Macropinocytosis, बड़े पैमाने पर गैर विशिष्ट द्रव, इम्यूनोलॉजी, संक्रमण, कैंसर, और neurodegenerative रोगों सहित नैदानिक जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण है । यहां, मौजूदा तकनीकों में macropinocytosis के उच्च प्रवाह, एकल-कक्ष रिज़ॉल्यूशन माप की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है macropinocytosis मॉडल जीव Dictyostelium प्रवाह cytometry का उपयोग discoideum ।
macropinocytosis द्वारा बड़े पैमाने पर गैर विशिष्ट द्रव के ऊपर उठाना कुछ कैंसर कोशिकाओं के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है, प्रतिजन नमूना, मेजबान सेल आक्रमण और neurodegenerative रोगों के प्रसार. अमीबा Dictyostelium discoideum के आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगशाला उपभेदों अत्यंत उच्च द्रव तेज दर जब पोषक तत्व मध्यम में उगाया जाता है, जिनमें से ९०% से अधिक macropinocytosis के कारण है । इसके अलावा स्तनधारी macropinocytosis के कई जाने-माने कोर कंपोनेंट्स भी मौजूद हैं, जिससे macropinocytosis की पढ़ाई के लिए यह एक बेहतरीन मॉडल सिस्टम बना है । यहां, मानक एक लेबल के रूप में फ्लोरोसेंट dextran का उपयोग तरल पदार्थ को मापने के लिए तकनीक एक ९६-अच्छी प्लेट प्रारूप के लिए अनुकूलित है, नमूने के साथ प्रवाह cytometry एक उच्च प्रवाह नमूना (HTS) लगाव का उपयोग करके विश्लेषण किया ।
कोशिकाओं को एक पूर्व समय की लंबाई निर्धारित के लिए गैर अतृप्त फ्लोरोसेंट dextran खिलाया, बर्फ में विसर्जन से धोया-ठंड बफर और 5 मिमी सोडियम azide, जो भी exocytosis बंद हो जाता है का उपयोग कर अलग कर रहे हैं । प्रत्येक कुआं में कोशिकाओं को फिर प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । विधि भी झिल्ली को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और फ्लोरोसेंट मोती या बैक्टीरिया के phagocytosis ।
इस विधि के लिए एक उच्च प्रवाह, श्रम और संसाधन कुशल तरीके से Dictyostelium द्वारा द्रव तेज की माप की अनुमति के लिए डिज़ाइन किया गया था । यह कई उपभेदों की एक साथ तुलना की अनुमति देता है (एक जीन की नॉकआउट म्यूटेंटउदाहरण के लिए) और शर्तों (विभिंन मीडिया मेंउदाहरण के लिए कोशिकाओं या अवरोध करनेवाला के विभिंन सांद्रता के साथ इलाज) समानांतर में और समय-पाठ्यक्रमों को सरल ।
macropinocytosis द्वारा बड़े पैमाने पर गैर विशिष्ट द्रव के ऊपर उठाना कई जैविक संदर्भों में महत्वपूर्ण है1, प्रतिजन प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा नमूना सहित2, होस्ट कोशिकाओं में रोगज़नक़ प्रवेश3, कैंसर सेल प्रसार4 और prion रोगों का प्रसार5. स्तनधारी और Dictyostelium कोशिकाओं में, actin6,7, PI (3, 4, 5) p8,9,10 (हालांकि लिपिड की सटीक प्रकृति दो11के बीच अलग है), सक्रिय रास12,13, और सक्रिय आरएसी14,15 macropinocytosis द्वारा कुशल तरल पदार्थ के लिए महत्वपूर्ण हैं, हालांकि वहां रहने के बारे में कई अनुत्तरित प्रश्न कैसे macropinocytic पैच है का गठन, संगठित और अंततः आंतरिक । अधिक macropinocytosis के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन की खोज, और कैसे वे विभिंन जैविक संदर्भों में महत्वपूर्ण है के बाद के निर्धारण, macropinocytosis की एक और अधिक व्यापक समझ दे और संभवतः के विकास की अनुमति देगा स्थितियों की एक सीमा के लिए लक्षित उपचार ।
Dictyostelium macropinocytosis के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली है । मानक प्रयोगशाला उपभेदों में गठित macropinocytosis के उच्च स्तर का मतलब है कि द्रव तेज macropinocytosis6के कारण ९०% से अधिक है । यह macropinocytosis केवल द्रव का निर्धारण द्वारा मापा जा करने के लिए अनुमति देता है, स्तनधारी कोशिकाओं के विपरीत, जहां macropinocytosis के कारण तरल पदार्थ का अनुपात काफी कम है । कि macropinocytosis इतनी अच्छी तरह से परिभाषित है और आसानी से इस प्रणाली में12 visualized इसी तरह अंय प्रणालियों पर macropinosome के कोर संरक्षित घटकों की जांच के लिए अलग लाभ प्रदान करता है जहां कई विनियामक संकेत हो सकता है 16 , 17. शी.
मानक तकनीक स्तनधारी कोशिकाओं द्वारा macropinocytosis मापने के लिए इस्तेमाल किया समय की एक छोटी अवधि के लिए सूक्ष्मता के बाद एक सेल है कि dextran द्वारा कब्जा कर लिया है के क्षेत्र निर्धारित करने के लिए dextran के साथ स्पंदन के बाद कोशिकाओं फिक्सिंग शामिल है-सकारात्मक बुलबुले18। इस तकनीक को हालांकि सेल, जो19 Dictyosteliumमें सूचित किया गया है में प्रवेश करने पर सिकुड़ते macropinosomes की संभावना के लिए खाते में नहीं है, और केवल खाते में सेल के एकल विमानों लेता है, आंतरिक मात्रा अर्थ अस्पष्ट है । एक वैकल्पिक तकनीक, एक निश्चित समय में आंतरिक macropinosomes की संख्या की गिनती की, एक ही नकारात्मक पक्ष20है । Dictyostelium का उपयोग इन समस्याओं से बचा जाता है; हालांकि, Dictyostelium द्वारा द्रव को मापने के लिए मौजूदा तकनीक अपेक्षाकृत गहन श्रम कर रहे हैं, दोनों कोशिकाओं और21dextran की एक बड़ी राशि का उपयोग कर । कोशिकाओं फ्लोरोसेंट dextran और विभिंन समय पर हटा नमूनों में उच्च घनत्व पर हिल रहे है एक fluorimeter का उपयोग कर आंतरिक प्रतिदीप्ति के निर्धारण के लिए अंक । इस तरह से तैयार कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है के लिए एक सेल लाभ, बजाय जनसंख्या स्तर, संकल्प22, हालांकि इस कम प्रवाह रहता है ।
यहां, मानक एक लेबल के रूप में फ्लोरोसेंट dextran का उपयोग तरल पदार्थ को मापने के लिए तकनीक एक ९६-अच्छी प्लेट प्रारूप के लिए अनुकूलित है, नमूने के साथ प्रवाह cytometry एक उच्च प्रवाह नमूना (HTS) लगाव का उपयोग करके विश्लेषण किया । कोशिकाओं को एक पूर्व समय की लंबाई निर्धारित के लिए गैर अतृप्त फ्लोरोसेंट dextran खिलाया, बर्फ में विसर्जन से धोया-ठंड बफर और 5 मिमी सोडियम azide, जो भी exocytosis बंद हो जाता है का उपयोग कर अलग कर रहे हैं । प्रत्येक कुआं में कोशिकाओं को फिर प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । इस विधि से ऊपर के तरीकों की सीमाओं पर काबू पाने के लिए डिज़ाइन किया गया था और कम संसाधनों का उपयोग करते हुए और शामिल श्रम को कम करने, जबकि उपभेदों की बड़ी संख्या के द्रव का एक साथ तुलना की अनुमति/
जबकि अन्य विधियों का आकलन करने के लिए द्रव तेज कम प्रवाह कर रहे हैं, सीटू में कोशिकाओं को धुलाई और सोडियम azide का उपयोग कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस विधि में महत्वपूर्ण कदम हैं, जो macropinocytosis की उच्च प्रवाह माप की अनुमति देते हैं, झिल्ली तेज, या phagocytosis ने Dictyostelium. के रूप में कोशिकाओं को एक सतह से जुड़े रहे है और मध्यम नहीं है, वे संलग्न किया जा सकता है जबकि उनके चारों ओर पहले से फेंक दिया है और फिर बफर में विसर्जन से बदल गया है और फिर से फेंका । सोडियम azide, जो सेलुलर एटीपी घट और झिल्ली30ध्रुवीकरण, तो कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और भी सेल व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना exocytosis24रोकता है ।
जबकि प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए Dictyostelium द्वारा macropinocytosis को मापने के द्रव तेज बहुत जल्दी से एक बहुत ही सटीक माप देता है, कारण स्थापित करने के लिए एक विशेष तनाव या हालत द्रव तेज बदल गया है, आगे की जांच का उपयोग कर माइक्रोस्कोपी24आवश्यक है । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि पहले प्रकाशित परिणाम है, कुछ मामलों में, एक सतह पर या तो हो उत्परिवर्ती उपभेदों (जैसा कि इस मामले में), या मिलाते निलंबन (के रूप में मानक प्रोटोकॉल में)31में तरल पदार्थ में एक अंतर दिखाया । इस विधि का उपयोग कर सकते है मतलब है कि, दुर्लभ मामलों में, स्पष्ट द्रव के साथ ही दोष याद किया जाता है । phagocytosis को मापने के साथ ही, कणों की केवल कम सांद्रता इस्तेमाल किया जा सकता है । phagocytosis की अधिकतम दर है कि इस तकनीक के साथ निर्धारित किया जा सकता है अभी तक वास्तविक अधिकतम नीचे है, हालांकि यह अभी भी उपभेदों और24स्थितियों के बीच phagocytosis में प्रासंगिक मतभेदों को मापने के लिए संभव है । phagocytosis की अधिकतम दर निर्धारित करने के लिए, अधिक से अधिक एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल27द्वारा मिलाते निलंबन में मापा जाना चाहिए । कोशिकाओं है कि phagocytosed मोतियों की ओर तितर बितर हो गया है, तो यह तदनुसार के लिए सही किया जाना चाहिए जब तक प्रवाह cytometer की स्थापना ।
प्रवाह cytometry स्तनधारी कोशिकाओं३२में द्रव तेज उपाय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन Dictyostelium में देखा से अन्य endocytic रास्ते से द्रव चरण तेज के उच्च अनुपात एक चिंता का विषय है. इसके अलावा, कोशिकाओं को आम तौर पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर trypsin का उपयोग कर अलग कर रहे हैं, आंतरिक dextran के आगे endocytic प्रगति की अनुमति । बर्फ ठंडा सोडियम azide मैक्रोफेज एक सतह (विलियंस, अप्रकाशित अवलोकन) से अलग करने के लिए कारण नहीं है, इस तकनीक को आगे अनुकूलन के बिना स्तनधारी कोशिकाओं को लागू नहीं कर रही ।
macropinocytosis के उच्च प्रवाह माप क्षमता है करने के लिए स्क्रीन जल्दी और सस्ते में अवरोधकों के प्रभाव के लिए इस्तेमाल किया जा, आनुवंशिक उत्परिवर्तन या Dictyostelium कोशिकाओं पर जीन पछाड़ना । म्यूटेंट हमेशा अपने प्रत्यक्ष माता पिता की तुलना में होना चाहिए । यदि पाठक Dictyostelium तनाव, गैर के लिए कोई पूर्व वरीयता है ऐसे DdB या NC4 के रूप में axenic उपभेदों और अधिक कर रहे है “जंगली प्रकार” axenic वालों से और के रूप में प्रभावी ढंग से हेरफेर किया जा सकता है axenic उपभेदों३३के रूप में । अंयथा, Ax2 उपभेदों के साथ axenic उपभेदों रहे है कटेंगे जीनोम३४, जबकि Ax4 के कई उपभेदों टलीं एक नॉकआउट है और अगर संभव हो तो बचा जाना चाहिए23। सबसे पहले प्रकाशित उपभेदों Dicty शेयर केंद्र३५से आदेश दिया जा सकता है ।
इस तकनीक से अधिक से अधिक खोजी संभावनाओं की अनुमति देता है Dictyosteliumद्वारा macropinocytosis पर विभिंन स्थितियों, अवरोधकों और उत्परिवर्तनों के प्रभाव में पहले से संभव था ।
The authors have nothing to disclose.
हम RRK के लिए चिकित्सा अनुसंधान परिषद ब्रिटेन कोर वित्त पोषण (U105115237) के लिए धंयवाद ।
LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | – | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
Sodium azide | VWR | 103694M | |
Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
SM agar | Formedium | SMACFG | |
0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |