Summary
이 문서는 기본 폭발 외상 성 뇌 손상의 새로운 모델을 설명합니다. 압축 공기 구동된 충격 튜브는 단일 충격파를 마우스 hippocampal 슬라이스 문화 체 외에 노출 하는 데 사용 됩니다. 이것은 높은 처리량을 가진 재현할 수 뇌 조직 손상 생성 하는 간단 하 고 빠른 프로토콜 이다.
Abstract
외상 성 뇌 손상 죽음 및 군과 민간인 인구에서 장애의 주요 원인입니다. 그러나 폭발 장치, 폭발에서 돌풍 외상 성 뇌 부상 결과, 폭발 압력 노출에서 유래한 뇌 손상의 기반이 되는 메커니즘 완전히 이해 되지 않는다 고 뇌 손상의이 유형에 고유한 것으로 추정 된다. 전 임상 모델은 폭발 유도 뇌 손상 더 나은 이해에 기여 하는 중요 한 도구입니다. 소설 체 외에서 폭발 TBI 모델 프리 파형에 의해 만들어진 실제 오픈 필드 폭발 파도 시뮬레이션 하는 전면적인 충격 튜브를 사용 하 여 개발 되었다. C57BL/6N 마우스 organotypic hippocampal 슬라이스 문화 단일 충격파에 노출 됐다 고 상해의 개발 했다 72 h 세포 침투 propidium 요오드 화물, 세포 손상만의 잘 설립 형광 마커를 사용 하 여 최대 특징 세포 막 손상. Propidium 요오드 화물 형광 조각 프로토콜의 기간 내내 가짜 조각에 비해 폭발 파에 노출에 상당히 높았다. 뇌 조직 손상 매우 재현 하 고 적용 하는 충격파의 피크 압력에 비례 이다.
Introduction
폭발 외상 성 뇌 손상 (TBI) 폭발 장치1,2의 폭발에서 발생 하는 뇌 손상의 복잡 한 형식입니다. 폭발 TBI 이라크와 아프가니스탄2,3최근 군사 충돌로 지난 15 년 동안 건강 문제는 메이저로 떠오르고 있다. 전반적으로, 그것은 그 4.4%와 22.8% 이라크와 아프가니스탄에서 돌아온 군인의 고통을 온화한 TBI, 영국 세력4와 비교 하는 미군에서 폭발 TBI의 높은 보고 된 속도와 폭발에 관련 되는 이들의 큰 비율 추정 ,5.
즉흥적으로 폭발 장치를 사용 하 여 폭발 관련 된 외상, 폭발 TBI, 군대6인 내를 포함 하 여의 대부분에 대 한 책임 되었습니다. 매우 빠른 귀착되는 폭발물의 폭발-하지만 과도-밀리초에서 발생 하는 압력에 있는 증가. 실제 무료 필드 폭발에서 결과 압 파 프리 기능 뒤에 지 수 감퇴7,8피크 압력을 갑자기 증가 함께 모델입니다. 극단적인 세력과 폭발 이벤트에서 본 그들의 급속 한 시간 코스의 범위는 일반적으로 비 폭발 충격1,9에서 경험 하지. 파형의 최대 압력 이며 긍정적인 파 기간 피크 압력 폭발 뇌 손상에 중요 한 헌 납 될 것으로 추정 된다 고이 폭발성 충전 및 폭발10, 거리에 따라 달라 집니다. 11.
외상 폭발성 폭발에서 결과 기본, 2 차, 3 차 및 4 급 폭발 부상10,12,,1314로 지정 하는 4 개의 개별 부품으로 분류 됩니다. 이러한 각 구성이 요소는 상해의 특정 메커니즘에 연관 됩니다. 1 차 폭발 부상 장기와 조직2,13에 압력 파의 직접 행동에서 유래한 다. 두 사물 파편의 영향에서 2 차 폭발 부상 결과,2,15상처를 일으키는 관통 및 관통 비. 3 차 폭발 부상 피해자의 시체 지상 또는 주변 개체에 대 한 난민은 가속/감속 세력1,,1013와 연결 하는 경우 발생 합니다. 제 사기 돌풍 상해 처음 3 부상 메커니즘 설명된12,13에 의해 포함 되지 않는 폭발에 직결 하는 상해의 다른 유형의 그룹을 설명 합니다. 그것은 포함 한다 (하지만에 국한 되지 않습니다) 열 상해, 연기 흡입, 방사선, 전자파, 그리고 심리적 부작용13,15. 대부분 폭발 관련 TBI 폭발 부상의 제 사기 메커니즘은 일반적으로 관련 된 조직의 부상13상해의 처음 세 가지 메커니즘에서 직접 발생 합니다. 효과의 가속/감속 세력 (예, 골절), 둔 하 고 관통 외상 성 뇌 손상 광범위 하 게 연구 TBI (예를 들어, 자동차 충돌, 폭포, 탄도 상해)의 다른 종류에 관하여. 그러나, 기본 폭발 압력 파와 폭발 부상에 독특한 뇌 조직에 미치는 효과 훨씬 잘 이해16. 압력 파와 관련 된 기본 폭발 부상 메커니즘 두뇌와 상호 작용 하는 기계적인 힘의 처음은.
부상 및 병 태 생리학의 폭발 TBI 메커니즘을 이해 하 고 그렇지 않으면 불가능 한 것만 할 잠재적인 새로운 치료 조사에 귀중 한 되었습니다. 지난 수 십년 동안 수많은 임상 TBI 모델 개발 되었습니다. 임상에서는17,,1819설정합니다. 아니 단일 전 임상 모델 임상 폭발 두뇌 외상의 복잡성을 재현할 수, 있지만 일반적으로 다른 전 임상 TBI 모델 인간의 TBI의 복제. 폭발 폭발과 관련 된 세력의 파괴적인 행동은 고립에서 또는 생체 외에서 그리고 vivo에서 폭발 TBI 모델에서 조합에서 공부 될 수 있다. 생체 외에서 모델을 생물 학적 다양성 감소의 연구 허용 재현성 향상 실험 환경 (조직 생리 조건 및 상해 역학), 꽉 제어를 허용의 이점이 있다 특정 분자 confounders 동물에20모델 없이 폭포. 우리의 목표는 뇌 조직에 1 차 폭발의 효과 조사 하기 위해 생체 외에서 모델을 개발 했다. 우리는 즉흥적으로 폭발 장치 (IED)에 의해 생산 등 무료 필드 폭발 프리 파형 대표 초음속 충격파를 사용 하 여 모델을 개발을 목적으로.
Protocol
이 원고에 설명 된 실험 영국 동물 (과학적인 절차) 행위 1986의 준수 했 고 동물 복지 및 윤리 검토 본문의 임페리얼 칼리지 런던에 의해 승인 되었습니다. 동물 보호는 임페리얼 칼리지 런던의 기관 지침을 준수 했다.
1. hippocampal Organotypic 슬라이스 준비와 문화
참고:이 프로토콜 인터페이스 방법 Stoppini와 동료 사소한 수정21,,2223설명 organotypic hippocampal 조각의 생산 수 있습니다. 이상적으로, 더 이상 세 동물 안락사 하 고 각 단계는 신속 하 게 이루어집니다 보장 조각의 품질 저하를 방지 하 고 한 세션에서 해 부 될 해야 합니다. 통해 무 균 기술을 사용 합니다.
- 해 부 프로토콜을 시작 하기 전에 다음 단계를 수행 하는 확인 하십시오.
- 준비 하 고 필터 소독 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 사전에 모든 솔루션.
- 계속 저장 동안 및 뇌 해 부와 금속 방열판에 저장 그릇 및 접시를 유지 하 여 hippocampal 슬라이스 준비 4 ° C에서 솔루션 항상 젖은 얼음에 앉아.
- 오토 클레이 브 모든 금속 계기, 반지 및 종이 조직.
- 모든 악기와 프로토콜의 각 단계에 사용 될 재료 준비가 사용, 사전에 계획 하 고 70% 에탄올 뿌리 확인. 그들은 진정 하 고 건조 허용 되는 확인 하십시오.
- 5-7 일 안락사-오래 된 C57BL/6N 강아지 자 궁 경부 전위에 의해 마우스와 짧게 전체 피부 표면 살 균 종이 조직 70% 에탄올에 적셔 닦아. 건조 피부를 두 드려 고 메이 위를 사용 하 여 강아지 목을 벨.
- 머리 후 두 지역에서 시작 하 고 주 둥이 근처 결말의 중간 선 따라가 위로 아이리스 두 피 피부를 잘라내어 옆으로 그것을 철회.
- 구멍 매그넘에 욕실이 위 끝을 삽입 하 고 가로 sinuses 따라 뼈에 두 개의 작은 측면 상처를 만들 다음 嗅까지 중간 선 따라 두개골을 잘라이 지역에서 중간에 수직으로 두 개의 작은 상처 확인.
- 잘 사용 하 여 곡선된 겸 자, 옆으로 중간에서 뼈의 플랩 철회, 신중 하 게 작은 주걱으로 두뇌를 제거 가리키고 90 m m 실리콘 탄성 중합체 코팅 페 트리 접시 포함 하는 "해 부 매체"에 그것을 전송.
주: 해 부 매체 Gey의 균형 (5 mg/mL D-포도 당, 10000 단위/mL 페니실린, 10 mg/mL 스와 25 µ g/mL 암포 B 1% 항생제 antimycotic 솔루션) 소금 솔루션입니다. - 소 뇌를 제거 하 고 면도날을 사용 하 여 중간 선 따라 대뇌 반구를 분리. 주걱을 사용 하 여 새로운 90 m m 실리콘 탄성 중합체 코팅 페 트리 접시 가득 신선한 얼음 처럼 차가운 해 부 매체에 대뇌 반구를 전송. 하나 이상의 동물 한 세션에서 사용 될 것 이다, 단계 1.2-1.6을 반복 합니다.
- Stereomicroscope에서 嗅과 면도날으로 담당의 끝을 잘라 하 고 대뇌 피 질 좋은 팁 집게를 사용 하 여 뇌 조직의 나머지 부분에서 분리 합니다. 이 단계는 해 마는 대뇌 피 질의 조직의 내측 표면에 노출 나뭇잎. 앞으로이 단계에서 층 류 조직 문화 후드 (자외선 살 균 및 70% 에탄올 용액으로 세척)를 사용 합니다.
- 평평한 플라스틱도 마 디스크에 얼음 처럼 차가운 해 부 매체를 적용 하 고, 외피의 중간 표면 위로 향하도록 고 해 마의 축이도 마 칼 날의 축에 수직이 되도록 디스크에 뇌 조직의 위치는 주걱을 사용 하 여.
- 좋은 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 자르고 디스크에서 해 부 매체의 가능한 한 많이 제거 합니다.
- 두뇌 조직 헬기를 사용 하 여 50%도 마 속도 400 µ m 조각으로 잘라와 강제.
참고:이 단계는 가능한 한 빨리 뇌 조직 절 개 매체에 잠긴 하지는 작업 매우 중요 하다. - 신선한 얼음 중간에 실리콘 엘라 스토 머 코팅 페 트리 접시에 해 부 매체를 바꿉니다.
- 조직 헬기 완료 되 면 신중 하 게 잠수함 신선한 절 개 매체에 뇌 조직 그리고 컷된 조직 다시 90 m m 실리콘 탄성 중합체 코팅 페 트리 접시에 직선 블레이드 메스를 사용 하 여 전송.
- Stereomicroscope에서 신중 하 게 좋은 팁 집게를 사용 하 여 대뇌 피 질의 조각 구분 합니다. 각 조각에 대 한 형태학 및 잠재적인 조직 손상에서 해 부 결과 또는 슬라이스 해 마 검사.
- 좋은 팁 겸과 작은 욕실이 위를 사용 하 여 fimbria entorhinal 외피에서 오가는 된을 구분 합니다. 일반적으로, 약 6 ~ 8 hippocampal 조각 반구 당 생성 됩니다.
- 최대 6 hippocampal 조각 컷을 사용 하 여 조직 문화 삽입 전송 파스퇴르 피 펫 및 장소 안에 35 mm 페 트리 접시. 조각 몇 밀리미터 간격 (이렇게 하면 각 슬라이스를 개별적으로 수행해 수) 보급 되어 있는지 확인 합니다.
- 즉시 차가운 추가 테두리를 삽입 하는 "성장 매체" 각 페 트리 접시의 바닥에 조직 문화 삽입 아래 조직 문화의 상단 바로 아래.
참고: 성장 매체 포함 50% 최소 필수 매체 독수리, 25% 행 크 스 소금 솔루션, 25% 말 혈 청, 5 mg/mL D-포도 당, 2 mmol/L L-글루타민, 1% 항생제 antimycotic 솔루션, 그리고 10 mmol/L HEPES, 수산화 나트륨으로 pH 7.2에 적정 균형. - 성장 매체는 절 개 후 일과 다음 2 ~ 3 일 마다 그 후 (37 ° C에서 사용 성장 매체)를 변경 합니다. 성장 매체 추가 됩니다 충분 한 금액, 하지만 너무 많은 조직 조각의 생존 능력을 손상 시킬 수 있는 조직 문화 삽입 막에 오버플로 확인 하십시오.
- 12 ~ 14 일 실험에 사용 되 고 이전에 대 한 5% 이산화탄소 공기에서 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 조직 조각을 유지.
2. 준비 Hippocampal Organotypic 조각의 실험 폭발 TBI 프로토콜에 대 한
참고: 이미지를 제외 하 고이 섹션의 모든 단계는 층 류 두건은 조직 문화에 자리를 차지할.
- 6 잘 플레이트 (잘 당 하나)로 주문 품-스테인리스 링을 삽입 합니다.
참고 사항: 고리 (이 12 시 위치에 앉아서 해야) 노치 테두리 고 웰 스, 조직 문화를 삽입 하는 동안 내부 석판에 맞는이 림에 쉽게 맞는. 확인 반지는 살 균 소독 제와 세척, 철저 하 게 압력가 순화 된 물으로 씻어 서 미리 진정 허용. - 혈 청 무료 미리 따뜻하게 (37 ° c) 6 잘 플레이트의 우물을 채우기 propidium 요오드 화와 함께 "실험 매체".
참고: propidium 요오드 화물와 실험 매체는: 75% 최소 필수 매체 독수리, 25% 행 크 스 소금 솔루션, 5 mg/mL D-포도 당, 2 mmol/L L-글루타민, 1% 항생제 antimycotic 솔루션, 10 mmol/L HEPES, 4.5 µ / L propidium 요오드 화물, 적정 한 pH 균형 to 수산화 나트륨과 7.2. - 매체의 레벨 링의 노치 위에 도달 하지 않는 확인 하십시오. 6 잘 플레이트 반지와 매체 조직 문화 삽입 전송 직전 37 ° C에는 되도록 1 시간에 대 한 보육 다시 전송.
- 고리와 6 잘 플레이트와 포 셉와 함께 실험 매체에 35 mm 페 트리 접시에서 organotypic 조각으로 조직 문화 삽입을 전송.
- 영구 마커 펜으로 점 3 시 위치에 삽입에 확인 하십시오.
참고: 삽입 실험 기간 동안 6 잘 플레이트에서 제거 하 고이 단계를 용이 하 게 삽입을 원래 위치로 돌아가는 충격파 노출 후와 쉽게 추적 하는 프로토콜을 통해 각 슬라이스. - 고유 이름 및 날짜와 함께 각 6 잘 플레이트 고 명명 각 잘 각 격판덮개의 우물의 지도 (예., A, B, C, 등.) 각 잘에서 각 조각 (예., 1, 2, 3, 등.), 각 조각에는 고유 식별자 ( 예를 들어., A1, A2, A3, 등.).
- 6 잘 플레이트 되도록 조각 이미징 직전 37 ° C에서 1 시간에 대 한 보육을 전송 합니다.
주: 매체의 오버플로 방지 또는 조직 문화 아래 공기의 모든 거품 삽입 조각의 생존 능력을 손상 시킬 수 있는 막. - 실험적인 매체에 전송 후 1 시간, 각 이미지 조각 부상 전에 슬라이스 상태를 평가 하는 적절 한 자극 (BP 535/50 nm), 방출 (LP 610 nm) 필터 형광 현미경 (2 X 목표, 나 0.06)를 사용 하 여 개별적으로 프로토콜은 수행 된다.
노트: 짙은 빨간색이이 단계에서 얼룩의 영역을 전시 조각 손상된 가능성을 제시 하는으로 간주 한다와 (이 일반적으로 생성 하는 조각의 총 수의 10% 미만 대표) 추가 분석에서 제외 해야 합니다. 이미징 및 슬라이스 인큐베이터 밖에 있는 시간을 최소화 하기 위해 가능한 한 신속 하 게 순차적으로 수행 됩니다 확인 (일반적으로 6 우물 바로 아래 30 분을 취해야 이미지). - 항상 6-잘 접시의 뚜껑을 유지. 일부 결로 뚜껑의 안쪽에 쌓일 수 있습니다. 이 경우, 낮은 조정에 짧게 헤어 드라이어를 사용 합니다.
- 다른 일에 그리고 실험 사이 모든 이미징 조건 동일 인지 확인 합니다.
참고: 이미지의 목표는 조직의 형광 계량, 그러므로이 단계는 중요 한 결과의 재현성을 보장 하 고 얻은 데이터의 비교를 허용.
3. 침수 및 조직 문화의 전송 Hippocampal Organotypic 조각으로 삽입
- 이미징, 직후 층 류 두건에 집게를 사용 하 여 6 잘 플레이트에서 하나의 조직 문화 삽입을 가져가 라.
- 조심 스럽게 멸 균 폴 리 에틸렌 가방 (3 "x 5")을 삽입 미리 가득 따뜻한 (37 ° C) 실험 매체의 20 mL 갓 이전 95% 산소와 5% 이산화탄소와 버블링.
주: 산소와 이산화탄소 농축된 실험 매체와 95% 산소와 5% 이산화탄소 Dreschel 병 안에 scintered 유리 bubbler를 사용 하 여 적어도 40 분 동안 부풀어 되었고 내부 살 균 폴 리 에틸렌 봉지에 전송 확인을 층 류 조직 문화 후드 세균성 필터와 연결 된 무 균 충전 튜브 (127 mm) 20 mL 주사기를 사용 하 여. 즉시 가방을 봉인 하 고 조직 문화 삽입 전송 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 37 ° C 배양 기에 그들을 전송. - 각 균 가방 (와 플레이트 잘 식별) 표시 올바르게 확인 합니다. 각 조직 문화 삽입에 대 한이 단계를 반복 합니다. 멸 균 가방 (가방 상단의 복잡 하 고 플라스틱 클램프를 적용 하 여 안전 하 게 수행) 씰링 시 신중 하 게 공기 방울을 제외 합니다.
- 37 ° C 배양 기에 조직 문화 삽입과 살 균 가방과 실험 매체 6 잘 플레이트를 반환 합니다.
- 1 시간 후 신중 하 게 생리 온도 쇼크 웨이브 노출 동안에 organotypic 조각을 유지 하기 위해 37 ° C에서 드 이온된 물으로 채워진 열 레 귤 레이트 된 상자 안에 플라스틱 상자에 조직 문화 삽입과 살 균 가방을 싸 프로토콜입니다.
4. 충격 관 그리고 Hippocampal Organotypic 슬라이스 충격파 노출의 준비
- 충격 튜브와 충격파 노출의 준비 하는 동안 실험실 코트와 장갑, 강철 발가락 보호 부츠를 착용 하십시오.
- 멸 균 가방 홀더 프레임 중앙 구멍 (블랭킹 막대를 사용 하 여) 충격 관 출구에 맞춰집니다 보장 충격 튜브 원심 플랜지 볼트 합니다.
- 광선 2 압력 트랜스듀서 마운트: 구동된 섹션 및 충격 관 (그림 1A)의 원심 플랜지 2 센서의 중간 부분에 센서 1. 현재는 소스 장치를 통해 오실로스코프를 압력 트랜스듀서를 연결 합니다.
- 모든 충격 튜브 릴리스 밸브 및 흐름 제어 닫혔는지 확인 합니다.
- 외부 압축 공기 라인 열고 2.5 바 솔레노이드 밸브를 충전 합니다.
- 압축 공기 실린더 안전 밸브를 열고 천천히 약 5 바 압력을 증가 하는 압력 레 귤 레이 터를 엽니다.
참고:이 레 귤 레이이 터에 대 한 설정 압력은 약간 높은 횡 경 막 파열 압력 이상 이어야 한다. - 10 x 10 cm2 사각형으로 절단 23 µ m 두께 폴리에스터 시트에 의해는 다이아를 준비 합니다. 핸들 고압 테이프를 사용 하 여 및 각 격 막의 상하에 그들을 준비 합니다.
- 위치를 한 다이어 프 램 (더블 불 감 증-단일 막 구성의 단일 슬롯) 또는 2 개의 격 막 (두 슬롯의 이중 불 감 증-더블 다이어 프 램 구성) 불 감 증 (그림 1B)에.
- 격 막, 센터 그리고 4 M24 볼트와 너트를 사용 하 여 순차적으로 대각선 대칭 방법에서 그들을 체결 하 고는 다이아는 되도록 그들을 클램프 주름-무료.
- 클램프 홀더 프레임에 수직 위치에서 개별적으로 각 살 균 가방, 충격 관 콘센트 직면 조직 배양의 표면 organotypic hippocampal 조각으로 삽입 보장 하 고 내부는 무 균 조직 문화 삽입 중심 가방 (그림 1C)입니다. 멸 균 가방 고르게 동원 정지 되도록 주위 안전 하 게 고정은 다는 것을 확인 하십시오.
- 충격 관을 압박 하는 때 귀 수비수와 안전 안경을 착용 하십시오. 현재 소스 전원 장치 및 오실로스코프를 쇼크 웨이브 데이터 (50 메가-샘플/s, 레코드 길이 20 ms의 획득 율, 1 백만 점)를 취득 한 솔레노이드 밸브에 스위치.
- 드라이버 볼륨 섹션 및 이중 다이어 프 램에 대 한 충격의 이중 불 감 증 섹션 모두 또는 하나의 격 막 구성에 대 한 충격 관의 드라이버 볼륨 섹션 압력솥 천천히 흐름 조절기를 사용 하 여 충격 튜브 컨트롤 패널에서 구성입니다.
참고: 단일 막 구성에 대 한 파열 압력에 따라 달라 집니다만 격 막 물자 그리고 두께 횡 경 막 것입니다 파열 저절로 파열 압력 자료에 도달 하면. 더블 다이어 프 램 구성에 대 한 파열 압력 또한 차동 드라이버와 더블 볼 기 챔버 가스 압력에 따라 달라 집니다. 그리고 제어 방식으로 파열 격 막에 대 한 이중 불 감 증 안전 밸브는 수동으로 한 번 열 목표 압력 도달 된다. - 최대한 빨리 막 신속 하 게 (시끄러운 소음 생산)을 파열 흐름 노브를 사용 하 여 압축 공기 흐름 닫고 솔레노이드 밸브를 엽니다.
참고: 드라이버 섹션의 총 볼륨 세그먼트, 광범위 한 충격파 피크 압력 그리고 기간을 얻을 수 있도록 블랭킹의 삽입에 의해 수정할 수 있습니다. 쇼크 웨이브 매개 변수의 이상적인 조합을 조직 부상을 일으킬 충분 해야 하지만 너무 높은 그것이 조직 문화 삽입 또는 살 균 가방 왜곡 또는 파열 됩니다. - 조직 문화 삽입 단일 충격파 관을 각 살 균 가방 하 고 그것은 즉시 반환 온도 통제 상자 새로운 멸 균 가방 상자에서 가져온와 홀더 프레임에 고정 하기 전에. 단계 4.10-4.14 수행 원활 하 고 신속 하 게 최대한으로 (몇 분) 이내, 실험 중간 냉각을 방지 하기 위해 온도 37 ° c 부상 개발을 방해 수 있습니다 확인 합니다.
- 일단 모든 조직 문화 삽입 노출 되었을 원래 6 잘 플레이트를 잘 (내 층 류 조직 문화 후드) 그들의 각각을 반환 조직 문화 삽입을 충격파 (또는 가짜 프로토콜), 그리고 인큐베이터 돌아갑니다.
- 추가 영상까지 37 ° C에서 공기에 5% 이산화탄소와 인큐베이터에 6 잘 플레이트 유지.
- 가짜 조각 충격파 노출 함께 각 실험에 대 한 컨트롤을 포함 합니다.
참고: 가짜 조각 처리 됩니다 동일 조각 (실험 매체와 멸 균 봉투에 봉인, 동일한 온도 통제 상자에 충격 관 실험실으로 이송 및 해당 기간에 대 한 금속 프레임에 중단 충격파에 노출 시간) 충격 하지만 관을 해 고.
5. hippocampal Organotypic 슬라이스 부상 정량화
- 24 시간, 48 h 72 h에서 단계 2.8 및 2.9에서 설명한 대로 슬라이스 이미지.
- 72 h 게시물 충격파 노출에서 이미징, 후 삭제 다음 로컬 생물학 프로토콜을 낭비 하 고 치료 하는 조직 및 고압 금속 고리.
Representative Results
이 방법에 사용 되는 충격 튜브 프리 기능7,8에 의해 만들어진 실제 오픈 필드 폭발을 시뮬레이션 하는 압력 과도의 세대 수 있습니다. 440 m/s (마 하 1.3)의 속도와 초음속 충격파 (그림 2A)을 획득 했다. 보고 된 파형 데이터 센서 2, 광선으로 충격 관의 제어 섹션의 끝에 위치에서 이다.
위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여 (그림 2A) 단일 충격파에 노출 organotypic hippocampal 슬라이스 문화 개발 propidium 요오드 화물만 셀을 침투 하는 높게 극 지 형광 염료를 사용 하 여 계량 하는 중요 한 부상 손상 세포 막24,25 (그림 2B, C).
최적의 조건에서 심지어 고 다른 OHSC에 일관 된 게시 모델21,22, 배경 propidium 요오드 화물 형광의 낮은 수준 때문에, 부분적으로, 고유의 조직 조작 (사소한 피해를 같은 미디어 변경 문화 기간 또는 이미징 인큐베이터에서 제거 하는 동안). 이 폭발 TBI 프로토콜 포함 살 균 가방과 충격파 노출 프로토콜 중 처리의 상당한 정도 안쪽에 매체에 조각의 침수를 포함 하는 상당한 조작 (예., 살 균 가방에 죄는 홀더 프레임)입니다. 그러나, 그러므로 신중 하 게 모든 단계를 수행 하는 경우이 추가 조작 없는 영향은 OHSC의 기본 건강에 중요 한 차이가 항상 6-잘 접시에 보관 하는 조각의 제어 그룹 사이 본 했다 (즉,., 삽입 침수 되었거나 처리) 및 충격 관 (그림 2B)에 채워 살 균 가방 안에 잠수 했다 조각 포함 가짜 그룹.
두 충격파 선택, 50 kPa와 55 kPa 피크 압력, 중요 한 생산 (p < 0.05와 p < 0.0001, 각각) 및 재현 부상 손상 되지 않은 가짜에 비해 조각 모든 시간-포인트 폭발 노출 후 조직 문화 삽입 또는 살 균 가방에 어떤 손상을 초래 하지 않고 프로토콜 (그림 2B). 피크 압력의 작은 차이에 모델의 감도 결정 하기 위해 우리는 ~ 10%로 다른 값을 선택 하기로 결정 했다. 이러한 결과 또한, 예상 했던 대로, 55 kPa에서 발생 하는 상해는 보다 높은 50 kPa 충격파 후 표시 됩니다.
데이터는 평균 ± 표준 오차의 평균으로 표시 됩니다. 의미는 2-방법 반복된 측정 분산 분석 Holm Sidak 특별 게시물 테스트를 사용 하 여를 사용 하 여 평가 했다. 팩터 1 그룹 (제어, 가짜, 폭발) 이었고 요인 2 (-1 h 24 시간, 48 시간, 72 h), 부상 후 시간 어디 이었다 요소 1 반복된 요소. 여러 비교에 대 한 p 값 조정 사용 되었다. P 값이 0.05 보다 작은의 그룹 사이 상당한 차이 나타내기 위해 찍은. 통계적 테스트 그래프 및 통계 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 구현 되었습니다.
그림 1: 살 균 가방 홀더 프레임 충격 관 장치의 계통도. (A). 충격 관은 3.8 m 긴 스테인리스 스틸 튜브, 개스킷 및 플랜지에 의해 연결 된 3 개의 1.22 m 긴 단면도의 만들어, 내부 직경 59 m m.의 (B) 삽입 더블 불 감 증 어셈블리를 보여줍니다. 하나 또는 두 개의 Mylar 격 막 물개 고무 o 링에 의해 제공 된 어셈블리에 고정 수 있습니다. (C) 살 균 가방 홀더 프레임. 중심 원형 구멍 (59 m m 직경) 충격 관 콘센트와 함께 정렬 하는 2 개의 금속 격판덮개는 프레임의 시체에 의하여 이루어져 있다. 실리콘 엘라 스토 머의 2 개의 얇은 (4mm) 시트는 2 개의 금속 격판덮개 사이 적합 하다. 이 장의 목적은 살 균 가방 클램프도 및 비-미 끄 러운 표면을 제공 하입니다. 가방 및 충격 관의 출구 사이의 거리는 7 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 일반적인 충격파와 organotypic hippocampal 결과 부상 슬라이스 문화. (A) 23 µ m 두께 폴 리 에스테 르 필름, 2.16 버스트 압력, 55 kPa 피크 압력, 0.4 ms 긍정적인 파 기간, 10.1 kPa·ms 전류를 사용 하 여 얻은 충격파의 대표적인 예입니다. 파형 데이터는 광선으로 섹션을 구동 하는 충격 관의 원심 플랜지에 장착 되는 센서 2에서에서 얻은 했다. 쇼크 웨이브 속도 440 m/s (마 하 1.3) 이었다. (B) 상해의 개발은 쇼크 웨이브의 강도에 비례 합니다. 50 kPa와 55 kPa 피크 압력 충격 파도 가짜 그룹과 비교 될 때 72 h 프로토콜에 걸쳐 개발 하는 중요 한 부상을 발생 합니다. 55 kPa 피크 압력 파 노출에서 유래 하는 상해 보다 훨씬 더 높은 50 kPa에서 48 h 후와 72 h. 가짜 조각 폭발 조각 동일 하 게 취급 했다 하지만 충격 관 해 고 하지 했다. 제어 조각 조작 없이 인큐베이터에 6 잘 플레이트에 유지 되었다. 바 평균값을 나타내고 오차 막대는 표준 오류 (n = 7, 컨트롤; n = 48, 가짜, n = 30, 폭발 50 kPa; n = 51, 폭발 55 kPa, n = 6 별도 실험에서 조각의 수). * p < 0.05, *p < 0.0001 가짜와 비교. # p < 0.05, #p < 0.01 폭발 55 kPa와 비교. (나) 가짜에서 organotypic 조각, (ii) 폭발 50 kPa와 (iii) 폭발 55 kPa 그룹 부상 후 72 h (C) 대표 propidium 요오드 화물 형광 이미지. 가짜 슬라이스 형광, 즉의 낮은 수준을 보여줍니다., 부상, 그리고 노출된 조각 표시 55 kPa 피크 압력 노출 슬라이스에 발음 확산 부상의 높은 수준의 폭발 (눈금 막대 = 500 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
폭발 폭발 부상 폭발 외상에 고유 이며 그것은 기본 TBI (1 차, 2 차 및 3 차 폭발 부상 메커니즘)과 관련 된 상해의 모든 메커니즘 중 적어도 폭발 관련 된 메커니즘1,2 이해 . 여기에 설명 된 소설 프로토콜 기본 폭발 TBI는 재현의 창조를 허용 하는 간단 하 고 빠른 프로토콜을 사용 하 여 단일 충격파를 마우스 hippocampal 슬라이스 문화 체 외에 노출 하는 전면적인 충격 튜브를 사용 하 여 연구 개발한 1 차 폭발 TBI 높은 처리량입니다.
최초의 체 외에서 1 차 폭발 TBI 모델 셀26,27에 액체 정역학 압력 파를 적용. 그러나, 압력 출력 액체 정역학 압력 펄스 기간 공중 폭발 압력 파13보다 훨씬 더 오래 되면서 프리 기능을 모델링 하지 않았다. 프리 기능 특성 충격 튜브1,8를 사용 하 여 실험실에서 쉽게 모델 수 수 있습니다. 충격 관을 변화 하 여 피크 압력, 긍정적인 파 기간 및 충 동, 같은 웨이브 매개 변수를 정밀 하 게 제어 하면서 기존의 실험실 환경에서 실제 오픈 필드 폭발을 시뮬레이션 하는 충격 파도 생성할 수 있다는 막 소재 및 두께, 드라이버 볼륨8,,2829.
모델 간단한 체 외에서 세포 배양에는 일반적으로 세포 유형 및 시 냅 스 연결30이 부족합니다. 최근, 뇌 세포 생체 외에서 통합 하는 다른 세포 유형 ' spheroids'에서 폭발의 효과 조사31되었습니다. 이러한 재미 있는 준비의 추가 조사 공훈입니다; 그러나, 그것 아니다 분명 어떻게 그들의 세포 조직과 연결 그대로 뇌를 거울. OHSC은는 잘 설립 된 생체 외에서 실험 모델23,32, 문화에 쉽게 그들의 3 차원 조직 cytoarchitecture, 세포 분화 및 시 냅 스 연결은 잘 보존 하 고 매우 그 비보에33,,3435,36. 와 비슷한 OHSCs 세포 배양과는 vivo에서 모델23,32사이 복잡 한 중간 수준을 나타냅니다. OHSCs는 vivo에서 모델에서 볼 에 체 외 병 적인 신경 계곡을 재현 하 여 잠재적인 신경 보호 약물의 심사에의 그들의 메커니즘을 이해에 매우 유용 하 게 되었습니다. 입증 되었습니다. 액션17,,2122,37,38. 마지막으로, 해부학 영역 공부, 해 마, 변환 TBI 연구, 관련성이 높은이 지역 자주 TBI 환자39,,4041에 손상 된 경우. 그러나 OHSC 모델 폭발 TBI28,42,,4344에 사용 되었습니다, 그리고, 우리의 모델은 비교적 간단 하 고 어느 수평에 기존 충격 관에 적응 또는 수직 수 복잡 한 적응 하지 않고 구성입니다.
OHSC 시간34이상 생물학 과정의 조사를 용이 하 게 하는 많은 일에 대 한 문화에 보관 될 수 있습니다. 이 모델에서 조직 상해 충격파 노출의 결과 매일 측정 되었다 3 일 동안, 폭발 노출 propidium 요오드 화물, 세포 손상의 잘 설립 된 마커를 사용 하 여 다음. Propidium 요오드 화물 독성 높은 북극 염료 침투와 손상 된 세포 막, 그것은 핵 산을 하 고 전시 하는 독특한 밝은 빨간색 형광24,,2545셀입니다. Propidium 요오드 화물 측정 형광 Nissl46,47얼룩을 사용 하 여 손상 된 세포 수와 좋은 상관 관계를 보였다.
이 모델에서 생산 하는 부상 했다 확산 (그림 2C), 그 전체 조각의 형광 분석, 유사한 다른 뇌 부상 패러다임21,22 에 이전에 게시 작업을 수행할 때 측정 되었다 다른 시험관에서 수행 되었습니다 특정 지역, 사용 하는 대신 폭발 TBI28,,4344,48모델. 이 문서에서 설명 하는 모델에 사용 되는 글로벌 접근 또한 관심의 영역을 정의 하 고 폭발 관련 된 상해의 더 포괄적인 그림을 제공 한다 개요 도입 잠재적인 변화를 제거 합니다. 쇼크 웨이브 피크 overpressures, 50 kPa와 55 kPa, 중요 한 생산 (p < 0.05와 p < 0.0001, 각각) 가짜 조각 (그림 2B)에 비해 부상. 예상 대로, 가장 높은 피크 압력으로 쇼크 웨이브 55 kPa, 생산 50 kPa 파도 보다 더 많은 부상. 격리 된 뇌와 생체 외에서 모델에 조직을 직접 노출 충격파, 정확 하 게 전체 유기 체 또는 인간을 확장 하는 방법을 간단 하지 않습니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리가 사용 하는 충격파 피크 overpressures 분야, 일반적으로 50-1000 인민군8,49에서 관찰의 범위 내에 있습니다.
그들이 충격파 노출 프로토콜을 통해 오염 으로부터 자유를 보장 하면서 생리 온도 산소와 이산화탄소의 수준에 노출 하는 OHSC를 유지 하기 위해 조직 문화 삽입으로 살 균 밀봉 했다 무 균 기술, 37 ° C로 예 열 하 고 갓 95% 산소와 5% 이산화탄소, 유사 하 게 이전에 게시 작업28,,4344 와 함께 부풀어 실험 매체에 잠긴 다음 폴 리 에틸렌 봉투 48. 이러한 모델을 복잡 한 장치를이 프로토콜에서 충격파 노출 동안 멸 균 가방을 개최 하는 데 사용 했다 반대로 간단 하 고 빠른 방법은 (그림 1A, C 충격 관 출구 앞 OHSC 조직 문화 삽입을 중단 하 사용 되었다 ). 이 문서에서 설명 하는 모델 저체온증의 위험을 최소화 하면서 처리 및 높은 처리량을 수 있습니다. 이러한 측면은 특히 neuroprotection 연구 관련 주어진 어떤 치료 내정간섭 TBI 후 잠재적인 응용 프로그램의 매우 제한 된 시간 창에 있을 수 있습니다. 이 소설 충격파 노출 프로토콜 6 ~ 9 시간 (약 1 시간)의 짧은 간격에 충격파에 노출 될 (일반적으로 36 54 hippocampal organotypic 조직 조각)을 삽입 하는 조직 문화를 수 있습니다.
OHSCs에 걸쳐 무 균 기술이 필요로합니다. 그것은 무 균 층 류 두건은 경작을 통해 및 폭발에 대 한 살 균 가방을 전송할 때 사용 하는 것이 중요입니다. 위해 장소에 6-잘 접시의 뚜껑으로 무 균 조건 하에서 조각 영상, 우리는 현미경의 초점 평면에 셀 문화 삽입 인상 주문 품 금속 고리를 사용 합니다. 우리의 프로토콜의 중요 한 부분이 우리 모든 실험에서 손상 되지 않은 가짜 조각 포함입니다. 가짜 조각 폭발 슬라이스는 충격 관 하지 해; 예외가와 동일 하 게 처리 됩니다. 또 다른 중요 한 단계는 모든 슬라이스는 부상 또는 조각 사용의 인구의 건강 동일 (그림 2B) 되도록 가짜 치료 전에 1 h 몇 군데입니다.
측정 시간이 지남에 조각에 셀 부상, 뿐만 아니라 조직 기존의 immunohistochemistry50에 대 한 실험의 끝에 해결할 수 있습니다. 우리가 개발 하 고 평가 마우스 hippocampal 분할 영역을 사용 하 여 메서드. 그러나, 우리의 기술 척수, 망막, 폐 등 상피 조직 문화에서 성장 될 수 있다 다른 직물을 사용 하 여 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 종이 우리의 이전 작업 모델을, 우리만 하나의 폭발에 노출의 효과 조사. 그러나, 모델 또는 다른 조직에 반복 된 저수준 폭발의 효과 조사 하는 데 적합 것입니다. OHSCs 문화에 많은 주 동안 보관 하실 수 있습니다 또는 심지어 개월, 만성 효과 조사를 허용.
생체 외에서 모델, vivo에서 모델을 보다 간단 하 게 되 고 더 높은 처리량, 덜 비싼 그리고 실험 일반적으로 더 짧은 시간 규모17에 완료 될 수 있다. 그러나, 생체 외에서 모델을 사용 하 여 얻은 결과 체 외에서 배양 조직 인공 환경에서 유지 되 고 무엇 으로부터 부상에 다르게 응답할 수 있습니다 동물 모델에서 유효성을 검사할 필요가 것 vivo에서17. 그럼에도 불구 하 고, 생체 외에서 모델 증가 뇌 상해의 우리의 이해에 매우 중요 한 그리고 더 복잡 한 생체 내에서 사용 하기 전에 신경 보호 약물 검사에서17,22 모델 , 51 , 52. 많은 장점을 제공 하는이 모델에 의해 생체 외에서 모델 키 기능 TBI의 동물과 vivo에서 모델, 혈관 시스템에 영향에 존재 부족을 주의 하는 것이 중요 하다 고 증가 intracranial 압력, 조직의 면역 반응 및 전체 동물에서 생체 외에서 모델에서 발견 하는 결과 확인 하는 필요를 강조 기능 행동 장애. 그럼에도 불구 하 고, 체 외에서 이 문서에서 설명 하는 모델 등 모델 매우 유용 translationally 관련 과학적 도구입니다.
결론적으로,이 작품 마우스 organotypic hippocampal 조직 문화를 긴밀 하 게 제어 하 고 재현할 수 실제 관련 충격파 실험실 충격 튜브를 사용 하 여에 노출 되는 단순 하 고 간단 소설 메서드를 설명 합니다. Propidium 요오드 화물, 세포 손상의 잘 설립 된 마커를 사용 하 여 계량 했다 결과 글로벌 부상 재현성 이며 적용 하는 충격파의 피크 압력에 비례 이다.
Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.
Acknowledgments
지원: 국방 의학, 버밍엄, 영국, 폭발 부상 연구, 임페리얼 칼리지 런던, 로얄 영국 군단 센터에 대 한 로얄 센터 영국. 의료 연구 위원회, 런던, 영국 (MC_PC_13064; MR/N027736/1). 가스 안전 신망, 런던, 영국. 리 타 캄포 스 피 레 스는 Fundação 파라에서 박사 교육 상 받는 과학 전자 기술, 리스본, 포르투갈. 케이티 해리스는 웨스트 민스터 의료 학교 연구 트러스트, 런던, 영국에서 박사 학위 재학의 수령인 이었다.
이 모델에 대 한 폭발 부상 연구 (RBLCBIS) 제국 대학에서 왕 영국 운 단 센터의 지원으로 개발 되었다. 우리는 로얄 영국 군단의 재정 지원을 하 고 싶습니다. 연구원 협력 또는 더 세부 사항에 관심이 있습니다 연락 저자 또는 RBLCBIS.
우리 감사 박사 Amarjit Samra, 감독 연구, 로얄 센터 국방 의학, 버밍엄, 영국,이 작업을 지원 하기 위한 스 캇 암스트롱, 외과 및 암, 임페리얼 칼리지 런던, 예비 실험에 대해 Theofano Eftaxiopolou, 하 리 Arora & 루즈 Ngoc 응웬, 학과의 공학 제국 대학 런던, 윌리엄 긍지, 부의 물리학 임페리얼 칼리지 런던, 충격-튜브, Raquel Yustos에 대 한 조언 연구 기술자, 부서 생명 과학, 제국 대학 런던, 기술 지원, 폴 브라운 MBE, 워크숍 관리자와 Steve 넬슨, 워크샵 기술자, 물리, 금속을 만들기 위한 임페리얼 칼리지 런던, 반지, 물리학의 부의 닐 파월 임페리얼 칼리지 런던, 작품에 대 한입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
| D-glucose | Sigma UK | G8270 | |
| Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
| Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
| Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
| Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
| L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
| HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
| Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
| Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
| 6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
| Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
| Sterile polyethylene bags - Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
| Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127 mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
| Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
| Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
| Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
| Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
| Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
| Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
| Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
| Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |
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