मापने जिगर Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स Holstein डेयरी मवेशियों में Mitochondrial श्वसन अनुमान करने के लिए
Summary
यहां, हम mitochondrial ऑक्सीजन की खपत, पोषण ऊर्जावान की एक परिभाषित अवधारणा को मापने के लिए तरीकों का हिस्सा है, और प्रोटॉन रिसाव, एटीपी के mitochondrial पीढ़ी में अक्षमता का प्राथमिक कारण । इन परिणामों के लिए पोषक तत्व उपयोग में खो ऊर्जा के 30% के लिए खाते में मदद mitochondrial समारोह का मूल्यांकन कर सकते हैं ।
Abstract
ऑक्सीजन की खपत, प्रोटॉन मकसद बल (PMF) और प्रोटॉन रिसाव mitochondrial श्वसन की माप कर रहे हैं, या कितनी अच्छी तरह mitochondria नध में और फॊध को एटीपी में परिवर्तित करने में सक्षम हैं. चूंकि mitochondria भी ऑक्सीजन का उपयोग करें और कार्बन डाइऑक्साइड और पानी के लिए पोषक तत्व ऑक्सीकरण के लिए प्राथमिक साइट हैं, कैसे कुशलतापूर्वक वे ऑक्सीजन का उपयोग करें और एटीपी का उत्पादन सीधे पोषक तत्व चयापचय, पशु के पोषक तत्वों की आवश्यकताओं की दक्षता से संबंधित है, और पशु का स्वास्थ्य । इस विधि के प्रयोजन के लिए mitochondrial श्वसन, जो विभिंन दवाओं, आहार और mitochondrial चयापचय पर पर्यावरणीय प्रभाव के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की जांच है । परिणाम में शामिल है ऑक्सीजन की खपत के रूप में मापा प्रोटॉन निर्भर श्वसन (राज्य 3) और प्रोटॉन रिसाव निर्भर श्वसन (राज्य 4). राज्य 3/राज्य के अनुपात में 4 श्वसन श्वसन नियंत्रण अनुपात (RCR) के रूप में परिभाषित किया गया है और mitochondrial ऊर्जावान दक्षता का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । Mitochondrial प्रोटॉन रिसाव एक प्रक्रिया है कि Mitochondrial झिल्ली क्षमता के अपव्यय की अनुमति देता है (एमएमपी) द्वारा uncouplन ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण से ADP एटीपी संश्लेषण की दक्षता कम. mitochondrial सब्सट्रेट और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला अवरोधकों के साथ ऑक्सीजन और TRMP + संवेदनशील इलेक्ट्रोड राज्य 3 और राज्य 4 श्वसन, mitochondrial झिल्ली PMF (या एटीपी का उत्पादन करने की क्षमता) और प्रोटॉन रिसाव को मापने के लिए उपयोग किया जाता है । इस विधि के लिए सीमाएं है कि जिगर ऊतक के रूप में संभव के रूप में ताजा होना चाहिए और सभी बायोप्सी और परख से कम 10 में प्रदर्शन किया जाना चाहिए एच । यह उन नमूनों की संख्या को सीमित करता है जिंहें एक दिन में किसी एकल व्यक्ति द्वारा लगभग 5 तक संग्रहीत और संसाधित किया जा सकता है । हालांकि, जिगर ऊतक के केवल 1 जी की जरूरत है, इसलिए बड़े जानवरों में, ऐसे दुधारू मवेशी के रूप में, आवश्यक नमूना की मात्रा जिगर के आकार के लिए छोटे रिश्तेदार है और वहाँ कम वसूली समय की जरूरत है.
Introduction
Mitochondria बहुत तनाव के प्रति संवेदनशील होते है और उनके सेलुलर वातावरण चयापचय रोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए योगदान कर सकते हैं । ऑक्सीजन की खपत और mitochondria में प्रोटॉन रिसाव mitochondria स्वास्थ्य के संकेतक हैं । इस पेपर में वर्णित विधियों का अनुमान mitochondrial ऊर्जा दक्षता के साथ और प्रोटॉन रिसाव के बिना ऑक्सीजन खपत पर आधारित RCR का उपयोग कर । इन परिणामों के पोषक तत्व उपयोग1में खो ऊर्जा का 30% के लिए खाते में कर सकते हैं । ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव में परिवर्तन mitochondrial रोग है जो चयापचय रोग और कम ऊर्जा दक्षता में परिणाम के लिए योगदान की पहचान कर सकते हैं । इन तरीकों को भी mitochondrial श्वसन पर विभिंन उपचार के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स को मापने के समग्र लक्ष्य के लिए mitochondrial समारोह और ऊर्जावान दक्षता का आकलन है ।
यकृत mitochondrial रोग डेयरी मवेशियों में कई बीमारियों के साथ जुड़ा हुआ है । सेलुलर चयापचय की क्षमता कार्बोहाइड्रेट और लिपिड ईंधन के बीच स्विच करने के लिए जब जल्दी स्तनपान में एक ऊर्जा घाटे के साथ सामना करना पड़ा संख्या और सेल में mitochondria के समारोह से प्रभावित है2। mitochondria की क्षमता में दोष ऊर्जा के लिए एक वृद्धि की मांग के लिए अनुकूल करने के लिए और वृद्धि हुई β-ऑक्सीकरण इंसुलिन प्रतिरोध के साथ जुड़े intracellular लिपिड के संचय के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और जल्दी स्तनपान डेयरी गायों में फैटी लीवर के गठन के लिए ले सकता है । Mitochondria, कीटोंन शरीर के उत्पादन और उपयोग की साइट के रूप में, डेयरी गायों3में ketosis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं । mitochondria या mitochondrial शिथिलता की कमी की परिधि के लिए ईंधन की उपलब्धता को प्रभावित करेगा और ऑक्सीजन की खपत या RCR में परिवर्तन में परिलक्षित होगा ।
सूजन के जवाब में Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत में बदलाव । सात दिन पुराने विवादों बेतरतीब ढंग से एक Eimeria maxima और एक नियंत्रण समूह4से संक्रमित समूह को सौंपा गया । विवाद करने वालों कि coccidiosis चुनौती से गुजरना नहीं था कम ऑक्सीजन की वजह से प्रोटॉन रिसाव और उच्च RCR का संकेत है कि जिगर mitochondria प्रोटॉन रिसाव में वृद्धि से एक प्रतिरक्षा चुनौती का जवाब की खपत थी । जबकि प्रोटॉन रिसाव और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन एक बार mitochondrial झिल्ली शिथिलता और ऊर्जावान दक्षता के लिए हानिकारक का संकेत माना जाता था, अब यह ज्ञात है कि यह mitochondria में प्रोटीन और कैल्शियम के आयात के लिए महत्वपूर्ण है5 , और1गर्मी की पीढ़ी के लिए ।
श्वसन श्रृंखला से इलेक्ट्रॉन रिसाव प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन और mitochondrial झिल्ली प्रोटीन, लिपिड और mitochondrial डीएनए को ऑक्सीडेटिव क्षति के लिए अतिसंवेदनशील mitochondria बनाता है । के रूप में mitochondria उंर, नुकसान विशेष रूप से mitochondrial चयापचय6 में आगे की शिथिलता और रोग के लिए गाय की अधिक संवेदनशीलता पैदा mtDNA के लिए जमा कर सकते हैं । व्यवहार में, कई पशुधन जानवरों की खुराक के उच्च स्तर जैसे घन, Zn और Mn के लिए एंटीऑक्सीडेंट समारोह को बढ़ावा देने के लिए खिलाया जाता है । हालांकि, घन, Zn और Mn के उच्च स्तर खिला दूध उत्पादन में कमी आई और प्रोटॉन रिसाव (राज्य 4 श्वसन) के कारण ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि हुई7।
मवेशियों में ऊर्जा क्षमता में mitochondrial समारोह की भूमिका पर पिछले अनुसंधान mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव में परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित किया है । बहुत कुछ अध्ययनों से दुधारू मवेशियों में प्रकाशित किया गया है और अधिकांश कागजात अवशिष्ट फ़ीड सेवन (RFI) के रूप में उत्पादन क्षमता की तुलना मांस मवेशियों में mitochondrial समारोह के लिए । mitochondrial श्वसन दरों में परिवर्तनशीलता दोनों स्तनपान कराने वाली Holstein गायों और स्तनपान कराने वाली बीफ़ गायों (एंगस, Brangus और Hereford)8से जिगर में राज्य 3, राज्य 4 और RCR को मापने के द्वारा जांच की गई । शोधकर्ताओं ने mitochondrial श्वसन में कोई संबंध वृद्धि या मांस मवेशियों के लिए दुहना लक्षण के साथ नहीं मिला, लेकिन mitochondrial श्वसन और Holsteins के लिए गुण दुहना के बीच एक संबंध की रिपोर्ट किया था । दो अध्ययनों में, RFI मांस मवेशियों की तुलना में mitochondrial श्वसन दर (राज्य 3, राज्य 4 और RCR) मांसपेशी mitochondria9,10में किया गया था । Mitochondrial श्वसन दर DMI और कम दरों के जवाब में बदल कम कुशल बीफ़ बिजनस के साथ जुड़े थे । एक अन्य अध्ययन में, उच्च या निम्न RFI सांडों से RFI की तुलना mitochondrial श्वसन दरों और संतान के दो समूहों के बीच प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स से की गई11. मतभेदों को निष्कर्ष है कि लाभ बीफ़ मवेशियों में mitochondrial श्वसन प्रभाव नहीं है पुष्टि लाभ के कारण थे ।
इस पत्र में, एक प्रयोग के जवाब में जिगर RCR की जांच 3 एंटीऑक्सीडेंट खनिजों स्तनपान कराने वाली डेयरी पशु के लिए तरीकों का उपयोग करने के लिए 4 राज्य और राज्य 3 श्वसन और PMF के दौरान ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए दिखाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण बिंदु एक प्रतिनिधि जिगर ऊतक नमूने प्राप्त करने और बायोप्सी के बाद जितनी जल्दी हो सके mitochondria के अलगाव की शुरुआत है । श्वसन मापन में भिन्नता कम है (तालिका 1) गाय से प्रयो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध Alltech और USDA हैच धन द्वारा खाद्य पशु स्वास्थ्य के लिए UC डेविस स्कूल में पशु चिकित्सा के केंद्र के माध्यम से समर्थन किया गया था ।
Materials
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
References
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