Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

doi: 10.3791/58426 Published: November 21, 2018

Summary

여기 선물이 leukemic 세포 백혈병 환자 골 수에서 격리 및 그들의 대사 상태 분석을 위한 프로토콜. 기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가 1 차 셀의 수요 특성을 더 나은 하는 데 도움이 수 그리고 더 맞춤된 의학까지 이어질 수 있습니다.

Abstract

암 세포의 대사 요구 부정적인 생존 및 치료 효능에 영향을 미칠 수 있습니다. 요즘, 변화 통로의 제약을 대상으로 다양 한 종양에서에서 테스트 됩니다. 따라서, 암 세포 대사 설치의 대상 환자의 전반적인 결과 개선 하기 위해 올바른 경로 위해 불가피 하다. 불행 하 게도, 암의 대다수에서 악성 세포가 더 높은 숫자를 매우 어려운 및 조직 생 검 필요 합니다. 백혈병은 예외, 어디 leukemic 세포의 충분 한 수 골에서 격리 될 수 있습니다. 여기, 우리는 leukemic 세포 백혈병 환자 골 수에서 분리 및 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 그들의 대사 상태의 이후 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. Leukemic 세포는 그들의 생존에는 영향을 미치지 않습니다 밀도 그라데이션에 의해 격리 됩니다. 다음 재배 단계 재생성 하 그들을 도와, 따라서 대사 상태 측정은 최적의 조건에서 셀의 상태. 이 프로토콜은 개인된 치료에 사용 될 수 있는 일관 된, 잘 표준화 된 결과 달성 수 있습니다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

신진 대사 프로필 셀의 주요 특징 중 하나 이며 변경 된 생체는 지금 암1,2,3의 특징 중 하나를 간주 됩니다. 또한, 신진 대사 설치에 변경 신호 변환 통로 또는 암 세포4,,56의 효소 기계 장치를 대상으로 암 치료에 사용 될 수 있습니다. 암 세포의 변화 경향을 알고 따라서 이점을 이며 현재 치료를 향상 시킬 수 있습니다.

문화에 있는 세포의 대사 활동을 평가할 수 있는 이미 설정 된 방법의 많음이 있다. 분해에 대하여 포도 당 통풍 관 측정 될 수 있다 방사성 라벨 2-NBDG를 사용 하 여 (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) 또는 extracellular 젖 산 수준 측정 효소7,8. 지방산 산화 속도 isotopically 레이블된 물9,10에 의해 측정 하는 또 다른 대사 매개 변수입니다. 산소 소비 속도 셀11,12, 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 평가13,14, ATP/ADP (아데노신 함께 미토 콘 드리 아 활동을 결정 하는 데 널리 사용 되는 방법 5 '-3 인산 염/아데노신 5 '-diphosphate) 비율 측정15 또는 총 세포내 ATP 측정16. 알려진 대사 과정을 조절 하는 통로 신호 단백질 quantifications에 의해 결정 될 수 있었다 고 대사 측정17,,1819의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.

그러나, 이러한 모든 방법을 하나만 측정 또는, 최고의 시나리오 하나에 몇 가지 변화 매개 변수는 동시에 샘플. 중요 한 것은, 산소 소비 속도 (OCR) 및 세포 외 산성화 속도 (ECAR)의 동시 측정, 예를 들어 해 마 XFp 분석기에 의해 세포 외 유출 분석에 의해 얻을 수 있습니다. OCR은 미토 콘 드리 아 호흡 ECAR 이며 주로 분해 (우리는 CO2 생산 가능성이 높은 산화 인 산화 활동 ECAR 셀의 높이 무시할 수 없는)의 결과20. 지금까지, 다양 한 세포 유형 사용이 분석기21,,2223공부 되었습니다.

여기 우리는 백혈병 환자에서 주요 폭발 (미 숙 조 혈 단계에서 파생 된 백혈병 세포)의 세포 외 유출 분석에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 지식 최선을 주 폭발에 대 한 특정 프로토콜 사용할 아직 아니에요.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

모든 샘플 어린이 부모 또는 보호자의 informed consent와 찰스 대학에서 프라하, 체코 공화국, 연구 윤리 위원회의 승인을 얻어 졌다 아니. NV15-28848A입니다.

1입니다. 시 약의 준비

  1. 137 mM NaCl, 2.7 m m KCl, 4.3 m m 나2HPO4, 1.47 m m KH24, ddH2HCl Sterilize와 O. 조절 pH 7.4에 압력가 마로 소독 하 여 용 해 하 여 PBS의 500 mL를 준비 합니다.
  2. 100ml RPMI 매체의 준비: L-Alanyl-글루타민 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 μ g/mL)와 RPMI-1640 매체.
  3. 0.1 m M NaHCO3 증류수 50 mL를 준비 합니다. 8.1에 pH를 조정, 필터 (0.22 μ m) 소독 및 4 ° c.에 저장
    참고: 두 개의 8-잘 세포 외 유출 분석기 접시, 0.1 m M NaHCO3 pH 8.1의 250 μ 준비.
  4. 1 mL의 증류수에 2 M D-포도 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
  5. 1mm Oligomycin A 에탄올에서의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
  6. 1 M 2-의하여-D-포도 당 (2-DG) 최소 DMEM (Dulbecco의 수정이 글의 중간)에서 250 μ를 준비 합니다. 37 ° C로 온난 하 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
  7. 1mm DMSO에 FCCP (carbonyl 시안-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone)의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
  8. 100 μ에서 에탄올 1 m m로 테 논의를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
  9. 1 mg/mL 에탄올에 Antimycin A의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
  10. 바로 사용 전에 분해 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 물 욕조에 37 ° C 최소한 DMEM 따뜻한 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다.
  11. 이전에 사용 하 여, BSA와 셀 미토 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 2 m L-글루타민, 10 m m D-포도 당, 1mm HEPES (pH 7.4), 1 mM pyruvate와 0.1 %BSA (소 혈 청 알 부 민) 최소 DMEM을 보충. 따뜻한 물 욕조에 37 ° C를 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다.
  12. 이전에 사용 하 여, BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 2 m L-글루타민, 10 m m D-포도 당, 1mm HEPES (pH 7.4) 최소 DMEM 보충 및 1 mM pyruvate. 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에 BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 매체 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다.
    참고: BSA 매체 BSA와 보충 때 셀 FCCP에 더 나은 응답 때문에 셀 미토 스트레스 테스트 중간에 추가 됩니다 (다른 조건 테스트를 했다). BSA 없이 세포 미토 스트레스 테스트 매체 제조자는 매체에서 BSA를 사용 하 여 권장 하지 않습니다 포트 로드 사용 됩니다.

2. 단 세포 골 수에서 격리

참고: 이상적으로, 기본 백혈병 세포의 대사 상태의 측정은 골 수 수집 및 셀 격리 후 즉시 시작 한다. 그럼에도 불구 하 고, 관련 데이터 셀 분리 후 체코 공화국에 있는 다른 혈액학에서 교통 센터에서 또한 얻을 수 수 있습니다. 메 마른 조직 문화 후드에 모든 하위 단계를 수행 합니다.

  1. PBS와 실내 온도에 밀도 그라데이션 중간에 워밍업.
  2. 1: 1의 비율에 PBS 가진 백혈병 환자의 골 수 샘플을 희석. 샘플 leukemic 돌풍의 80% 이상 포함 되어 있는지 확인 합니다.
  3. Cytometry 특정 CD 마커를 사용 하 여 셀의 immunophenotype 특성에 의해 폭발의 백분율을 결정 합니다. 밀도 그라데이션 분리 후 전반적인 세포 수를 설치 하기 위하여 핵 산 핵 염료와 긍정적인 이벤트를 감지 합니다.
  4. 그런 다음, 백혈병의 각 유형에 대 한 특정 CD 마커를 사용 하 여 백혈병 세포를 결정: B-모든 (CD19, CD45), T-모든 (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) 및 AML (CD45, CD33, 그리고 특정 골수성 마커)24. 모든 핵 세포 백혈병 폭발 세포의 백분율을 확인 하 여 특정 CD 표식에 대 한 긍정적인 백혈병 세포의 수를 나눕니다.
    참고: 골 수 anticoagulants 튜브에 수집 수 있다.
  5. 신중 하 게 6 mL 희석된 골 수 샘플 15 mL 원뿔 튜브에 밀도 그라데이션 매체의 이상 6 mL의 레이어. 브레이크 없이 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 35 분에 대 한 400 x g에서 원심.
    참고: 샘플의 더 큰 볼륨은 더 aliquots로 분할 될 수 또는 50 mL 원뿔 튜브 밀도 그라데이션 매체의 더 큰 금액으로 사용 될 수 있습니다.
  6. 5 mL PBS의 새로운 50 mL 원뿔 튜브 interphase 레이어 단 세포 (그림 1)으로 구성 된 전송 신중 하 게 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여. 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 10 분 동안 400 × g에서 원심.
    참고: 단일 50 mL 원뿔 튜브 PBS의 5 mL에 모든 단 세포 층을 전송.
  7. 상쾌한 발음 하 고 메 마른 PBS의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
    참고: aspirated 골의 1 mL에 백혈병 세포의 수는 환자25마다 크게 다릅니다.

3. 하룻밤 재배 단 세포의

참고: 모든 하위 단계를 수행 하는 살 균 조직 문화 후드.

  1. RPMI의 20 mL으로 두 T75 플라스 크를 준비 합니다. 각 플라스 크에 고립 된 30 x 106 단 셀을 추가 합니다. 16-24 h 5% CO2 와 37 ° C에 서 플라스 크로 셀을 품 어

4. 셀 접착제 코팅 접시의 준비

  1. 코트 두 8 잘 세포 외 유출 분석기 접시.
    참고: 메 마른 조직 문화 후드에 코팅을 수행 합니다.
  2. 2.2 μ의 세포 접착제 추가 (밀도: 2.54 mg/ml)을 0.1 m M NaHCO3, pH 8.1, 고 각 잘으로 피 펫 즉시 12.5 μ의 250 μ.
    참고: 셀 접착제 재고 솔루션 그들의 밀도에 차이가, NaHCO3 에 따라 추가 볼륨을 조정할 수 있습니다.
  3. 약 20 분, 후드에 앉아 셀 접착제 발음 그리고 잘 두 번 살 균 물 200 μ를 사용 하 여 각 세척 접시를 보자. 웰 스는 건조 때까지 뚜껑 열기와 후드에 앉아 보자.
  4. 지금 당장 접시를 사용 하 여 또는 응축을 피하기 위해 파라핀 영화에 싸여 테두리와 4 ° C에서 최대 1 주를 저장 합니다. 그 접시는 예 열 (약 20 분) 동안 실내 온도에 후드에 셀을 뿌리기 전에 확인 하십시오.

5입니다. 수 분이 센서 카트리지

참고: 수화물 2 8 잘 세포 외 유출 분석기 카트리지.

  1. 유틸리티 플레이트와 센서 카트리지를 분리 합니다. 거꾸로 실험실 벤치에 센서 카트리지를 놓습니다.
  2. 각 채우기 200 μ calibrant와 유틸리티 플레이트의 잘. Calibrant의 400 μ로 각 굴 우물의 외부 주위를 채우십시오.
  3. 이제는 calibrant를 포함 하는 유틸리티 접시에 센서 카트리지를 반환 합니다.
  4. 습도, 비 CO2, 37 ° C 배양 기 하룻밤 카트리지 어셈블리를 놓습니다.
  5. 세포 외 유출 분석기를 켜고 하자 37 ° C에 따뜻한 하룻밤.

6. 시드 셀 셀 접착제 코팅 판에

참고: 분해 스트레스 테스트를 사용 하 여 분해 스트레스 테스트 매체. 셀 미토 스트레스 테스트를 위해 BSA와 셀 미토 스트레스 테스트 매체를 사용 합니다.

  1. 씨 셀 분해 스트레스 테스트와 별도 접시에 셀 미토 스트레스 테스트에 대 한. 각 테스트에 대 한 숙박 문화 한 플라스 크에서 셀을 사용 합니다.
  2. 실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 셀 원심 Resuspend 적절 한 매체의 1 mL에 셀과 그들.
  3. 4 x 106 라이브 셀 400 μ (사용 적절 한 매체)의 최종 볼륨을 추가 합니다.
  4. B-G. 웰 스에 세포 현 탁 액의 50 μ 접시 500000 셀 한 잘에 시드는 확인 합니다.
    참고: 다른 정규화 수행 잘 당 정확 하 게 500, 000 셀을 시드하 결정적 이다. 그런 식으로 다른 환자에서 결과 비교할 수 있습니다. 여기 설명 대로 복제의 최적의 수 6,입니다. 적은 복제를 사용 하 여 이후 1 차 셀 잘못 행동 때로는 수 권장 하지 않습니다.
  5. 웰 스 A와 H (이 웰 스 배경 수정 될 것입니다)에 적절 한 매체의 180 μ를 추가 합니다.
  6. 1로 설정 하는 브레이크와 함께 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심.
  7. 천천히, 그리고 신중 하 게 두 개의 8-잘 세포 외 유출 분석기 플레이트에 웰 스 B G에 적절 한 매체의 130 μ를 추가 합니다. 시각적으로 확인 하는 세포는 현미경에서 여 우물의 바닥에 안정적으로 준수는.
  8. 30 분 동안 37 ° C 배양 기, 습도, 비 CO2로 접시를 놓습니다.

7. 로드 센서 카트리지

  1. 분해 스트레스 테스트에 대 한 각 포도 당 100 m m, 20 μ M Oligomycin A와 1 M 2-DG, 분해 스트레스 테스트 중간에 모두 250 μ를 준비 합니다.
  2. 셀 미토 스트레스 테스트 준비 250 μ 각각 20 μ M Oligomycin A의 15 μ FCCP, 30 μ FCCP, 10 μ M의 혼합물으로 테 논 및 10 μ g/ml Antimycin A, BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 중간에 모두.
    참고: FCCP 적정에 대 한 충분 한 환자의 자료 없기 때문에 좋습니다 FCCP의 한 분석 결과에 두 개의 농도 주입. 그럼에도 불구 하 고, 농도 연구원에 의해 결정 되어야 합니다.
  3. 화합물의 카트리지 (표 1)을 다음과 같이 적절 한 인젝터 포트 로드:

8. 프로그램 설정

  1. 표 2에 설명 된 대로 해당 분해 스트레스 테스트에 대 한 프로그램을 설정 합니다.
  2. 표 3에 설명 된 대로 셀 미토 스트레스 테스트에 대 한 프로그램을 설정 합니다.
  3. 프로그램을 시작 합니다. 분석 결과 플레이트 (나타나면) calibrant 플레이트를 교체 합니다.

9. 평가 및 결과의 해석

  1. 분해 스트레스 테스트 결과에 다른 모든 ECAR 값에서 2-DG 주입 후 최저 ECAR 값을 뺍니다.
    참고:이 값이 낮은 비 glycolytic 산성화를 나타냅니다. 일반적으로, 가장 낮은 값은 4 측정에서.
  2. 기저 산성화, 분해, 최대한 분해 및 glycolytic 함수 (그림 2A)에서 Glycolytic 예약 매개 변수를 계산 합니다. 첫 번째 3 개의 측정 지점에서 ECAR의 의미로 기저 산성화 ECAR 최소값을 뺀 후 계산 (생략 첫 번째 ECAR 값 크게 다른 2에서와 다른 경우), 3 측정에서 ECAR의 뜻으로 분해를 계산 포도 당 주입 후 포인트와 최대한 분해 ECAR의 3 측정에서 평균 포인트 Oligomycin 후 주사를 계산. 계산 Glycolytic 분해 마이너스 최대한 분해로 예비.
    참고: 또는, 최대한 분해 계산에 대 한 3 점 측정에서 가장 높은 ECAR 값을 사용 합니다.
  3. 셀 미토 스트레스 테스트 결과에 다른 모든 OCR 값에서로 테 논/Antimycin A 주입 후 최저 OCR 값을 뺍니다.
  4. 기초 호흡, ATP 생산, 최대한 호흡 및 미토 콘 드리 아 기능 (그림 2B)에서 예비 용량 매개 변수를 계산 합니다. 뺀 후 OCR 최소값, 첫번째 3 개의 측정 지점에서 OCR의 뜻으로 기저 호흡을 계산 합니다.
    참고: 최대한 호흡 FCCP 주입 후 가장 높은 OCR 값입니다.
  5. ATP 생산 계산, 기초 호흡에서 Oligomycin A 주입 후 3 OCR 측정 포인트의 평균을 뺍니다. 기초 호흡 마이너스 최대한 호흡으로 예비 용량을 계산 합니다.
    참고: 항상 사용 FCCP 농도 상관 없이 높은 OCR 값에서 최대한 호흡을 계산 합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

그림 3 BCP-모든 (B 세포 선구자 급성 림프 구성 백혈병)과 급성 골수성 백혈병 (급성 골수성 백혈병) 환자에서 분해 스트레스 테스트 및 leukemic 돌풍의 셀 미토 스트레스 테스트 측정 후 곡선을 보여준다. 이 측정에서 대사 매개 변수 계산도 표시 됩니다. 잘 당 500000 셀 시드 했다 그리고 모든 측정 hexaplicates에서 수행 했다.

분해 스트레스 테스트 셀 양분의 박탈 하는 유일한 기저 매체 사용 됩니다. 얻은 첫 번째 매개 변수는 셀에 저장 된 포도 당의 양을 반영 한다 기저 산성화. 첫 번째 주사 후 ECAR 이후 세포 포도 당을 활용 하 고 젖이 나올 그것을 발효 수 있습니다 증가 합니다. 두 번째 주입에서 Oligomycin A ATP synthase를 억제 하 고 따라서 주로 분해를 통해 ATP를 생산 하는 세포를 지시. 이 추가 상승 ECAR로 인해 한다. 2-DG의 주사는 완전히 분해를 억제 하 고 ECAR 드랍 스.

세포는 모든 양분의 박탈 하지 하 고 그들의 기저 대사 상태를 반영 하는 기저 호흡 매개 변수 셀 미토 스트레스 테스트에서 글루타민과 포도 당으로 보충 하는 매체 사용 됩니다. Oligomycin A와 함께 첫 번째 주사 후 세포 미토 콘 드리 아 호흡을 억제 하 고 분해 감소 OCR로 표시 되는 전환. FCCP (두 번째 및 세 번째 주사), 다른 한편으로, uncouples, 호흡에서 ATP 생산 있도록 셀 지금 최대한 속도 그것의 가장 높은 값을 OCR 상승에 산소 소비. 로 테 논, Antimycin A 혼합물의 마지막 주입 완전히 미토 콘 드리 아 호흡을 억제 하 고 OCR 0에 가까운 감소.

Figure 1
그림 1: 골 수 샘플의 밀도 그라데이션 원심. 단 세포 농축 leukemic 세포에 대 한 밀도 그라데이션 매체에 의해 구분 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 해당 분해 스트레스 테스트 및 셀 미토 스트레스 테스트의 개요 (A) 분해 스트레스 테스트의 모범적인 결과. (B) 세포 미토 스트레스 테스트의 모범적인 결과. 매개 변수 곡선 내에서 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: leukemic 돌풍 BCP-모든 (A, B) 및 (B, C) 급성 골수성 백혈병 환자에서의 세포 외 유출 분석. (AC) 분해 스트레스 테스트 결과. 첫 번째 측정 지점 나머지에서 크게 다를 수 있습니다 및 경우에 분석에서 제외 되도록 note 하시기 바랍니다. (BD) 셀 미토 스트레스 테스트 결과. 매개 변수 곡선 내에서 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

포트 분해 스트레스 테스트 셀 미토 스트레스 테스트
포트 로드 우물에서 최종 농도 포트 로드 우물에서 최종 농도
A 포도 당 100 m m의 20 μ 10 m m 포도 당 20 μ M Oligomycin A의 20 μ 2 μ M Oligomycin A
B 20 μ M Oligomycin A의 22 μ 2 μ M Oligomycin A 15 μ FCCP의 22 μ 1.5 Μ M FCCP
C 1 M 2-DG의 25 μ 100 m m 2-DG 30 μ FCCP의 25 μ 4.5 Μ M FCCP
D X 10 μ M로 테 논의 25 μ와 10 μ g/ml Antimycin A 1 μ M로 테 논 및 1 μ g/ml Antimycin A

표 1: 복합 볼륨.

단계 설정
교정 자동 번역
재래식 자동 번역
초기 측정 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합
포트 A의 주입 사출
측정 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합
포트 B의 주입 사출
측정 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합
포트 C의 주입 사출
측정 4 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합

표 2: 해당 분해 스트레스 테스트에 대 한 프로그램입니다.

단계 설정
교정 자동 번역
재래식 자동 번역
초기 측정 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합
포트 A의 주입 사출
측정 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합
포트 B의 주입 사출
측정 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합
포트 C의 주입 사출
측정 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합
D 포트의 주입 사출
측정 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합

표 3: 셀 미토 스트레스 테스트에 대 한 프로그램.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

(모두) 급성 림프 구성 백혈병 환자에서 파생 하는 기본 leukemic 돌풍에 OCR 및 ECAR 값으로 평가 하는 신진 대사 활동의 측정에 대 한 상기 설명 된 프로토콜 허용 또는 급성 골수성 백혈병 (AML). 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 측정의 장점은 실시간으로 살아있는 세포에서 대사 프로 파일의 검색 수 있습니다. 기본적으로 제공 된 프로토콜에서 모든 단계 하나 공부 계획 셀 유형에 따라 조정 될 수 있습니다. 여기, 우리는 결과 영향을 미칠 수 있는 최적의 값 보다 적게 제공할 수 있는 가장 중요 한 매개 변수를 설명 합니다.

최적화 향한 첫 번째 단계는 재료를 냉동 신선한 소재 대에서 가져온 데이터의 비교 했다. 액체 질소 은행에 저장 된 환자의 샘플의 회고전 연구에 대 한 냉동된 재료에서 신진 대사 활동을 측정 하는 능력 수 있습니다. 모든 샘플의 경우 AML 셀 드 최적의 결과와 동결 후 또한 측정 하는 반면 신선한 소재로 일관 된 신진 대사 활동을 감지할 수 있었습니다.

최적화 쪽으로 두 번째 단계는 기본 leukemic 돌풍의 재배 이다. (경작) 하지 않고 밀도 그라데이션 분리 후 바로 또는 하룻밤 배양 한 후 세포의 대사 활동을 테스트 했습니다. 경우에 밀도 그라데이션 분리 후 셀 실용적이 고 중요 한 현미경을 보 니, 그들의 신진 대사 활동 장애인 이었다. 전반적인 ECAR 및 OCR 값 낮은 고도, 주입, 후 OCR 또는 ECAR 값 응답 하지 않았습니다 최적의 재배 셀에.

다른 조건 하에서 재배 또한 결과 좌우할 수 있다. 인슐린 처리가 나트륨 selenite 보충 (ITS)를 사용 하 여8, 폭발의 주요 재배 하지만이 보충 교재는 세포의 신진 대사 활동 방해 좋은 연습으로 간주 됩니다. 셀 미토 스트레스 테스트 동안 leukemic 돌풍 ITS와 재배 Oligomycin A에 응답 하지 않았습니다 (OCR는 ATP 연결 호흡을 계산 하려면 감소 한다). 우리는 또한 공동 중간 엽 줄기 세포 (MSC)와 세포 배양 하려고 하지만 경우에, OCR 및 ECAR 값가지고 되었습니다 낮은에 비해 MSCs 없이 재배 하는 셀. 요약 하자면, 재배 RPMI에 백혈병 환자에서 1 차 폭발 중간 10 %FBS 최상의 옵션입니다.

그들의 신진 대사 프로필 특성에 대 한 적합 한 환자는 한 손으로 테스트 샘플 수에 하지만 다른 관련성이 높은 결과 얻을 것 이다 특정 기준을 충족 해야 합니다. 우리가 높은 cellularity 환자 대사 기능 측정 (하나의 측정에 대 한 우리 500000 셀 시드 / hexaplicate 웰 스 당) 80와 leukemic 돌풍의 더 높은 백분율 샘플만 난다의 탐지를 피하기 위해 측정 될 수 다른 종류의 세포 현 탁 액에 있는 신진 대사 활동.

데이터 분석에 중요 한 단계 중 하나는 정상화, 다른 leukemic 샘플 사이 변화 매개 변수를 비교할 수입니다. 우리의 이전 실험 leukemic 세포 선으로 수행에 따르면 우리는 셀의 수를 정규화 최상의 결과 제공 발견. 잘 당 세포의 특정 번호는 연구원에 의해 결정 되어야 하 고 크기와 시험된 세포의 대사 활동에 따라 달라 집니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 체코 소아 혈액학 센터 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 내가 nr 부여의 사역의 건강 (NV15-28848A), 보건 및 교육, 청소년 및 스포츠 NPU 대학 병원 Motol, 체코 공화국, 프라하, 체코 공화국 00064203에 의해에서 지원. LO1604입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Gibco, ThermoFisher Scientific 61870-010
Fetal Bovine Serum Biosera FB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco, ThermoFisher Scientific 15240-062
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
D-(+) Glucose Sigma-Aldrich G7021-100G
Oligomycin A Sigma-Aldrich 75351-5MG
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375-1G
FCCP Sigma-Aldrich C2920-10MG
DMSO Sigma-Aldrich D8418-100ML
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mL Agilent Technologies 103193-100
L-glutamine solution, 200 mM Sigma-Aldrich G7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 Sigma-Aldrich H0887-100ML
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280-25G
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2153-10G
Ficoll-Paque Plus Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPak Agilent Technologies 103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive ThermoFisher Scientific CB40240
Seahorse Analyzer XFp Agilent Technologies S7802A
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
  2. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
  3. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
  4. Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
  5. Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
  6. Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
  7. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
  8. Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
  9. Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
  10. Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
  11. Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
  12. Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
  13. Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
  14. Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
  15. Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
  16. Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
  17. Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 12553-12558 (2010).
  18. Lee, K. -H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
  19. Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
  21. Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
  22. Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
  23. Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
  24. Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
  25. Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (141), e58426, doi:10.3791/58426 (2018).More

Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (141), e58426, doi:10.3791/58426 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter