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Cancer Research

प्राथमिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के चयापचय प्रोफ़ाइल का आकलन

Published: November 21, 2018 doi: 10.3791/58426
Automatic Translation
1, 1
1CLIP - Childhood Leukemia Investigation Prague, Second Faculty of Medicine, Laboratory of Molecular Genetics, Charles University, Prague

Summary

यहां हम ल्यूकेमिया रोगियों अस्थि मज्जा और उनके चयापचय राज्य के विश्लेषण से ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद । प्राथमिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के चयापचय प्रोफ़ाइल का आकलन बेहतर प्राथमिक कोशिकाओं की मांग को चिह्नित करने में मदद कर सकता है और अधिक व्यक्तिगत दवा तक ले सकता है ।

Abstract

कैंसर कोशिकाओं की चयापचय आवश्यकता नकारात्मक अस्तित्व और उपचार प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकते हैं । आजकल, चयापचय रास्ते की दवा लक्ष्यीकरण ट्यूमर के कई प्रकार में परीक्षण किया जाता है । इस प्रकार, कैंसर कोशिका चयापचय सेटअप के लक्षण वर्णन करने के लिए सही मार्ग लक्षित करने के लिए रोगियों के समग्र परिणाम में सुधार अपरिहार्य है । दुर्भाग्य से, कैंसर के बहुमत में, घातक कोशिकाओं को उच्च संख्या में प्राप्त करने के लिए काफी मुश्किल है और ऊतक बायोप्सी की आवश्यकता है । ल्यूकेमिया एक अपवाद है, जहां ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या अस्थि मज्जा से पृथक किया जा सकता है । यहां, हम ल्यूकेमिया रोगियों अस्थि मज्जा और उनके चयापचय राज्य extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर के बाद विश्लेषण से ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं घनत्व ढाल, जो उनकी व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है द्वारा अलग कर रहे हैं । अगली खेती कदम उंहें पुनर्जीवित करने में मदद करता है, इस प्रकार चयापचय राज्य मापा इष्टतम स्थितियों में कोशिकाओं की स्थिति है । इस प्रोटोकॉल सुसंगत, अच्छी तरह से मानकीकृत परिणाम है, जो व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्राप्त करने की अनुमति देता है ।

Introduction

चयापचय प्रोफ़ाइल कोशिकाओं के मुख्य विशेषताओं में से एक है और बदल-ऊर्जावान अब कैंसर1,2,3की पहचान में से एक माना जाता है । इसके अलावा, चयापचय सेटअप में परिवर्तन संकेत transduction रास्ते या कैंसर कोशिकाओं की एंजाइमी मशीनरी4,5,6लक्ष्यीकरण द्वारा कैंसर के उपचार में इस्तेमाल किया जा सकता है । कैंसर की कोशिकाओं की चयापचय गड़बड़ी को जानने के इस प्रकार एक फायदा है और वर्तमान चिकित्सा में सुधार में मदद कर सकते हैं ।

वहां पहले से ही स्थापित तरीकों जो संस्कृति में कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि का आकलन कर सकते है की एक बहुत हैं । सादर glycolysis, ग्लूकोज अधिक रेडियोधर्मी लेबलिंग द्वारा मापा जा सकता है, का उपयोग कर 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl) अमीनो) -2-Deoxyglucose) या extracellular स्तनपान का स्तर मापा enzymatically7,8. फैटी एसिड ऑक्सीकरण दर एक और चयापचय पैरामीटर palmitate9,10लेबल isotopically द्वारा मापा जाता है । ऑक्सीजन की खपत दर एक व्यापकरूप से-कोशिकाओं11,12, mitochondrial झिल्ली संभावित मूल्यांकन13,14, एटीपी/ADP (adenosine के साथ में mitochondrial गतिविधि का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया विधि है 5 ′-ट्राइफॉस्फेट/Adenosine 5 ′-diphosphate) अनुपात मापन15 या कुल intracellular एटीपी माप16. संकेत मार्ग चयापचय प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए जाना जाता प्रोटीन quantifications द्वारा निर्धारित किया जा सकता है और चयापचय माप की समझ में सुधार कर सकते हैं17,18,19.

हालांकि, इन सभी विधियों को मापने केवल एक या, सबसे अच्छा परिदृश्य में, एक नमूना में कुछ चयापचय पैरामीटर एक साथ । महत्वपूर्ण बात, ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और extracellular अंलीकरण दर (ीकार) के एक साथ माप द्वारा extracellular फ्लक्स विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, Seahorse XFp विश्लेषक । ओसीआर mitochondrial श्वसन का एक संकेतक है और ीकार मुख्य रूप से glycolysis का परिणाम है (हम2 संभवतः उच्च ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण गतिविधि के साथ कोशिकाओं की ीकार तरक्की उत्पादन की अनदेखी नहीं कर सकते)20. अब तक, विभिंन सेल प्रकार इन विश्लेषक21,22,23का उपयोग कर अध्ययन किया गया है ।

यहां हम प्राथमिक विस्फोटों के extracellular फ्लक्स विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन (लेकिमिया कोशिकाओं अपरिपक्व टेम चरण से व्युत्पंन) ल्यूकेमिया रोगियों से । हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, प्राथमिक विस्फोटों के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल अभी तक उपलब्ध नहीं है ।

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Protocol

सभी नमूनों बच्चों के माता पिता या संरक्षक और चार्ल्स विश्वविद्यालय के प्राग, चेक गणराज्य में नैतिक समिति के अनुमोदन के सूचित सहमति के साथ प्राप्त किए गए, अध्ययन नहीं । NV15-28848A ।

1. रिएजेंट्स की तैयारी

  1. पंजाबियों के ५०० मिलीलीटर को भंग करके तैयार करें १३७ एमएम NaCl, २.७ एमएम KCl, ४.३ एमएम ना2HPO4, १.४७ एमएम KH2पीओ4, ddH2ओ में । पीएच को एचसीएल के साथ ७.४ से एडजस्ट करें । autoclaving द्वारा निष्फल ।
  2. RPMI मध्यम के १०० मिलीलीटर तैयार करें: RPMI-१६४० मध्यम के साथ एल-Alanyl-Glutamine 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन (१०० U/एमएल) और streptomycin (१०० μg/एमएल) के साथ पूरक ।
  3. आसुत जल में ०.१ मीटर NaHCO3 की ५० मिलीलीटर तैयार करें । ८.१, फिल्टर बंध्याकरण (०.२२ माइक्रोन) और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
    नोट: के लिए दो 8 अच्छी तरह से extracellular फ्लक्स विश्लेषक प्लेटें, ०.१ मीटर NaHCO3 पीएच ८.१ के २५० μL तैयार ।
  4. आसुत जल में 2 एम डी ग्लूकोज की 1 मिलीलीटर तैयार करें । फ़िल्टर बंध्याकरण (०.२२ माइक्रोन) और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
  5. इथेनॉल में 1 मिमी Oligomycin ए की १०० μL तैयार करें । फ़िल्टर बंध्याकरण (०.२२ माइक्रोन) और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
  6. 1 एम 2 के २५० μL तैयार करें-deoxy-डी-ग्लूकोज (2-डीजी) मिनिमल DMEM (Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम) में । ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म और ७.४ के लिए पीएच समायोजित (३७ डिग्री सेल्सियस पर पीएच माप बाहर ले) । फ़िल्टर बंध्याकरण (०.२२ माइक्रोन) और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
  7. trifluoromethoxyphenylhydrazone में 1 mM FCCP (carbonyl साइनाइड-p-DMSO) की १०० μL तैयार करें । फ़िल्टर बंध्याकरण (०.२२ माइक्रोन) और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
  8. एथेनॉल में 1 एमएम रोटेनोन की १०० μL तैयार करें । फ़िल्टर बंध्याकरण (०.२२ माइक्रोन) और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
  9. तैयार १०० μL के 1 मिलीग्राम/एमएल Antimycin इथेनॉल में एक । फ़िल्टर बंध्याकरण (०.२२ माइक्रोन) और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
  10. बस उपयोग करने से पहले, Glycolysis तनाव परीक्षण मध्यम के 10 मिलीलीटर तैयार करते हैं । एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म ंयूनतम DMEM और ७.४ के लिए पीएच समायोजित (३७ डिग्री सेल्सियस पर पीएच माप बाहर ले) ।
  11. उपयोग करने से पहले, BSA के साथ सेल मिळो तनाव परीक्षण मध्यम के 10 मिलीलीटर तैयार करते हैं । 2 मिमी एल-glutamine, 10 मिमी डी-ग्लूकोज, 1 मिमी HEPES (पीएच ७.४), 1 मिमी पाइरूवेट और ०.१% BSA (गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन) के साथ न्यूनतम DMEM पूरक । एक पानी के स्नान में ३७ ° c करने के लिए गर्म और ७.४ के लिए पीएच समायोजित (३७ डिग्री सेल्सियस पर पीएच माप बाहर ले) ।
  12. उपयोग करने से पहले, BSA बिना सेल मिळो तनाव परीक्षण मध्यम के 10 मिलीलीटर तैयार करते हैं । 2 मिमी एल-glutamine, 10 मिमी डी-ग्लूकोज, 1 मिमी HEPES (पीएच ७.४) और 1 मिमी पाइरूवेट के साथ न्यूनतम DMEM पूरक । गर्म सेल मिळो तनाव परीक्षण मध्यम BSA के लिए एक पानी के स्नान में ३७ ° c के बिना और ७.४ के लिए पीएच समायोजित (३७ डिग्री सेल्सियस पर पीएच माप बाहर ले) ।
    नोट: BSA सेल मिळो तनाव परीक्षण मध्यम में जोड़ा जाता है क्योंकि कोशिकाओं FCCP करने के लिए बेहतर प्रतिक्रिया जब मध्यम BSA के साथ पूरक है (विभिंन स्थितियों का परीक्षण किया गया) । सेल मिळो तनाव परीक्षण मध्यम BSA बिना बंदरगाहों लदान के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में निर्माता BSA माध्यम में उपयोग की सिफारिश नहीं है ।

2. अस्थि मज्जा से Mononuclear कोशिकाओं का अलगाव

नोट: आदर्श रूप में, प्राथमिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के चयापचय राज्य की माप अस्थि मज्जा संग्रह और कोशिका अलगाव के बाद तुरंत शुरू कर देना चाहिए. हालांकि, प्रासंगिक डेटा भी चेक गणराज्य में अंय रुधिर केंद्रों से परिवहन के बाद अलग कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है । एक बाँझ ऊतक संस्कृति हूड में सभी उप कदम प्रदर्शन.

  1. ऊपर पंजाब और घनत्व ढाल मध्यम कमरे के तापमान को गर्म ।
  2. 1:1 के अनुपात में, पंजाबियों के साथ लेकिमिया रोगी के अस्थि मज्जा नमूना पतला । सुनिश्चित करें कि नमूना ल्यूकेमिया से प्रभावित धमाकों के कम से ८०% शामिल हैं ।
  3. सेल प्रकार के immunophenotype लक्षण वर्णन के लिए विशिष्ट सीडी मार्कर का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा विस्फोटों का प्रतिशत निर्धारित करें । घनत्व ढाल जुदाई के बाद, एक परमाणु डाई के साथ न्यूक्लिक एसिड सकारात्मक घटनाओं का पता लगाने के लिए समग्र सेल गिनती स्थापित करने के लिए ।
  4. तो, ल्यूकेमिया के प्रत्येक प्रकार के लिए विशिष्ट सीडी मार्कर का उपयोग लेकिमिया कोशिकाओं का निर्धारण: बी-सभी (CD19, CD45), टी-सभी (CD3, CD4, सीडी 8, CD5, CD7, CD99) और एएमएल (CD45, CD33, और विशिष्ट माइलॉयड मार्करों)24. सभी परमाणु कोशिकाओं द्वारा विशिष्ट सीडी मार्कर के लिए सकारात्मक लेकिमिया कोशिकाओं की संख्या में विभाजित करने के लिए ल्यूकेमिया विस्फोट कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करते हैं ।
    नोट: अस्थि मज्जा anticoagulants के साथ ट्यूबों में एकत्र किया जाना है ।
  5. ध्यान से एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में घनत्व ढाल मध्यम के 6 मिलीलीटर से अधिक पतला अस्थि मज्जा नमूना के 6 मिलीलीटर परत । ब्रेक के बिना एक झूल-बाल्टी रोटर में 4 ° c पर ३५ मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक ।
    नोट: नमूना की बड़ी मात्रा अधिक aliquots में विभाजित किया जा सकता है या ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब घनत्व ढाल माध्यम की बड़ी राशि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  6. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करते हुए, ध्यान से चरण परत जो mononuclear कोशिकाओं (चित्रा 1) के लिए एक नया ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के साथ 5 ए. ए. पंजाब के होते है स्थानांतरण । एक झूल-बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ४०० × जी में केंद्रापसारक ।
    नोट: सभी mononuclear सेल लेयर्स को एक सिंगल ५० एमएल शंकु ट्यूब के साथ 5 पंजाबियों में ट्रांसफर करें ।
  7. महाप्राण supernatant और बाँझ पंजाबियों के 2 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
    नोट: aspirated अस्थि मज्जा के एक मिलीलीटर में ल्यूकेमिया कोशिकाओं की संख्या25रोगियों के बीच काफी अलग है ।

3. Mononuclear कोशिकाओं की रातोंरात खेती

नोट: एक बाँझ ऊतक संस्कृति हूड में सभी उप कदम प्रदर्शन.

  1. RPMI के 20 मिलीलीटर के साथ दो T75 कुप्पी तैयार करें । प्रत्येक कुप्पी करने के लिए, जोड़ें 30 x 106 अलग mononuclear कोशिकाओं. 5% CO2 और ३७ ° c पर 16-24 घंटे के लिए खड़े कुप्पी के साथ कोशिकाओं को मशीन ।

4. सेल चिपकने वाला लेपित प्लेट्स की तैयारी

  1. कोट दो 8-अच्छी तरह से extracellular फ्लक्स विश्लेषक प्लेटें ।
    नोट: एक बाँझ ऊतक संस्कृति हूड में कोटिंग प्रदर्शन.
  2. जोड़ें २.२ μL के सेल चिपकने वाला (घनत्व: २.५४ मिलीग्राम/एमएल) २५० μL के लिए ०.१ एम NaHCO3, पीएच ८.१, और पिपेट तुरंत एक कुआं में समाधान के १२.५ μL ।
    नोट: सेल चिपकने वाला स्टॉक समाधान उनके घनत्व में अलग कर सकते हैं, मात्रा समायोजित तदनुसार3 NaHCO करने के लिए जोड़ा ।
  3. प्लेटें के बारे में 20 मिनट के लिए हुड में बैठते हैं, तो सेल चिपकने वाला महाप्राण और एक अच्छी तरह से धोने दो बार बाँझ पानी की २०० μL का उपयोग कर । इसे खुले ढक्कन के साथ डाकू में बैठते है जब तक कुओं सूख रहे हैं ।
  4. तुरंत प्लेटों का उपयोग करें या 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए तेल फिल्म में लिपटे रिम के साथ बचाने के लिए संघनित्र से बचने के लिए । सुनिश्चित करें कि प्लेटें कमरे के तापमान के लिए गर्म कर रहे है (के बारे में 20 मिनट के लिए) हुड में कोशिकाओं बोने से पहले ।

5. सेंसर कारतूस का जलयोजन

नोट: हाइड्रेट दो 8-अच्छी तरह से extracellular फ्लक्स विश्लेषक कारतूस ।

  1. उपयोगिता प्लेट और सेंसर कारतूस अलग । सेंसर कारतूस को लैब बेंच पर उल्टा रखें ।
  2. २०० μL calibrant के साथ उपयोगिता थाली के प्रत्येक कुआं भरें । calibrant के ४०० μL के साथ कुएँ के बाहर चारों ओर प्रत्येक खाई भरें.
  3. उपयोगिता थाली है कि अब calibrant शामिल करने के लिए सेंसर कारतूस लौटें ।
  4. एक humidified, गैर सह2, ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन रातोंरात में कारतूस विधानसभा प्लेस ।
  5. extracellular फ्लक्स विश्लेषक को चालू करें और इसे गर्म करने के लिए ३७ ° c रातोंरात ।

6. कोशिका चिपकने वाला लेपित प्लेटों में कोशिकाओं सीडिंग

नोट: Glycolysis तनाव परीक्षण के लिए, Glycolysis तनाव परीक्षण मध्यम का उपयोग करें । सेल मिळो तनाव परीक्षण के लिए, BSA के साथ सेल मिळो तनाव परीक्षण मध्यम का उपयोग करें ।

  1. Glycolysis तनाव परीक्षण के लिए बीज कोशिकाओं और अलग प्लेटों में सेल मिळो तनाव परीक्षण । प्रत्येक परीक्षण के लिए, रात भर संस्कृति के साथ एक कुप्पी से कोशिकाओं का उपयोग करें ।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक । उचित माध्यम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित और उंहें गिनती ।
  3. ४०० μL के अंतिम खंड के लिए लाइव कोशिकाओं के 4 x 106 जोड़ें (उपयुक्त माध्यम का उपयोग करें) ।
  4. प्लेट ५० कुओं में सेल सस्पेंशन का μL बी-जी. सुनिश्चित करें ५००,००० कोशिकाओं को अच्छी तरह से एक में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं ।
    नोट: यह निश्चित रूप से बीज के लिए महत्वपूर्ण है ५००,००० कोशिकाओं के रूप में कोई अंय सामांय प्रदर्शन किया जाता है । इस तरह, विभिंन रोगियों से परिणाम की तुलना में किया जा सकता है । प्रतिकृति की इष्टतम संख्या छह है, के रूप में यहां वर्णित है । प्राथमिक कक्षों के बाद से कभी ग़लती से व्यवहार कर सका कम प्रतिकृति का उपयोग अनुशंसित नहीं है ।
  5. कुओं में एक और एच में उपयुक्त माध्यम के १८० μL जोड़ें (इन कुओं एक पृष्ठभूमि सुधार के रूप में काम करेंगे) ।
  6. 1 के लिए सेट ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर थाली केंद्रापसारक ।
  7. दो 8 में कुओं बी-जी के लिए उपयुक्त माध्यम के १३० μL जोड़ें-अच्छी तरह से extracellular फ्लक्स विश्लेषक प्लेटें धीरे और ध्यान से । नेत्रहीन की पुष्टि करते है कि कोशिकाओं को छुरा के तहत देखने के द्वारा कुओं के नीचे का पालन कर रहे है माइक्रोस्कोप ।
  8. 30 मिनट के लिए एक humidified, गैर-CO2, ३७ ° c मशीन में थाली प्लेस ।

7. सेंसर कारतूस लोड हो रहा है

  1. Glycolysis तनाव परीक्षण के लिए, २५० μL प्रत्येक १०० मिमी ग्लूकोज, 20 माइक्रोन Oligomycin ए और 1 एम 2-डीजी, सभी Glycolysis तनाव परीक्षण माध्यम में तैयार करते हैं ।
  2. सेल मिळो तनाव परीक्षण के लिए, तैयार २५० μL प्रत्येक के 20 माइक्रोन Oligomycin एक, 15 माइक्रोन FCCP, 30 माइक्रोन FCCP और 10 माइक्रोन रोटेनोन और 10 μg/एमएल Antimycin एक का मिश्रण, सेल मिळो तनाव परीक्षण माध्यम में सभी BSA बिना ।
    नोट: एक परख में FCCP के दो सांद्रता इंजेक्शन के बाद से वहां FCCP अनुमापन के लिए पर्याप्त नहीं है मरीजों की सामग्री की सिफारिश की है । फिर भी, सांद्रता शोधकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए ।
  3. इस प्रकार (तालिका 1) के रूप में कारतूस के उचित इंजेक्टर बंदरगाहों में यौगिकों लोड:

8. कार्यक्रम की स्थापना

  1. Glycolysis stress परीक्षण के लिए, तालिका 2में वर्णित के रूप में प्रोग्राम सेट करें ।
  2. सेल मिळो तनाव परीक्षण के लिए, सेट अप के रूप में तालिका 3में वर्णित कार्यक्रम ।
  3. प्रोग्राम प्रारंभ करें । परख प्लेट के साथ calibrant प्लेट बदलें (जब संकेत दिया) ।

9. मूल्यांकन और परिणामों की व्याख्या

  1. Glycolysis तनाव परीक्षण के परिणाम में, अंय सभी ीकार मूल्यों से 2-डीजी इंजेक्शन के बाद सबसे कम ीकार मूल्य घटाना ।
    नोट: यह निंनतम मान गैर-glycolytic अंलीकरण का प्रतिनिधित्व करता है । आमतौर पर, ंयूनतम मान से 4गु माप है ।
  2. Glycolytic समारोह (चित्रा 2a) से बेसल अंलीकरण, Glycolysis, अधिक से अधिक Glycolysis और Glycolytic रिजर्व मापदंडों की गणना । सबसे कम ीकार मान घटाकर, पहले तीन माप बिंदुओं से ीकार का एक माध्य के रूप में बेसल अंलीकरण की गणना (पहले ीकार मान छोड़ दें यदि यह काफी अंय दो से भिंन है), की गणना Glycolysis के एक माध्य के रूप में तीन माप से ीकार ग्लूकोज इंजेक्शन के बाद अंक और एक इंजेक्शन Oligomycin के बाद तीन माप बिंदुओं से ीकार का एक मतलब के रूप में अधिक से अधिक glycolysis की गणना. अधिक से अधिक glycolysis ऋण glycolysis के रूप में Glycolytic रिजर्व की गणना ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, अधिक से अधिक glycolysis परिकलन के लिए, मापा तीन अंक से उच्चतम ीकार मान का उपयोग करें ।
  3. में सेल मिळो तनाव परीक्षण के परिणाम, रोटेनोन के बाद सबसे कम ओसीआर मूल्य घटाना/Antimycin अंय सभी ओसीआर मूल्यों से एक इंजेक्शन ।
  4. बेसल श्वसन, एटीपी उत्पादन, अधिक से अधिक श्वसन और mitochondrial समारोह से अतिरिक्त क्षमता मापदंडों की गणना (आंकड़ा बी b). सबसे कम ओसीआर मूल्य घटाकर, पहले तीन माप अंक से ओसीआर का एक मतलब के रूप में बेसल श्वसन गणना ।
    नोट: अधिकतम श्वसन FCCP इंजेक्शन के बाद सबसे अधिक ओसीआर मूल्य है ।
  5. एटीपी उत्पादन गणना के लिए, बेसल श्वसन से एक इंजेक्शन Oligomycin के बाद तीन ओसीआर माप बिंदुओं का मतलब घटाना । बेसल श्वसन शूंय से अधिक श्वसन के रूप में अतिरिक्त क्षमता की गणना ।
    नोट: हमेशा उच्चतम ओसीआर मूल्य से अधिक से अधिक श्वसन की गणना, FCCP एकाग्रता की परवाह किए बिना इस्तेमाल किया.

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Representative Results

चित्रा 3 Glycolysis तनाव परीक्षण और सेल मिळो तनाव परीक्षण के बाद घटता से पता चलता है ल्यूकेमिया से प्रभावित विस्फोटों की माप BCP-सभी (बी सेल अग्रदूत तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया) और एएमएल (गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया) रोगियों । इन माप से चयापचय मापदंडों की गणना भी संकेत दिया है । ५००,००० कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से बीज और सभी माप hexaplicates में किया गया ।

Glycolysis तनाव परीक्षण में केवल बेसल माध्यम का ही प्रयोग किया जाता है, जिससे कोशिकाएं पोषक तत्वों से वंचित रह जाती हैं । पहला पैरामीटर प्राप्त बेसल अंलीकरण है, जो कोशिकाओं में संग्रहीत ग्लूकोज की मात्रा को प्रतिबिंबित करना चाहिए. पहले इंजेक्शन के बाद, ीकार कोशिकाओं ग्लूकोज का उपयोग और यह स्तनपान कराने के लिए किण्वन कर सकते हैं के बाद से वृद्धि हुई है । Oligomycin एक दूसरे इंजेक्शन में एटीपी-सिंथेस रोकता है और इस तरह glycolysis के माध्यम से मुख्य रूप से एटीपी का उत्पादन करने के लिए कोशिकाओं का निर्देशन । इस ीकार की और तरक्की के कारण होना चाहिए । 2 के इंजेक्शन-डीजी पूरी तरह से glycolysis और ीकार बूंदों को रोकता है ।

सेल मिळो तनाव परीक्षण में, एक मध्यम glutamine और ग्लूकोज के साथ पूरक उपयोग किया जाता है, ताकि कोशिकाओं को सभी पोषक तत्वों से वंचित नहीं कर रहे हैं और बेसल श्वसन पैरामीटर उनके बेसल चयापचय राज्य को दर्शाता है. Oligomycin के साथ पहली इंजेक्शन के बाद, कोशिकाओं mitochondrial श्वसन बाधित और glycolysis जो ओसीआर की कमी के रूप में प्रतिनिधित्व किया है के लिए स्विच । FCCP (दूसरा और तीसरा इंजेक्शन), दूसरी ओर, कुछ भी श्वसन से एटीपी उत्पादन, इतना है कि कोशिकाओं को अब एक अधिक से अधिक दर और ओसीआर अपने उच्चतम मूल्य में वृद्धि में ऑक्सीजन की खपत । रोटेनोन के अंतिम इंजेक्शन और Antimycin एक मिश्रण पूरी तरह से mitochondrial श्वसन को रोकता है और ओसीआर शूंय के करीब कमी आई है ।

Figure 1
चित्रा 1: अस्थि मज्जा नमूना के घनत्व ढाल केंद्रापसारक । Mononuclear कोशिकाओं ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं के लिए समृद्ध घनत्व ढाल माध्यम से अलग कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Glycolysis तनाव परीक्षण और सेल मिळो तनाव परीक्षण की रूपरेखा । (क) Glycolysis तनाव परीक्षण का अनुकरणीय परिणाम. (ख) कोशिका मिळो तनाव परीक्षण का अनुकरणीय परिणाम । पैरामीटर घटता के भीतर संकेत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: BCP से ल्यूकेमिया से प्रभावित विस्फोटों के Extracellular फ्लक्स विश्लेषण-सभी (ए, बी) और एएमएल (बी, सी) रोगी । (A and C) Glycolysis तणाव चाचणी परिणाम. कृपया ध्यान दें कि पहला माप बिंदु आराम से काफी अलग हो सकता है और उस स्थिति में विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए । (ख आणि घ) सैल मिळो तणाव चाचणी परिणाम. पैरामीटर घटता के भीतर संकेत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पोर्ट Glycolysis तणाव चाचणी सैल मिळो तणाव चाचणी
पोर्ट पर लोड करें अंतिम कुएं में एकाग्रता पोर्ट पर लोड करें अंतिम कुएं में एकाग्रता
ए १०० एमएम ग्लूकोज की 20 μL 10 मिमी ग्लूकोज 20 μL 20 माइक्रोन Oligomycin एक 2 माइक्रोन Oligomycin ए
बी 22 μL के 20 माइक्रोन Oligomycin एक 2 माइक्रोन Oligomycin ए 15 माइक्रोन FCCP के 22 μL १.५ माइक्रोन FCCP
सी 1 एम 2 के 25 μL-डीजी १०० मिमी 2-डीजी 30 माइक्रोन FCCP के 25 μL ४.५ माइक्रोन FCCP
डी एक्स 25 μL की 10 माइक्रोन रोटेनोन और 10 μg/एमएल Antimycin ए 1 माइक्रोन रोटेनोन और 1 μg/एमएल Antimycin ए

तालिका 1: यौगिक खंड ।

चरण सेटिंग्स
अंशांकन स्वचालित
Equilibration स्वचालित
आधारभूत मापन तीन बार: मिश्रण-3 मिनट, रुको-0 मिनट, उपाय-3 मिनट
बंदरगाह के इंजेक्शन एक इंजेक्शन
माप तीन बार: मिश्रण-3 मिनट, रुको-0 मिनट, उपाय-3 मिनट
पोर्ट बी के इंजेक्शन इंजेक्शन
माप तीन बार: मिश्रण-3 मिनट, रुको-0 मिनट, उपाय-3 मिनट
बंदरगाह सी के इंजेक्शन इंजेक्शन
माप चार बार: मिश्रण-3 मिनट, रुको-0 मिनट, उपाय-3 मिनट

तालिका 2: Glycolysis तनाव परीक्षण के लिए कार्यक्रम ।

चरण सेटिंग्स
अंशांकन स्वचालित
Equilibration स्वचालित
आधारभूत मापन तीन बार: मिश्रण-3 मिनट, रुको-0 मिनट, उपाय-3 मिनट
बंदरगाह के इंजेक्शन एक इंजेक्शन
माप तीन बार: मिश्रण-3 मिनट, रुको-0 मिनट, उपाय-3 मिनट
पोर्ट बी के इंजेक्शन इंजेक्शन
माप तीन बार: मिश्रण-3 मिनट, रुको-0 मिनट, उपाय-3 मिनट
बंदरगाह सी के इंजेक्शन इंजेक्शन
माप तीन बार: मिश्रण-3 मिनट, रुको-0 मिनट, उपाय-3 मिनट
बंदरगाह डी के इंजेक्शन इंजेक्शन
माप तीन बार: मिश्रण-3 मिनट, रुको-0 मिनट, उपाय-3 मिनट

तालिका 3: सेल मिळो तनाव परीक्षण के लिए कार्यक्रम ।

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Discussion

उपर्युक्त प्रोटोकॉल चयापचय गतिविधि तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (सभी) या गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) के साथ रोगियों से व्युत्पंन प्राथमिक ल्यूकेमिया से प्रभावित विस्फोटों में ओसीआर और ीकार मूल्यों द्वारा मूल्यांकन की माप के लिए अनुमति देता है । एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर माप का लाभ यह है कि यह लाइव कोशिकाओं में वास्तविक समय में चयापचय प्रोफ़ाइल का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है । मूलतः, प्रदान की प्रोटोकॉल में हर कदम सेल प्रकार एक अध्ययन की योजना के आधार पर समायोजित किया जा सकता है । यहां, हम सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों पर चर्चा करेंगे जो परिणामों को प्रभावित कर सकता है और इष्टतम मूल्यों से कम प्रदान कर सकता है ।

अनुकूलन की दिशा में पहला कदम ताजा सामग्री से प्राप्त डेटा की तुलना जमे हुए सामग्री बनाम था । जमे हुए सामग्री से चयापचय गतिविधि को मापने की क्षमता तरल नाइट्रोजन बैंक में संग्रहीत रोगियों के नमूने के पूर्वव्यापी अध्ययन के लिए अनुमति होगी । सभी नमूनों के मामले में, हम केवल ताजा सामग्री जबकि एएमएल कोशिकाओं भी de-इष्टतम परिणामों के साथ ठंड के बाद मापा गया से सुसंगत चयापचय गतिविधि का पता लगाने में सक्षम थे ।

अनुकूलन की दिशा में दूसरा कदम प्राथमिक ल्यूकेमिया से प्रभावित धमाकों की खेती है । हम घनत्व ढाल जुदाई के बाद सीधे कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि का परीक्षण किया है (संवर्धन के बिना) या संवर्धन के बाद रातोंरात । यहां तक कि अगर घनत्व ढाल जुदाई के बाद कोशिकाओं व्यवहार्य और एक खुर्दबीन के नीचे महत्वपूर्ण देखा, उनकी चयापचय गतिविधि ख़राब हो गया था । कुल मिलाकर ीकार और ओसीआर मूल्यों को कम किया गया और भी, इंजेक्शन के बाद, ओसीआर या ीकार मूल्यों को बेहतर जवाब नहीं के रूप में वे खेती की कोशिकाओं में किया था.

विभिंन स्थितियों के तहत खेती भी परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । इंसुलिन कैल्सीटोनिन सोडियम selenite पूरक का उपयोग करना (इसकी) एक अच्छा अभ्यास माना जाता है जब प्राथमिक विस्फोटों की खेती8, लेकिन इस पूरक कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि के साथ हस्तक्षेप. सेल मिळो तनाव परीक्षण के दौरान, ल्यूकेमिया से प्रभावित विस्फोटों के साथ खेती की Oligomycin एक (ओसीआर के लिए एटीपी से जुड़े की गणना करने के लिए कम करना चाहिए) का जवाब नहीं दिया । हम भी mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) के साथ कोशिकाओं को सहयोग करने की कोशिश की, लेकिन इस मामले में, ओसीआर और ीकार मूल्यों MSCs के बिना खेती की कोशिकाओं की तुलना में कम किया गया है । सारांश में, 10% FBS के साथ RPMI माध्यम में ल्यूकेमिया रोगियों से प्राथमिक विस्फोटों की खेती सबसे अच्छा विकल्प है ।

रोगियों को उनके चयापचय प्रोफ़ाइल के लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त कुछ मानदंडों को पूरा करना होगा जो एक हाथ पर परीक्षण नमूनों की संख्या की सीमा पर अन्य प्रासंगिक परिणाम निकलेगा. हम उच्च सेलुलर के साथ रोगियों के चयापचय समारोह मापा (एक माप के लिए हम hexaplicate में ५००,००० कोशिकाओं/बीज प्रति) और केवल ८० के साथ नमूनों और ल्यूकेमिया से प्रभावित विस्फोटों का एक उच्च प्रतिशत विशिष्ट का पता लगाने से बचने के लिए मापा जा सकता है निलंबन में मौजूद अन्य कोशिका प्रकारों की मेटाबोलिक गतिविधि.

डेटा विश्लेषण में महत्वपूर्ण चरणों में से एक सामांयीकरण है, ताकि विभिन्न ल्यूकेमिया से प्रभावित नमूनों के बीच चयापचय मापदंडों की तुलना की जा सके. ल्यूकेमिया से प्रभावित सेल लाइनों के साथ प्रदर्शन किया हमारे पिछले प्रयोगों के अनुसार, हमने पाया है कि कोशिकाओं की संख्या को सामान्य सबसे अच्छा परिणाम देता है. प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की विशिष्ट संख्या के लिए शोधकर्ता द्वारा निर्धारित की जरूरत है और आकार और परीक्षण कोशिकाओं के चयापचय गतिविधि पर निर्भर करता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम चेक बाल रुधिर केंद्रों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम स्वास्थ्य मंत्रालय के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (NV15-28848A), चेक गणराज्य के स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा, विश्वविद्यालय अस्पताल Motol, प्राग, चेक गणराज्य ०००६४२०३ और शिक्षा मंत्रालय द्वारा, युवा और खेल NPU मैं nr. LO1604 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Gibco, ThermoFisher Scientific 61870-010
Fetal Bovine Serum Biosera FB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco, ThermoFisher Scientific 15240-062
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
D-(+) Glucose Sigma-Aldrich G7021-100G
Oligomycin A Sigma-Aldrich 75351-5MG
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375-1G
FCCP Sigma-Aldrich C2920-10MG
DMSO Sigma-Aldrich D8418-100ML
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mL Agilent Technologies 103193-100
L-glutamine solution, 200 mM Sigma-Aldrich G7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 Sigma-Aldrich H0887-100ML
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280-25G
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2153-10G
Ficoll-Paque Plus Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPak Agilent Technologies 103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive ThermoFisher Scientific CB40240
Seahorse Analyzer XFp Agilent Technologies S7802A
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १४१ ल्यूकेमिया अस्थि मज्जा चयापचय glycolysis mitochondrial श्वसन extracellular फ्लक्स चयापचय प्रोफ़ाइल विश्लेषक
प्राथमिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के चयापचय प्रोफ़ाइल का आकलन
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Hlozková, K., Starková, J. … More

Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (141), e58426, doi:10.3791/58426 (2018).

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