Summary
Macropinocytosis, grootschalige aspecifieke vloeibare opname, is belangrijk in veel gebieden van de klinische biologie met inbegrip van immunologie, infectie, kanker en neurodegeneratieve ziekten. Hier, zijn bestaande technieken aangepast om high-throughput, eencellige resolutie meting van macropinocytosis in het macropinocytosis model organisme Dictyostelium discoideum met stroom cytometry.
Abstract
Grootschalige aspecifieke vloeibare opname door macropinocytosis is belangrijk voor de verspreiding van bepaalde kankercellen, antigeen bemonstering, host cel invasie en de verspreiding van neurodegeneratieve ziekten. De meest gebruikte laboratorium-stammen van de amoebe Dictyostelium discoideum hebben extreem hoge vocht opname tarieven als volwassen in voedingsbodem, meer dan 90% daarvan te wijten aan macropinocytosis is. Daarnaast zijn veel van de bekende basisonderdelen van zoogdieren afkomstig macropinocytosis ook aanwezig, waardoor het een uitstekende modelsysteem voor het bestuderen van macropinocytosis. Hier, is de standaard techniek voor het meten van verinnerlijkte vloeistof met behulp van fluorescerende dextran als een label aangepast aan het formaat van een 96-wells-plaat, met de monsters geanalyseerd door cytometry van de stroom met behulp van een high-throughput bemonstering (HTS) bevestiging.
Cellen worden niet-quenchable fluorescerende dextran voor een vooraf bepaalde tijdsduur, gewassen door onderdompeling in ijskoude buffer en vrijstaand met behulp van natriumazide van 5 mM, die ook exocytose stopt gevoed. Cellen in elk putje worden vervolgens geanalyseerd door stroom cytometry. De methode kan ook worden aangepast voor het meten van de membraan opname- en fagocytose van fluorescerende kralen of bacteriën.
Deze methode werd ontworpen om meting van vloeibare opname door Dictyostelium in een high-throughput, arbeid en resource-efficiënt. Hierdoor wordt gelijktijdige vergelijking van meerdere stammen (bijvoorbeeld knockout mutanten van een gen) en voorwaarden (bijvoorbeeld cellen in verschillende media of behandeld met verschillende concentraties van remmer) parallel en tijdsverloop vereenvoudigt.
Introduction
Grootschalige aspecifieke vloeibare opname door macropinocytosis is belangrijk in verschillende biologische contexten1, met inbegrip van de bemonstering van het antigeen door immuun cellen2, pathogen indienststelling gastheer cellen3, kanker cel proliferatie4 en de verspreiding van prion ziekten5. In het zoogdier- en Dictyostelium cellen, actine6,7, PI (3,4,5) P3-8,-9,10 (hoewel de exacte aard van de lipide verschilt tussen de twee11), geactiveerd RAS12,13, en geactiveerde Rac14,15 zijn belangrijk voor efficiënte vloeibare opname door macropinocytosis, hoewel er nog veel onbeantwoorde vragen over de manier waarop de patch macropinocytic gevormd, georganiseerd en uiteindelijk verinnerlijkte. Ontdekken meer eiwitten belangrijk voor macropinocytosis, en de daaropvolgende bepaling van hoe ze belangrijk in de verschillende biologische contexten zijn, zal een uitgebreidere kennis van macropinocytosis en mogelijk maakt van de ontwikkeling van gerichte behandelingen voor een scala van omstandigheden.
Dictyostelium is een ideaal model voor het bestuderen van macropinocytosis. Het hoge niveau van constituerende macropinocytosis in standaard laboratorium stammen betekent dat vocht opname is meer dan 90% als gevolg van de macropinocytosis6. Hierdoor macropinocytosis meetoplossingen uitsluitend door het bepalen van de vloeibare opname, in tegenstelling tot cellen van zoogdieren, waar het aandeel van de vloeibare opname als gevolg van macropinocytosis veel lager is. Die macropinocytosis is zo goed omschreven en gemakkelijk gevisualiseerde12 in dit systeem ook biedt duidelijke voordelen voor het onderzoeken van core bewaarde onderdelen van de macropinosome over andere systemen waar kunnen er meerdere regelgevende signalen 16 , 17.
De standaard techniek die gebruikt wordt voor het meten van macropinocytosis door zoogdiercellen omvat vaststelling van cellen na de pulserende met dextran gedurende een korte tijd gevolgd door microscopie om te bepalen op het gebied van een cel die wordt bezet door dextran-positieve blaasjes18. Deze techniek houdt geen echter rekening met de mogelijkheid van macropinosomes bij binnenkomst van de cel, die is gemeld in Dictyostelium19, en alleen rekening gehouden met enkele vliegtuigen van de cel, wat betekent dat het volume geïnternaliseerd krimpen is onduidelijk. Een alternatieve techniek voor het tellen van het aantal macropinosomes geïnternaliseerd binnen een bepaalde tijd, heeft het dezelfde nadelen20. Met behulp van Dictyostelium vermijdt deze kwesties; bestaande technieken voor het meten van vocht opname door Dictyostelium zijn echter relatief arbeidsintensief, met behulp van een grote hoeveelheid cellen zowel dextran21. Cellen worden geschud bij hoge dichtheid in fluorescerende dextran en monsters op verschillende tijdstippen voor bepaling van de verinnerlijkte fluorescentie met behulp van een fluorimeter verwijderd. Cellen voorbereid op deze manier kunnen worden geanalyseerd door stroom cytometry te winnen van eencellige, in plaats van populatieniveau, resolutie22, hoewel dit laag-doorvoer blijft.
Hier, is de standaard techniek voor het meten van verinnerlijkte vloeistof met behulp van fluorescerende dextran als een label aangepast aan het formaat van een 96-wells-plaat, met de monsters geanalyseerd door cytometry van de stroom met behulp van een high-throughput bemonstering (HTS) bevestiging. Cellen worden niet-quenchable fluorescerende dextran voor een vooraf bepaalde tijdsduur, gewassen door onderdompeling in ijskoude buffer en vrijstaand met behulp van natriumazide van 5 mM, die ook exocytose stopt gevoed. Cellen in elk putje worden vervolgens geanalyseerd door stroom cytometry. Deze methode werd ontworpen om de beperkingen van de bovenstaande methoden en gelijktijdige vergelijking van de vloeibare opname van grote aantallen stammen/voorwaarden toestaan terwijl minder bronnen gebruikt en vermindering van de arbeid betrokken.
Protocol
1. bereiding van de cellen en materialen
- Cultiveren cellen hetzij op SM agar platen in combinatie met bacteriën zoals Klebsiella aerogenesof in voedingsbodem zoals HL5 beschreven23.
Opmerking: Knock-out mutanten die gebreken in macropinocytosis op bacteriën vertonen groeien accumulatie van secundaire mutaties die de snelheid van de macropinocytosis verhogen kan voorkomt. Houd het nummer van de passage onder de 4 na plating cellen uit voorraden voor optimale resultaten. Mutanten moeten worden opgeslagen als bevroren voorraden zo spoedig mogelijk na isolatie. - Groeien naar cultivate cellen op SM agar platen, K. aerogenes tot samenkomst in SM medium. Toevoegen van 200-300 μL van de bacteriën op een bord van de agar SM en verspreid. Neem een steriel lus van cellen (bij het overbrengen van een andere bacteriële plaat) en verspreid op een van de randen van de plaat. Incubeer bij 22 ° C gedurende maximaal een week.
- Los van de Tetra-methyl-rhodamine isothiocyanaat (TRITC-) dextran tot 50 mg/mL in water, filteren met behulp van 0,22 μm filters in 1 mL aliquots en opslaan bij-20 ° C. Aliquots kunnen voor onbepaalde tijd bewaard worden.
Opmerking: 155 kDa is de typische grootte gebruikt met deze methode als het goedkoop kan worden gekocht in bulk, maar kleinere dextrans macropinocytosis even effectief in Dictyostelium24 meten. Verschillende niet-quenchable dextrans, zoals trapsgewijze blauw of Alexa-647, zijn alternatieven als verschillende fluorophores vereist zijn.
2. converteren kwalitatieve metingen in kwantitatieve (optioneel)
-
Het uitvoeren van een test van de vloeibare opname cuvetten in suspensie.
- Pellet axenically groeiende cellen bij 300 x g gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer in voedingsbodem aan 1 x 107 cellen/mL. TRITC-dextran toevoegen aan 0,5 mg/mL en schudden bij 180 rpm, 22 ° C.
- Verdun 0.8 mL monsters in 0,7 mL ijskoud KK2 op 0, 30, 60, 90, 120 min. Wash eenmaal in 1,5 mL ijskoud KK2 buffer23 in een benchtop centrifuge, resuspendeer tot 1 mL in de dezelfde buffer en opgeslagen op ijs.
Opmerking: wassen onmiddellijk of zodra alle monsters zijn verzameld gelijkwaardige resultaten oplevert.
-
Het bepalen van de hoeveelheid vloeistof geëigd maken door de cellen.
- Instellen van de fluorimeter voor het meten van de fluorescentie met een golflengte van de excitatie van 544 nm en emissie golflengte van 574 nm met een 10 nm gleuf. Instellen van een verdunningsreeks van TRITC-dextran en gebruiken voor het meten van de fluorescentie voor gegeven hoeveelheid dextran. Maak een ijklijn.
- Het meten van de fluorescentie geëigd maken door de cellen in de sectie 2.1 met behulp van 0,9 mL van de celsuspensie. Bereken het volume van de vloeistof per cel met behulp van de kalibratie kromme24geïnternaliseerd.
- Verdun de rest van de cellen vanaf elk punt van de tijd apart in 0,5 mL ijs koud KK2. Filtreer door een 70 µm cel zeef in 5 mL polystyreen stroom cytometry buizen. De stroom cytometer zo ingesteld dat cellen van elk punt van de tijd staan los van elkaar en hun fluorescentie opnemen (zie paragrafen 3.4 en 3.5).
- Meten van de fluorescentie van kalibratie parels in de cytometer van de stroom met behulp van de bovenstaande instellingen en opnemen.
Opmerking: Dit is de referentie voor alle toekomstige fluorescentie metingen op de stroom cytometer: voordat u opnieuw uitvoeren de kralen en pas de instellingen dus ze de dezelfde fluorescentie hebben. Dit geeft een zeer smalle gedefinieerde piek. Zetten een hek rond de fluorescentie piek kan dit gemakkelijker maken. - Herhaal dit drie keer en uitzetten van de celgegevens fluorescentie verkregen in de punten 2.2 en 2.3 tegen elkaar. Een lijn van de beste pasvorm en de vergelijking aan de kwalitatieve gegevens uit de stroom cytometry converteren in kwantitatieve eenheden gebruiken.
3. meting van de vloeibare opname
Figuur 1: schematische van high-throughput meting van macropinocytosis. (A) Grow Dictyostelium op een SM-plaat bezaaid met K. aerogenes bacteriën (geel). Oogsten van cellen uit de voeding voorkant (oranje), het vermijden van cellen die zijn al ontwikkeld (groen), in 25 mL van KK2 buffer. Vortex te distantiëren, pellet door 3 min centrifugeren op 300 x g, dan 3 keer in 50 mL KK2 buffer, teruggooi het supernatant telkens wassen. Resuspendeer tot 1 x 105 cellen/mL in HL5 groeimedium en voeg 50 µL in drie putten per monster van een vlakke onderkant 96-wells-plaat. Incubeer bij 22 ° C gedurende 24 h. (B) verdund TRITC-dextran tot 1 mg/mL in HL5 groeimedium van een stamoplossing van 50 mg/mL. 50 µL toevoegen aan elk monster (met uitzondering van de opname-controleputjes 0 min) en Incubeer bij 22 ° C gedurende 1 h, na die de dextran aan het besturingselement van de opname 0 min toevoegt. (C) onmiddellijk decanteren in de media, pat de plaat op een weefsel te verwijderen overtollige medium en onderdompelen in een bad met ijskoud KK2 buffer, vullen de putten te wassen. Decanteren in de buffer en dep droog weer. Voeg 100 µL van 5 mM natriumazide opgelost in KK2MC loskoppelen van de cellen. Neem cytometer voor meting van verinnerlijkte fluorescentie stromen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
-
Instellen van een platbodem 96-Wells-weefselkweek plaat (figuur 1A). Gebruik van cellen die zijn geteeld op bacteriën en ze vervolgens overbrengen naar HL5 medium (met 100 µg/mL Dihydrostreptomycine, 100 µg/mL ampicilline en 50 µg Mo/mL kanamycine) 24 h vóór de bepaling; Hierdoor macropinocytosis als upregulated van de lage niveaus die in cellen die zijn geteeld op bacteriën24gezien. Als alternatief, Verdun cellen rechtstreeks uit een cultuur, incubatie gedurende 24 uur vóór de bepaling, om fouten ten gevolge van de cellen worden verdund uit verschillende dichtheden.
- Oogsten van cellen uit de voeding voorzijde in 25 mL voor KK,2 in een centrifugebuis 50 mL. Distantiëren van cellen door vortexing en pellet bij 300 x g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet 3 keer wassen bij 300 x g gedurende 3 min in 50 mL van KK2, teruggooi het supernatant telkens te verwijderen de bacteriën.
- Bepalen van de celdichtheid (met behulp van een hemacytometer of andere cel tellen systeem) en Verdun in HL5 met antibiotica aan 1 x 105 cellen/mL. Pipeteer 50 μl in elk putje, met behulp van drie putten voor elke voorwaarde. Incubeer bij 22 ° C gedurende 24 h. Vergeet niet om het instellen van een besturingselement 0 min opname.
Opmerking: Een alternatieve middel, bijvoorbeeld SIH, VL6 in plaats daarvan kunnen worden gebruikt.
-
Laden cellen met TRITC-dextran (figuur 1B).
- Verdun de dextran tot 1 mg/mL in het medium gebruikt (dit kan worden verhoogd tot 2,5-5 mg/mL bij de beoordeling van de cellen met zeer lage opname). Voeg 50 l aan elk putje (het geven van een eindconcentratie van 0,5 mg/mL TRITC-dextran) en de plaat terug naar 22 ° C gedurende 1 uur, maar hierdoor aanzienlijk dextran accumulatie exocytose van dextran is nog niet begonnen.
Opmerking: een repeater pipet kunt deze stap gebeuren sneller, vermindering van de fout.
- Verdun de dextran tot 1 mg/mL in het medium gebruikt (dit kan worden verhoogd tot 2,5-5 mg/mL bij de beoordeling van de cellen met zeer lage opname). Voeg 50 l aan elk putje (het geven van een eindconcentratie van 0,5 mg/mL TRITC-dextran) en de plaat terug naar 22 ° C gedurende 1 uur, maar hierdoor aanzienlijk dextran accumulatie exocytose van dextran is nog niet begonnen.
-
Cellen voorbereiden op stroom cytometry (Figuur 1 c).
- Onmiddellijk voorafgaand aan het wassen, 50 μl dextran-bevattende media de 0 min opname besturingselementen toevoegen.
- Decanteren van het medium en dep droog op een weefsel. Was door het onderdompelen van de plaat in ijskoude KK2, dan bovenstaande.
Opmerking: sommige spanningen met naleving van de gebreken kunnen worden losgekoppeld tijdens deze stap, bijvoorbeeld een knock-out van beide homologen van Talin (talA-/ talB -)25. Wees voorzichtig bij het werken met cellijnen die slecht hechten en gecombineerd media indien nodig. - Voeg 100 μl van ijskoude 5 mM natriumazide opgelost in KK2MC (KK2 + 2 mM MgSO4 en 100 μM CaCl2).
Let op: Natriumazide is uiterst giftig. Gebruik een stofmasker en veiligheidsbril wanneer u werkt met het poeder. Draag altijd handschoenen en laboratoriumjas. Vermijd warmte en niet vermengen met zuren.
Opmerking: Cellen snel loskoppelen en exocytose is verhinderd24. Een microscoop kan worden gebruikt om dit te controleren.
-
De vloeibare opname van de maatregel door stroom cytometry
- Als plan relatieve om waarden te converteren naar absolute ones, gebruiken kralen op de standaardisering van de stroom cytometer instellingen (zie hoofdstuk 2). U kunt ook gebruik cellen geladen met dextran zoals in sectie 2 om ervoor te zorgen dat de voorwaartse scatter en kant scatter juist zijn ingesteld om te isoleren van de cellen (figuur 2A), zorgen voor dat de machine niet wordt geblokkeerd, (figuur 2B) en aanpassen van de parameters voor meet de verinnerlijkte fluorescentie (figuur 2C).
- High-throughput monsternemingssysteem hechten en plaat toe te voegen. Een protocol instellen voor het meten van de fluorescentie (voor TRITC-dextran gebruiken een geel-groene laser te prikkelen en te meten in het 582 nm-kanaal of gelijkaardig) van maximaal 65 μL van de celsuspensie en uitvoeren.
-
Stroom cytometry resultaten analyseren
- Poort op de cellen met behulp van voorwaartse scatter en kant scatter (figuur 2A). Bereken de mediaan fluorescentie van de cellen met de statistieken-optie. Deze parameters met behulp van één monster instellen en toepassen op alle monsters.
Opmerking: De voorwaartse scatter/scatter zijprofielen kunnen variëren tussen de monsters bij het gebruik van verschillende mutanten of remmers. - Bepalen van het gemiddelde van de drie putten voor elke voorwaarde en aftrekken van de controle van de opname 0 min. Ofwel converteren naar kwantitatieve waarden met behulp van de vergelijking bepaald in punt 2 of normaliseren naar het besturingselement.
- Poort op de cellen met behulp van voorwaartse scatter en kant scatter (figuur 2A). Bereken de mediaan fluorescentie van de cellen met de statistieken-optie. Deze parameters met behulp van één monster instellen en toepassen op alle monsters.
4. uitvoeren van de vloeibare opname tijd-cursussen
- Cellen zoals in deel 3, met drie putten voor elk tijdstip en stam/voorwaarde instellen.
- Voeg sequentieel dextran gelabelde medium toe aan de verschillende putjes. Een typische tijd-cursus meet vocht opname op 0, 30, 60, 90, 120 en 180 min. Voeg dextran-bevattende medium voor de 180 min tijd punt putten, 60 min later gevolgd door het toe te voegen aan de putjes voor de 120 min tijd punt, etc. (figuur 3A).
- Voeg 50 l dextran-bevattende op 0 min, medium en onmiddellijk decanteren en wassen van de plaat zoals in punt 3.3. Analyseren zoals beschreven in paragraaf 3.5.
5. dosis-respons-curven
- Cellen instellen zoals beschreven in sectie 3, met drie putten voor elke stam en de voorwaarde.
- Verdun de compound van belang in medium met 1 mg/mL dextran bij dubbel de gewenste maximale uiteindelijke concentratie van de stof. Bereid een tweede buis met medium met dextran met hetzelfde aandeel van het voertuig als de eerste. Vortex te mengen.
- Het maken van een verdunningsreeks van de compound van belang in 200 μl dextran met medium per monster (figuur 4A). Vortex te mengen. Voeg 50 μl van het medium aan elk monster goed voor 1 h.
- Wassen en analyseren zoals beschreven in sectie 3.3 vanaf.
6. fagocytose en membraan opname
- Voorbereiden om te meten membraan opname, de cellen zoals beschreven in sectie 3. Voeg 50 l medium met 20 μM FM 1-43 voor een eindconcentratie van 10 μM. Na het laden, wassen en bereiden van cellen voor stroom cytometry zoals in punt 3.3. Meten in de 585 nm-kanaal of soortgelijke, met behulp van een blauwe laser te prikkelen.
Opmerking: Als membraan mensenhandel sneller dan vloeistof-fase is, 10 min is een passender tijdstip te gebruiken dan 1 h26. Alternatieve kleurstoffen die fluoresceren alleen wanneer opgenomen in het membraan kunnen in plaats daarvan worden gebruikt. -
Fluorescently geëtiketteerde kralen of bacteriën gebruiken voor het meten van fagocytose. Fluorescerende gist kan niet worden gebruikt, zoals ze onlosmakelijk verbonden met Dictyostelium door naar voren zijn en kant scatter24. Cellen instellen zoals beschreven in punt 3 en analyseren als beschreven27.
- Voor het meten van fagocytose van kralen geel-groen geëtiketteerd zoals beschreven in sectie 3.2 een eindconcentratie van 5 x 107 kralen/mL (1,75 en 2 μm) of 1 x 108 kralen/mL (1 en 1,5 μm) voor 1 h voor wassen en voorbereiden van stroom cytometry zoals in de parels toevoegen punt 3.3. Meten in het 525 nm-kanaal of soortgelijke, met behulp van een blauwe laser te prikkelen.
Opmerking: Hogere concentraties zal leiden tot mobiele-detachement. - Toevoegen voor het meten van fagocytose van bacteriën, dat Texas-rood geëtiketteerd Escherichia coli bioparticles zoals beschreven in sectie 3.2 tot 1 x 108 bacteriën/mL voor 1 h voor wassen en voorbereiden van stroom cytometry zoals in punt 3.3. Meten in de 610 nm-kanaal of soortgelijke, met behulp van een geel-groene laser te prikkelen.
- Voor het meten van fagocytose van kralen geel-groen geëtiketteerd zoals beschreven in sectie 3.2 een eindconcentratie van 5 x 107 kralen/mL (1,75 en 2 μm) of 1 x 108 kralen/mL (1 en 1,5 μm) voor 1 h voor wassen en voorbereiden van stroom cytometry zoals in de parels toevoegen punt 3.3. Meten in het 525 nm-kanaal of soortgelijke, met behulp van een blauwe laser te prikkelen.
Representative Results
Zodra de techniek heeft verricht en cellen geladen met dextran en klaar voor analyse (Figuur 1 worden), zorgen voor dat de cytometer van de stroom niet wordt geblokkeerd en de voorwaartse scatter/kant scatter-profiel te laten uitzien als de cellen weergegeven in figuur 2Aaanpassen. Als de machine is geblokkeerd, het ziet er meer dergelijks getoond in figuur 2B en moet worden opgeheven voordat u verdergaat. Zorgen de parameters besturingselement weergeven een cellen hebben hoge verinnerlijkte dextran fluorescentie bij langere tijd punten en lage verinnerlijkte fluorescentie bij kortere audiobestanden splitsen (figuur 2C).
Bij het zoeken naar verschillen tussen mutanten, is het waarschijnlijk dat er één van drie fenotypes zijn zal. De mutanten hadden normale vloeistof opname, konden zij een gedeeltelijke defect hebben of vloeibare opname kan worden afgeschaft. Figuur 2D toont een stam met normale vloeistof opname, in dit geval de standaard laboratorium stam Ax2, een mutant met een ~ 50% afname van vocht opname (Ax2 rasG-14) en een met vloeistof opname (Ax3 gefB-28) afgeschaft. De gemiddelde mediaan vloeibare opname (afdeling 3.5) verkrijgen en gebruiken voor het berekenen van de hoeveelheid vloeistof geïnternaliseerd (zoals in figuur 3B) of de gegevens vergelijken met een besturingselement (zoals in figuur 4B en 4 C).
Bij het uitvoeren van een vlotte opname tijd cursus, zoals in figuur 3A, de verinnerlijkte fluorescentie moet verhogen voor 60-90 min, waarna de Dextraan begint te worden exocytosed en een plateau is bereikt (figuur 3B). 60 min als gebruikt de standaardtijd-punt macropinocytosis in andere mutanten/voorwaarden daarom kunt een goed signaal te bereiken, en geen signaal is verloren als gevolg van exocytose. Mutanten waar exocytose ernstig wordt belemmerd kunnen langer duren voordat bereiken een plateau29.
Wanneer behandelen van cellen met remmers die effectief is tegen macropinocytosis in Dictyostelium (instellen zoals in figuur 4A), zijn de dextran geïnternaliseerd in 1 h gaat omlaag naar bijna niets bij hogere concentraties van de Inhibitor van de omwenteling in de meeste gevallen (Figuur 4B). Sommige remmers kunnen niet 100% effectief, echter bijv nocodazole remt alleen tot 50% van de vloeibare opname door macropinocytosis wanneer acuut toegevoegd (figuur 4C). Als de remmers niet doeltreffend zijn, de cellen zal het internaliseren van een soortgelijke hoeveelheid dextran als het besturingselement en een afname van de fluorescentie krijgt niet te zien. Deze techniek kan een groot aantal verschillende remmers en remmer concentraties worden onderzocht voor de effecten op de vloeibare opname door macropinocytosis zeer snel, verminderen van de tijd bezig geweest met het optimaliseren van de behandeling van de Inhibitor van de omwenteling.
Figuur 2: instellen van gegevens voor het cytometer en vertegenwoordiger van stroom. (A) de voorwaartse scatter (FSC) en zijprofielen scatter (WS) van cellen moeten worden ingesteld zodat de cellen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden. Een voorbeeld van hoe Ax2 cellen zou moeten kijken wordt weergegeven. (B) als de cytometer van de stroom is geblokkeerd, zoals in dit voorbeeld, de cellen hebben zeer lage kant scatter. De laser zal niet prikkelen de fluorophores goed en de machine moet worden opgeheven voordat u verdergaat. Eventuele gegevens die zijn verkregen, terwijl de machine was geblokkeerd moet worden weggegooid. (C) de fluorescentie moet worden ingesteld zodat een 0 min opname monster lage fluorescentie, die toeneemt heeft wanneer cellen hebben zijn uncubeerd langer in het fluorescerende medium, zoals in dit voorbeeld uit Williams & Kay 201824. (D) voorbeelden van cellen die zijn zijn geïncubeerd met TRITC dextran voor 1 h met normale macropinocytosis (Ax2, groen), verminderd macropinocytosis (Ax2 rasG -, HM172614, oranje) en macropinocytosis (Ax3 gefB -, afgeschaft HM177628, blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: uitvoeren van vloeibare opname-tijdsverloop in 96-wells-platen. (A) Dextran moet worden toegevoegd aan elke set van monsters opeenvolgend, met de dezelfde eindtijd. Vervolgens was de putjes, los en meet de verinnerlijkte fluorescentie door stroom cytometry. Voorbeeld keer toe te voegen de dextran worden hier getoond. (B) vocht opname-tijdsverloop van Ax2 cellen uitgevoerd in 96-wells-platen. Ontleend aan Williams & Kay 201824, Toon foutbalken de standaardfout van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vloeibare opname dosis respons-curven. (A) de compound van belang, in dit geval de PI3K remmer LY294002, te HL5 met 1 mg/mL TRITC-dextran op dubbele de gewenste uiteindelijke maximale concentratie toevoegen. Meng met HL5 groeimedium + 1 mg/mL dextran met voertuig alleen in verschillende verhoudingen voor het genereren van een verdunningsreeks van 200 µL medium per voorwaarde. Voeg toe aan wells als normale gedurende 1 uur vóór het wassen en het meten van verinnerlijkte fluorescentie. (B) vocht opname dosis-responscurve voor Ax2 cellen geïncubeerd met het LY294002-bevattende medium van A. Aangepast van Williams & Kay 201824. Vloeibare opname is genormaliseerd naar een onbehandeld controlegewas. Foutbalken geven de standaardfout van drie onafhankelijke experimenten. (C) vocht opname dosis-responscurve voor Ax2 cellen geïncubeerd met de nocodazole. Aangepast van Williams & Kay 201824. Vloeibare opname is genormaliseerd naar een onbehandeld controlegewas. Foutbalken geven de standaardfout van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Overwegende dat andere methoden voor het beoordelen van de vloeibare opname lage doorvoersnelheid, wassen van de cellen in situ en het gebruik van natriumazide loskoppelen van cellen zijn de kritische stappen in deze methode, waarmee high-throughput meting van macropinocytosis, membraan opname, of fagocytose door Dictyostelium. Als de cellen zijn gekoppeld aan een oppervlak en het medium niet is, kunnen ze worden links aangesloten terwijl het medium om hen heen is eerst afgeworpen en vervolgens gewijzigd door onderdompeling in de buffer en weer afgeworpen. Natriumazide, die put cellulaire ATP en depolarizes van de membraan30, wordt vervolgens gebruikt om de cellen los te maken en ook voorkomt exocytose zonder cel levensvatbaarheid24.
Terwijl met behulp van cytometry van de stroom te meten macropinocytosis door Dictyostelium een zeer nauwkeurige meting van de vloeibare opname zeer snel, geeft om de reden waarom een bepaalde spanning of aandoening vloeibare opname, veranderd verder onderzoek met behulp microscopie is vereist24. Ook opgemerkt moet worden dat eerder gepubliceerde resultaten, in sommige gevallen is gebleken een verschil in vloeibare opname door gemuteerde stammen gegroeid op een oppervlak (zoals in dit geval), of in het schudden van schorsing (zoals in het standaard protocol)31. Met deze methode kan betekenen dat in zeldzame gevallen blijkt vloeibare opname gebreken worden gemist. Daarnaast, bij het meten van fagocytose, kunnen alleen lage concentraties van deeltjes worden gebruikt. Het maximumpercentage van fagocytose die kan worden bepaald met deze techniek ligt ver onder het echte maximum, hoewel het nog steeds mogelijk is te meten van relevante verschillen in fagocytose tussen stammen en voorwaarden24. Om te bepalen van het maximumpercentage van fagocytose, worden opname gemeten in het schudden van de schorsing door een alternatieve protocol27. Cellen die zijn phagocytosed kralen toegenomen kant scatter, dus dit moet worden gecorrigeerd voor dienovereenkomstig bij het opzetten van de cytometer van de stroom.
Stroom cytometry kan worden gebruikt voor het meten van vocht opname in zoogdiercellen32, echter het hogere percentage van vloeistof fase opname door andere endocytotische trajecten dan gezien in Dictyostelium is een bron van zorg. Daarnaast zijn cellen meestal vrijstaand met behulp van trypsine bij 37 ° C, waardoor verdere endocytotische progressie van verinnerlijkte dextran. Ijskoude natriumazide veroorzaakt geen macrofagen loskoppelen van een oppervlak (Williams, ongepubliceerde waarneming), maken van deze techniek niet van toepassing op zoogdiercellen zonder verdere optimalisatie.
Hoge-doorvoer meting van macropinocytosis heeft het potentieel om te worden gebruikt om het scherm snel en goedkoop voor de effecten van Remmers, genetische mutatie of gene knockdown op Dictyostelium cellen. Mutanten moeten altijd worden vergeleken met hun direct bovenliggende alleen. Als de lezer geen voorafgaande voorkeur voor Dictyostelium stam heeft, niet-een stammen zoals DdB of NC4 meer "wild-type" dan een en net zo effectief als een stammen33kunnen worden gemanipuleerd. Anders, Ax2 stammen zijn de Axenische stammen met de minste genoom duplicaties34, terwijl vele spanningen van Ax4 Talin A uitsparingen en moeten worden vermeden indien mogelijk23. Meest eerder gepubliceerde stammen kunnen besteld worden vanaf de Dicty voorraad Center35.
Deze techniek maakt het mogelijk meer investigative mogelijkheden dan voorheen mogelijk naar de effecten van verschillende omstandigheden, remmers en mutaties op macropinocytosis door Dictyosteliumwas.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Wij danken de Medical Research Council, UK voor core RRK financiering (U105115237).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | - | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
| TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
| HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
| Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
| Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
| Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Sodium azide | VWR | 103694M | |
| Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
| Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
| Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
| Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
| Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
| FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
| Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
| Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
| SM agar | Formedium | SMACFG | |
| 0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
| Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
| 5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |
References
- Bloomfield, G., Kay, R. R.
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).
- Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell. 93 (5), 815-826 (1998).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).
- Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).
- Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells. European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).
- Buczynski, G., et al. Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization. Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).
- Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).
- Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells. Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).
- Clark, J., et al. Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling. The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).
- Hoeller, O., et al. Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis. Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).
- Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. Elife. 5, e20085 (2016).
- West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation. Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium. Traffic. 3, 791-800 (2002).
- Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
- Rivero, F., Maniak, M. Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway. Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).
- Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis. Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).
- Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment. Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).
- Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
- Tsujioka, M., et al. Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium. Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).
- Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S.
- Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation. Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).
- Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development. Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).
- Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin. Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).
- van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential. Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).
- Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis. Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).
- Mercer, J., Helenius, A. Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells. Science. 320 (5875), 531-535 (2008).
- Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).
- Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).
- Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012. Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).
