuche mit Schlauch-Adapter und stecken Sie die Spritze in die Spritzenpumpe.
- Starten Sie die Spritzenpumpe.
- Starten Sie Breitband-Ultraschall Generator.
Hinweis: Die Freisetzung des Aerosols aus der Sprayer kann bestätigt werden, indem Sie eine Taschenlampe von unten die Freigabestelle zeigen. - Führen Sie die Spritze mit 96 % igem Ethanol für ein Minimum von 10 min zwischen den Behandlungen die Innenseite der Rohre und Düse reinigen. Verwendung eine separate Spritze, reinem Ethanol, gewidmet für alle Reinigung.
- Reinigen Sie die Spritzen und die Spitze der Düse mit 96 % Ethanol nach Gebrauch.
- Füllen der gasdichten Spritze, 1 mL mit einer verdünnten Headspace-Sammlung oder eine Mischung von synthetischen Geruch.
- Authentische Geruch Source-Protokoll.
- Legen Sie die authentischen Geruch Quellen in den Windkanal oder in ein 2 L Headspace Sammlung Glas.
- Headspace Sammlung Glas an den Labor-Luftstrom zu verbinden und loslassen in den Windkanal.
Hinweis: Sammeln Pflanzenmaterial als Beginn der Versuche möglichst in der Nähe und verhindern, indem man das abgeschnittene Ende in ein kleines Fläschchen mit Wasser welken. Die Menge und Art des Pflanzenmaterials oder einer anderen Quelle authentischen Geruch hängt Insekt Arten und Forschung.
- Positionieren Sie das Glasrohr mit Insect(s) auf einem Halter 180 cm Lee von der Geruch/Video-Quelle und 30 cm vom Boden. Angeschnittene Ärmel Ende sollte gegen den Wind zeigen.
3. starten das Protokoll
- Verwenden Sie zwei Kameras, um zwei Ansichten zu erfassen. Montieren Sie die Kameras über die Flugarena und abgewinkelt, um zwei verschiedene Ansichten zu erfassen.
- Öffnen Sie die Kappe.
- Der Timer gestartet wird.
Hinweis: Verschiedene Arten erfordern unterschiedliche Zeitrahmen zu reagieren, zB., Apfel Obst Motte (Argyresthia Conjugella) wird innerhalb von 4 bis 5 min11beantworten, aber die ausserordentliche Moth (Lobesia Botrana) benötigen bis zu 20 min, zu reagieren 18. - Beachten Sie die Flugmuster und besonderes Augenmerk auf die Flugeigenschaften und Luv Ausrichtung. Gäste die Flugleistungen nach vordefinierten Verhalten Kategorien, zB., ausziehen, orientierten Flug über kurze Distanz (mindestens 20 cm), orientierte Flug über längere Distanz (< 5 cm von der Quelle) und landen.
Hinweis: Dreharbeiten und 3D-Tracking mit zwei Kameras einsetzbar, detailliertere Informationen über die Flugeigenschaften zu geben. Die Kameras sind in der Regel über die Flugarena montiert und abgewinkelt, um zwei verschiedene Ansichten zu erfassen. - Sammeln Sie die Insekten an den Wänden des Windkanals, außerhalb der Geruch Plume, Landung und zurück auf den Halter zu ersetzen.
Hinweis: Die Insekten erhalten eine Chance auf Gerüche mit Luv Flug zu reagieren und nicht ersetzt werden. - Änderung zu Glas-Hardware zwischen den Behandlungen zu reinigen.
Hinweis: Häufige Behandlungen sollte ausgeführt werden, um mögliche Kontaminationsquellen zu identifizieren. - Einschläfern Sie die Insekten mit CO2 oder durch Einfrieren nach den Experimenten.
Hinweis: Abhängig von der Forschungsfrage Weibchen können für Eientwicklung erzielte oder visuell inspiziert, um zu überprüfen, den Zustand der Flügel oder Antennen.
4. Reinigung
- Alle Metall und Glas-Hardware mit Ethanol und Wasser zu waschen und trocknen lassen.
- Erhitzen Sie alle Metall und Glas-Hardware auf 300 ° C für 6 h, um die Verunreinigungen zu entfernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Schmeißfliegen reagiert stark auf Gerüche vom toten Tier repräsentiert eine ephemere Larven Wachstum Substrat19,20. Mit tote Mäuse als Quelle natürlichen Geruch, wir untersucht die Details das Flugverhalten von 15 Tage alten, weiblichen C. eingespieltes, mit oder ohne visuelle Reize neben den Geruch Freigabe Punkt13gedeckt. Um die natürliche visuelle Cue zu beseitigen, haben wir die Glas-Glas-System oben beschriebenen verwendet. Mit einer Windgeschwindigkeit von 30 cm s-1 Schmeißfliegen dargestellt, mehr als 80 % Start- und orientierte Flugverhalten im Abwind Ende des Windkanals und mehr als 60 % von ihnen erweiterte mit kontrollierten und ausgerichtete Bewegung in den Aufwind Teil des Tunnels ( Abbildung 2). Es gab keinen signifikanten Einfluss der visuellen Hinweis auf orientierte Flugverhalten. Jedoch effizient anzeigen das gesamte Spektrum von Verhaltensweisen, die unter natürlichen Bedingungen Schmeißfliegen die Möglichkeit bieten, die Eier auf eine Karkasse (Abflug, orientierten Flug und Landung) zu hinterlegen, ist ein Zusatz von einen visuellen Hinweis erforderlich um den Geruch zu markieren Quelle. Die Verwendung von einen visuellen Hinweis deutlich Landungen an der Quelle von 14 % auf 40 % erhöht. Diese einfache Extraktion einer größeren Windkanal Experiment13 verdeutlicht die Notwendigkeit für einen vollständigen Bericht über die Sinnesmodalitäten in Ressource Standort von Insekten verwendet, und es zeigt, dass erweiterte Informationen zum Verhalten der Ergebnisse stärken kann und Anschließend erlauben Sie mehr wissen aus jedem Experiment extrahiert werden.
Um welche flüchtige Hinweise beantworten die Erbse Motte verwendet wird, um einen geeigneten Wirtspflanze zur Eiablage zu finden, haben wir untersucht die Luv Ausrichtung der 5-7 Tage alten verpaart Weibchen gegenüber Erbsenpflanzen in verschiedenen phänologischen Phasen (Blatt, Knospe, Blüte, Pod) in den Windkanal14 . Windgeschwindigkeit war 30 cm s-1, 1000 Lux Lichtintensität, Temperatur 20-22 ° C und 60-70 % RH. Wir verwendet eine Kombination von visuellen und olfaktorischen Signale durch Platzierung der lebenden Pflanzen direkt in Luv Ende der Windkanal-Arena und vergleichen die verhaltensbezogene Antwort mit den entsprechenden Headspace-Extrakten. Wir haben auch eine synthetische Mischung von zehn antennaly aktive Erbse Pflanze Volatiles getestet. Die verhaltensbezogene Reaktion der Erbse Motte (Abbildung 3) zeigte, dass begatteten Weibchen Erbsenpflanzen mit Blumen (58 %) und Knospen (52 %) als an Erbsenpflanzen in das Blatt (10 %) oder der Pod-Bühne (24 %) viel mehr angezogen wurden. Ähnliche Reaktionen wurden beobachtet, mit den entsprechenden Headspace-Extrakte. Begatteten Weibchen waren die Headspace-Extrakte von Erbse Blütenpflanzen (56 %), gefolgt von Erbsenpflanzen mit Knospen (42 %), erhalten die meisten angezogen und niedrigen Antworten für den Pod (28 %) und die Blatt-Stadium (10 %) aufgenommen wurden. Testen eine besprühten Syntheic Mischung von zehn antennaly aktive Erbse Volatiles als Stimuli, führte eine Landung Antwort von 34 %.
Die Ergebnisse zeigen die Verbindung zwischen Host Pflanze Phänologie und die entsprechenden Pflanzen Geruch sowie deren Auswirkungen auf das Verhalten der verpaart C. Nigricana Weibchen. Begatteten Weibchen haben eine klare Präferenz für Erbsenpflanzen während der Blütenentwicklung und das damit verbundenen Geruch Profil ist entscheidend für den Host-Standort. Darüber hinaus dieses Experiment zeigt, dass verpaart C. Nigricana Weibchen können unterscheiden zwischen verschiedenen phänologischen Phasen der Erbsenpflanzen wenn nur flüchtige Hinweise zu spüren. Sensorischer Integration ist wichtig für Hostspeicherort und erhöhen die Möglichkeit, kleinere Unterschiede wahrnehmen, vor allem in Weibchen13,21,22. Dennoch waren die Landung Reaktionen auf Headspace Auszüge aus Erbse Blütenpflanzen (56 %) ohne die Anwesenheit von visuelle Hinweise in diesem Windkanal-Experiment, dasselbe wie die Reaktionen auf die reale Anlage (58 %). Die Ähnlichkeit zwischen Headspace-Extrakte, die einzige und echte Pflanzen bedeuten, dass der Geruch der grundlegenden Host Pflanze Cue für verpaart C. Nigricana Weibchen.
Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung von Kairomone Köder vom Windkanal Behavioral Assays, ist die fertige Mischung in der Bereich Umwelt übersetzen. Der Windkanal hat einen sauberen Geruch Hintergrund, während die Freilandbedingungen sind durchdrungen von Gerüche aus der umgebenden Vegetation die chemische Information verändern kann.
Versuche im Windkanal wurden mit Feld gesammelt-Weibchen bei der Windgeschwindigkeit von 30 cm s-1, 5 Lux Lichtintensität, Temperatur von 19-20 ° C und eine RH 55-65 % durchgeführt. Die Experimente mit und ohne Hintergrund Gerüche unterstützt bei der Entwicklung von flüchtigen pflanzlichen Bereich Köder für den Apfel Obst Motte Argyresthia Conjugella11. Die Ergebnisse zeigen, dass die Geruch-Spender mit einer komplexen Mischung (7 Komponenten) und eine einfache Mischung (2 Komponenten) haben ähnliche Luv Attraktion, wenn allein auf ein sauberer Hintergrund (Abbildung 4A). In einem Wahl-Assay bevorzugte jedoch mit der Feld-Dispenser eingebettet in einen Apfel flüchtige Hintergrund, Apfel Obst Motte Weibchen der Komplex aber nicht einfach mischen (Abbildung 4 b).
Die Ergebnisse zeigen, dass die Mischung Komplexität ist ein wichtiger Akteur den Pflanze Hintergrund Einfluss zu überwinden und die Hintergrund-Interaktion werden, bei der Entwicklung von Kairomone für den mobilen Einsatz berücksichtigt muss.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Windkanal befindet sich als NIBIO, Ås - Norwegen. Windkanal befindet sich in einem klimatisierten Raum. Der Luftstrom wird durch Aktivkohlefilter gefiltert, vor und nach Anwendung von Geruch und wird dann wieder in den Raum verteilt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Durchschnitt (±SE) Prozent verhaltensbezogenen Reaktion des Hexamerinaufnahme eingespieltes auf natürliche Geruch Quellen mit und ohne visuelle Reize. Der Geruch Reize war beschränkt sich auf ein Glas und stellte in den Windkanal durch eine Holzkohle gefilterten Luftstrom. Diese Zahl wurde geändert [Aak, A. & Knudsen, G. K. (2011) Geschlechtsunterschiede Geruchssinn vermittelte Sehschärfe Schmeißfliegen und ihre Folgen für geschlechtsspezifische überfüllen. Entomologia Experimentalis et Applicata 139 25-34]. Deutliche Unterschiede sind gekennzeichnet durch t-Tests (Signifikanzniveau: p = 0,05) trennen Sie auf einer Gesamtfläche von 50 fliegen pro experimentelle Behandlung mit die Durchschnittswerte basierend auf den Anteil der Responder unter 10 fliegen getestet auf fünf Tage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Prozent Antwort (±SE) von Cydia Nigricana Erbsenpflanzen in verschiedenen phänologische Stufe, die entsprechenden Headspace-Kollektion und eine synthetische flüchtige Mischung aus 10 antennaly Wirkstoffe Landung. Der Gasraum und die synthetische Mischung von ein Ultraschall Sprüher erschien. Das Pflanzenmaterial wurde direkt in der Flugarena gelegt. Diese Zahl wurde von geändert [Thöming, G., Norli, H. R., Saucke, H. & Knudsen, G. K. (2014) Erbse Pflanzen Volatiles Reiseführer Host Lage Verhalten in der Erbse Nachtfalter. Gliederfüßer-Pflanze-Interaktionen. 8 (2), 109-122]. Deutliche Unterschiede sind gekennzeichnet durch ANOVA (Signifikanzniveau: p = 0,05). Für alle Behandlungen mindestens 50 Weibchen wurden getestet und die Motte hatte 6 min, um den Geruch zu reagieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Prozentuale Argyresthia Conjugella nähert sich komplex und vereinfachte Lockstoffe (< 5 cm). (A). Luv Attraktion zum Feld-Spender ohne Hintergrund. (B). Luv Attraktion zum Feld-Spender in der Pflanze flüchtige Hintergrund eingebettet. Diese Zahl wurde von geändert [Knudsen, G. K. & Tasin, M. (2015) Schmierblutungen die Eindringlinge: ein monitoring-System basierend auf Pflanze flüchtige, Apfel Obst Motte Angriffe in Apfelplantagen zu prognostizieren. Grundlagen- und angewandte Ökologie 16 (4), 354-364]. Deutliche Unterschiede sind gekennzeichnet durch ANOVA (Signifikanzniveau: p = 0,05). Für alle Behandlungen mindestens 45 Frauen wurden getestet und die Motte hatte 5 min, um den Geruch zu reagieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der Windkanal ist ein hilfreiches Werkzeug zur Identifizierung sowohl attraktiv als auch abstoßende Gerüche für viele Insekten4,9. Mit fundierten Kenntnissen der Ökologie, Biologie und Verhalten der Insekten untersucht seine Flugeigenschaften leicht erkennbar und Umweltbedingungen, Windgeschwindigkeit, visuelle Reize und Geruch Anwendung können werden angepasst. Es wird empfohlen, beim Starten mit einer neuen Spezies zur Feinabstimmung der Windkanal-Parameter über die attraktivsten Quelle möglich. Mit Kairomone, dies ist in der Regel live-Host Pflanzenmaterial oder eine natürliche Nahrungsquelle und mit Pheromonen, ein Käfig aufrufen, weiblich oder männlich (abhängig von dem Insekt studierte). Ermittlung der Repellentien, gibt es auch eine Notwendigkeit für eine attraktive Quelle auf dem Antagonismus9messen. Diese ersten Ergebnisse dienen auch als Grundlage für weitere Experimente.
Die Windkanal-Dimensionen berücksichtigen, geben Raum für freie Bewegung und Darstellung der angeborenen Flugeigenschaften. Mit starken Flyer und große Insekten können große Flug Arenen erforderlich sein. Für kleinere Insekten kann ein Teil der Arena verwendet werden. Die Windgeschwindigkeit kann spezifisch für das Insekt sein Arten untersucht und die Flugkapazitäten angepasst werden sollte. Mit allen Geruchsstoffe, sondern vor allem mit Pheromonen sollte darauf geachtet werden, um Verunreinigungen zu vermeiden und regelmäßige Kontrolle Behandlungen unternommen werden, um falsche Schlussfolgerungen zu vermeiden.
Die Aktivkohle-Filter liefert eine leere Leinwand für die Anwendung der gewünschten Gerüche. Es kann jedoch eine Kehrseite zu reinigen Laborbedingungen, weil natürlichen Hintergrund Gerüche mit dem entwickelten Bereich Dispenser11,23interagieren können. Windkanal-Mischungen von allgegenwärtigen Volatiles auf die Freilandbedingungen zu übersetzen dann möglicherweise weniger geradlinig und Optionen zum Hintergrund gehören Gerüche im Windkanal in Betracht gezogen werden sollte. Mit Pheromonen, die verschiedene flüchtige Bestandteile sind, die Übersetzung auf Freilandbedingungen sind weniger ein Problem. Dies gilt auch für flüchtige Bestandteile aus seltenen Rohstoffen, wie z. B. Kadaver Kairomone genutzt durch Calliphorid24fliegt.
Die Spritze ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Freigabe von Volatiles bei bekannter Konzentration und Mischung Verhältnisse. Die Spritze umgeht das Problem der Berechnung Freisetzungsraten wird schnell kompliziert. Mit gespritzten Headspace ist es einfach, die Effizienz einer flüchtigen Headspace-Sammlung zu vergleichen, durch den Vergleich der Anziehungspunkt für lebende Pflanzen und intakte pflanzlichen Rohstoffen. Der Inhalt in volatilen Sammlungen kann mit einem Gaschromatographen mit einem Massenspektrometer gekoppelt identifiziert werden. Die Sprayer nutzt eine Lösungsmittel verdünnte Probe. Das Lösungsmittel kann interagieren mit Insekt Flugleistungen und sollte darauf geachtet werden, um die Auswirkungen zu identifizieren. Ethanol ist ein Lockstoff für einige Insektenarten, zB., Woodboring Käfer25. Da die Spritze funktioniert durch Vibrieren bei Ultraschallfrequenzen, sollte auch geachtet werden, die Anti-räuberische Reaktion auf bestimmte Arten in der Lage erkennen Fledermäuse26betrachten.
Anziehung von kriechenden Insekten könnten auch in einem Windkanal27getestet werden. Eine erhöhte Plattform, parallel zum und im Zentrum von der Geruch Plume könnte dann im Inneren der Arena28eingebaut werden. Jedoch sollte besondere Sorgfalt Verunreinigung Probleme behandelt.
Der Windkanal kann auch ein leistungsfähiges Werkzeug zur biotechnologische Lösungen zu überprüfen, wie eine Studie über gentechnisch veränderte Vitis Vinifera mit veränderten Kairomone Emission Verhältnis Pflanzen und entsprechenden L. Botrana Attraktion hat29gezeigt. Transgene Pflanzen Headspace extrahiert und synthetische-Mischungen wurden für L. Botrana Attraktion im Windkanal getestet und führte zu reduzierten Attraktion im Vergleich zu Kontrollpflanzen V. Vinifera29.
Es gibt jedoch einige Einschränkungen für die Nutzung von Wind-Tunnel, die in jedem Einzelfall sorgfältig geprüft werden sollte. Wie Insekten normalerweise nur einmal in der Arena verwendet werden, ist Art mit langen Generationszeit weniger ideal für Windkanal Experimente. Auch können rote aufgeführten Arten umstritten, in Verhaltensstudien Labor zu testen. Jedoch Schadinsekten, ein erheblicher Bedarf an attraktiven Köder besteht, haben in der Regel kurze Generationszeit und ausreichender Zahl aus Feldauflistung oder eine Aufzucht Protokoll gewonnen werden können.
Der Windkanal hat sicherlich seinen Platz in der chemischen Ökologie Verhaltensstudien. Es kann auf verschiedene Weise, je nach Budget, gebaut werden und Funktionalität kann hinzugefügt werden, um mit verschiedenen Forschungsfragen zu passen. Der Windkanal hat den Vorteil, dass Beobachtungen und Messungen der das Flugverhalten der Insekten Reaktionen auf Gerüche und andere Sinnesreize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine
Acknowledgments
M. Tasin wurde vom schwedischen Forschungsrat für nachhaltige Entwicklung (Formas, Grant 2013-934) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flight arena | any | NA | Construct to fit the filter housing |
| Filter housing x 2 | Camfill Farr | Contains the dust and charcoal filters | |
| Fan x 2 | Fischbach | Model D640/E35 | Silent fan with continous dimmer switch |
| Perforated grids | any | NA | Two different open areas are needed, e.g. 54 and 51% |
| Flowmeter | Swema air | Swema air 300 | Identifying the wind speed |
| Ultrasonic sprayer | SonoTek | Sprayer nozzle with conical tip and inserted microbore | |
| Broadband ultrasonic generator | SonoTek | Function generator | |
| Syringe pump | CMA microdialysis | CMA 102 | Liquid delivery |
| FEP tubing | CMA microdialysis | 0.12 mm inner diameter | |
| Tubing adaptors | CMA microdialysis | Connectors for zero internal volume | |
| Gastight syringe | any | NA | 1000 µL syringe for headspace collections and synthetic blends |
| Gastight syringe | any | NA | 1000 µL syringe for cleaning sprayer |
| Torch | any | NA | Small light source for checking sprayer release |
| Timer | any | NA | Timer with alarm function |
| Holder for insect release | any | NA | Metal construction |
| Lighting | any | NA | LED is preferable due to low heat production |
| Moisturiser | any | NA | Size depends on volume of wind tunnel room |
| Temperature control | any | NA | Temperture range depends on species |
| Glass tubes | any | NA | Tubes (2.8 cm diameter, 13 cm long) for insects |
| Snap cap | any | NA | Snap cap that fits the glass tube |
| Gauze | any | NA | Fabric to close the glass tube |
| Rubber band | any | NA | To hold gauze in place |
| Glass cylinder | any | NA | Cylinder for odour containment and landing platform (10 cm diameter, 12.5 cm long) |
| Glass jars | any | NA | Glass jars for dynamic headspace collection |
| Connectors and tubes | any | NA | Tubes and connectors depends on type of glass jars |
| Air supply | any | NA | From laboratory air or bottles |
| Charcoal filters | any | NA | For cleaning the outside air sypply |
| Vial | any | NA | Small vial with water to keep plant material fresh |
| Oven | any | NA | Heat metal and glassware to 300 degrees to decontaminate |
References
- Hansson, B. S., et al. Insect olfaction. , Springer. Berlin Heidelberg. (1999).
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor Plumes and How Insects Use Them. Annual Review of Entomology. 37, 505-532 (1992).
- Todd, J. L., Baker, T. Ch. 3. Insect olfaction. Hansson, B. , Springer. 67-96 (1999).
- Carde, R. T., Willis, M. A. Navigational strategies used by insects to find distant, wind-borne sources of odor. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 854-866 (2008).
- Baker, T. C., Fadamiro, H. Y., Cosse, A. A. Moth uses fine tuning for odour resolution. Nature. 393 (6685), 530 (1998).
- Bruce, T. J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Insect host location: a volatile situation. Trends in Plant Science. 10 (6), 269-274 (2005).
- Srinivasan, M. V., Zhang, S. W.
- Rhainds, M., Kettela, E. G., Silk, P. J. Thirty-five years of pheromone-based mating disruption studies with Choristoneura fumiferana (Clemens) (Lepidoptera: Tortricidae). Canadian Entomologist. 144 (3), 379-395 (2012).
- Sharpington, P. J., Healy, T. P., Copland, M. J. W. A wind tunnel bioassay system for screening mosquito repellents. Journal of the American Mosquito Control Association. 16 (3), 234-240 (2000).
- Baker, T. C., Linn, C. E. Techniques in pheromone research. Hummel, H. E., Miller, T. A. , Springer. 75-110 (1984).
- Knudsen, G. K., Tasin, M. Spotting the invaders: A monitoring system based on plant volatiles to forecast apple fruit moth attacks in apple orchards. Basic and Applied Ecology. 16 (4), 354-364 (2015).
- Knudsen, G. K., Norli, H. R., Tasin, M. The ratio between field attractive and background volatiles encodes host-plant recognition in a specialist moth. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Aak, A., Knudsen, G. K. Sex differences in olfaction-mediated visual acuity in blowflies and its consequences for gender-specific trapping. Entomologia Experimentalis et Applicata. 139, 25-34 (2011).
- Thöming, G., Norli, H. R., Saucke, H., Knudsen, G. K. Pea plant volatiles guide host location behaviour in the pea moth. Arthropod-Plant Interactions. 8 (2), 109-122 (2014).
- El-Sayed, A., Godde, J., Arn, H. Sprayer for quantitative application of odor stimuli. Environmental Entomology. 28 (6), 947-953 (1999).
- Haynes, K. F., Baker, T. C. An analysis of anemotactic flight in female moths stimulated by host odour and comparison with the males' response to sex pheromone. Physiological Entomology. 14 (3), 279-289 (1989).
- Spitzen, J., Takken, W. Keeping track of mosquitoes: A review of tools to track, record and analyse mosquito flight. Parasites and Vectors. 11 (1), (2018).
- Masante-Roca, I., Anton, S., Delbac, L., Dufour, M. -C., Gadenne, C. Attraction of the grapevine moth to host and non-host plant parts in the wind tunnel: effects of plant phenology, sex, and mating status. Entomologia Experimentalis et Applicata. 122 (3), 239-245 (2007).
- Johansen, H., et al. Blow fly responses to semiochemicals produced by decaying carcasses. Medical and Veterinary Entomology. 28, 9 (2014).
- Paczkowski, S., Maibaum, F., Paczkowska, M., Schutz, S. Decaying Mouse Volatiles Perceived by Calliphora vicina Rob.-Desv. Journal of Forensic Sciences. 57 (6), 1497-1506 (2012).
- Aluja, M., Prokopy, R. J. Host odor and visual stimulus interaction during intratree host finding behavior of Rhagoletis pomonella flies. Journal of Chemical Ecology. 19 (11), 2671-2696 (1993).
- Reeves, J. Vision should not be overlooked as an important sensory modality for finding host plants. Environmental Entomology. 40 (4), 855-861 (2011).
- Knudsen, G. K., et al. Discrepancy in laboratory and field attraction of apple fruit moth Argyresthia conjugella to host plant volatiles. Physiological Entomology. 33 (1), 1-6 (2008).
- Aak, A., Knudsen, G. K., Soleng, A. Wind tunnel behavioural response and field trapping of the blowfly Calliphora vicina. Medical and Veterinary Entomology. 24, 250-257 (2010).
- Montgomery, M. E., Wargo, P. M. Ethanol and other host-derived volatiles as attractants to beetles that bore into hardwoods. Journal of Chemical Ecology. 9 (2), 181-190 (1983).
- Skals, N., Anderson, P., Kanneworff, M., Löfstedt, C., Surlykke, A. Her odours make him deaf: Crossmodal modulation of olfaction and hearing in a male moth. Journal of Experimental Biology. 208 (4), 595-601 (2005).
- Willis, M. A., Avondet, J. L., Zheng, E. The role of vision in odor-plume tracking by walking and flying insects. Journal of Experimental Biology. 214 (24), 4121-4132 (2011).
- Martel, J. W., Alford, A. R., Dickens, J. C. Laboratory and greenhouse evaluation of a synthetic host volatile attractant for Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say). Agricultural and Forest Entomology. 7 (1), 71-78 (2005).
- Salvagnin, U., et al. Adjusting the scent ratio: using genetically modified Vitis vinifera plants to manipulate European grapevine moth behaviour. Plant Biotechnology Journal. 16 (1), 264-271 (2018).
