Summary
Макропиноцитозом, крупномасштабные неспецифической жидкости поглощения, имеет важное значение во многих областях клинической биологии, включая иммунологии, инфекции, рак и нейродегенеративных заболеваний. Здесь существующие методы были адаптированы к позволить высокой пропускной способностью, одноклеточных резолюции, измерение макропиноцитозом в макропиноцитозом модели организма сапротрофные discoideum с помощью проточная цитометрия.
Abstract
Крупномасштабные неспецифической жидкости поглощения макропиноцитозом имеет важное значение для распространения некоторых раковых клеток, антиген выборки, принимающей ячейки вторжения и распространение нейродегенеративных заболеваний. Часто используемые лабораторные штаммы амеба сапротрофные discoideum имеют чрезвычайно высокого поглощения жидкости при выращивании в питательной среде, свыше 90% из которых из-за макропиноцитозом. Кроме того многие из известных основные компоненты млекопитающих макропиноцитозом присутствуют также, что делает его отличным модель системы для изучения макропиноцитозом. Здесь стандартный способ измерить внутреннюю жидкости с использованием флуоресцентных декстрана как метка приспособлен к формат 96-луночных пластины, с образцами анализируемой проточной цитометрии с помощью вложения высок объём выборки (HTS).
Клетки кормят не Подавляемое флуоресцентные декстрана определённое количество времени, промывают погружением в ледяной буфера и отдельно с помощью азид натрия 5 мм, который также останавливается экзоцитоз. Ячейки в каждом хорошо затем анализируются проточной цитометрии. Этот метод также может быть адаптирована для измерения поглощения мембраны и фагоцитоз флуоресцентные бусы или бактерий.
Этот метод был разработан сапротрофные в высокой пропускной способности, труда и ресурсов эффективно разрешить Измерение поглощения жидкости. Это позволяет одновременное сравнение нескольких штаммов (например мутантов Нокаут гена) и условий (например , клеток в различных средствах массовой информации или лечение с различной концентрации ингибитора) параллельно и упрощает время курсы.
Introduction
Крупномасштабные неспецифической жидкости поглощения макропиноцитозом имеет важное значение в несколько биологических контексты1, включая антигена выборки по иммунной клетки2телефоны, возбудитель вступления в принимающей ячейки3, рак распространения4 и распространение заболеваний прионных5. В млекопитающих и сапротрофные клетки, актина6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (хотя точный характер липидов отличается между двумя11), активированные РАН12,13и14,активированного Rac15 имеют важное значение для эффективного поглощения жидкости на макропиноцитозом, хотя там остаются без ответа многие вопросы о том, как патч macropinocytic сформирован, организованной и в конечном итоге внутреннюю. Открывая больше белков важно для макропиноцитозом и последующего определения как они имеют важное значение в контексте различных биологических, даст более полное представление о макропиноцитозом и потенциально позволяют развитие целенаправленных процедур для ряда условий.
Сапротрофные является система идеальная модель для изучения макропиноцитозом. Высокий уровень учредительного макропиноцитозом в стандартные лабораторные штаммы означает, что что жидкости поглощение составляет более 90% из-за макропиноцитозом6. Это позволяет макропиноцитозом измеряться исключительно путем определения поглощения жидкости, в отличие от mammalian клеток, где доля поглощения жидкости из-за макропиноцитозом намного ниже. Макропиноцитозом настолько хорошо определены и легко визуализировать12 в этой системе также предлагает преимущества для изучения основных сохраненных компонентов macropinosome над другими системами где там может быть несколько регулирования сигналов 16 , 17.
Стандартная техника, используемая для измерения макропиноцитозом mammalian клеток предполагает фиксации клетки после пульсирует с декстрана для короткого периода времени, следуют микроскопии для определения области ячейки, которая занята декстран позитивных везикулы18. Этот метод однако не учитывают возможность усадки при вхождении в ячейку, в которой было сообщено в сапротрофные19и учитывает только одной плоскости клетки, означает объем внутреннюю macropinosomes остается неясным. Альтернативный метод подсчета числа macropinosomes, учитываются в данный момент, имеет же недостатки20. С помощью сапротрофные избегает этих проблем; Однако существующие методы измерения жидкости поглощение сапротрофные являются сравнительно трудоемкими, используя большое количество клеток и декстрана21. Клетки сотрясаны на высокой плотности в образцах, удалены в различные моменты времени для определения интернализированных флуоресценции, используя fluorimeter и флуоресцентные декстрана. Подготовленные таким образом клетки могут быть проанализированы подачей cytometry получить одну ячейку, а не уровня населения, резолюция22, хотя это остается низким-пропускная способность.
Здесь стандартный способ измерить внутреннюю жидкости с использованием флуоресцентных декстрана как метка приспособлен к формат 96-луночных пластины, с образцами анализируемой проточной цитометрии с помощью вложения высок объём выборки (HTS). Клетки кормят не Подавляемое флуоресцентные декстрана определённое количество времени, промывают погружением в ледяной буфера и отдельно с помощью азид натрия 5 мм, который также останавливается экзоцитоз. Ячейки в каждом хорошо затем анализируются проточной цитометрии. Этот метод был разработан для преодоления ограничения вышеупомянутых методов и позволяют одновременное сравнение жидкости поглощения большого количества штаммов/условия при использовании меньше ресурсов и сокращение труда участвующих.
Protocol
1. Подготовка клеток и материалов
- Культивируйте клетки либо на плиты агара SM в сочетании с бактерий, таких как нейтрофилов исследовании, или в питательной среде например HL5 как описано23.
Примечание: Рост нокаут мутантов, которые дефектных в макропиноцитозом на бактерии помогает предотвратить накопление вторичных мутации, которые могут увеличить скорость макропиноцитозом. Сохраните номер прохода ниже 4 после покрытия клетки от запасов для достижения оптимальных результатов. Мутанты должны храниться как замороженные запасы как можно скорее после изоляции. - Чтобы культивировать клетки на плитах агара SM, растут K. исследовании до впадения в среде см. Добавить 200 – 300 мкл бактерий на пластину агар SM и распространения. Взять стерильный цикла клетки (при передаче от другой бактериальной пластины) и распространилась на одном из краев плиты. Инкубируйте при 22 ° C до недели.
- Распустить декстрана тетра метил родамин Изотиоцианаты (TRITC-) до 50 мг/мл в воде, фильтрация с помощью фильтров 0,22 мкм в 1 мл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C. Аликвоты может сохраняться бесконечно.
Примечание: 155 кДа-типичный размер, используемый с этим методом, как это можно дешево купить навалом, но меньше декстраны измерить макропиноцитозом так же эффективно в сапротрофные24. Различные номера Подавляемое декстраны, например синий Каскад или Alexa-647, являются альтернативами, если требуются различные флуорофоров.
2. Преобразование качественных измерений в количественную (опционально)
-
Выполните Пробирной жидкости поглощения, с использованием клеток в суспензии.
- Пелле axenically растущих клеток на 300 x g на 3 мин, удалить супернатант и Ресуспензируйте в питательной среде до 1 x 10-7 кл/мл. Добавить TRITC-декстран 0.5 мг/мл и погрозит 180 об/мин, 22 ° C.
- Разбавьте 0,8 мл образцов в 0,7 мл ледяной КК2 на 0, 30, 60, 90, 120 мин мыть раз в 1,5 мл ледяной КК2 буфера23 в настольная центрифуга, Ресуспензируйте по 1 мл в тот же буфер и хранить на льду.
Примечание: стирки сразу же или после того, как были собраны все образцы дает эквивалентные результаты.
-
Определите объем жидкости внутреннюю клетками.
- Установка fluorimeter для измерения флуоресценции, с помощью волны возбуждения 544 Нм и выбросов волны 574 Нм с разрезом 10 Нм. Настройка разрежения серии TRITC-декстран и использовать его для измерения флуоресценции для данного тома декстрана. Создайте калибровочной кривой.
- Измерьте внутреннюю клетками в разделе 2.1, используя 0,9 мл суспензии клеток флуоресцентным. Рассчитайте объем жидкости, внедрено в клетку с помощью калибровочной кривой24.
- Развести на оставшуюся часть клеток от каждой точки время отдельно в 0,5 мл лед холодной КК2. Фильтр через стрейнер ячейки 70 мкм в 5 мл полистирола расходомерных трубок цитометрии. Установите проточный цитометр, так что клетки от каждой точки время отличаются друг от друга и записывать их флюоресценция (см. разделы 3.4 и 3.5).
- Измерения флуоресценции калибровки бусины в проточный цитометр, используя приведенные выше параметры и запишите его.
Примечание: Это ссылка для всех будущих флуоресценции измерений на проточный цитометр: перед использованием снова запустить бисер и настройте параметры, так что они имеют же флуоресценции. Это даст очень узкий определенных пик. Поставив ворот вокруг пика флуоресценции может сделать это проще. - Повторить три раза и печать данных флуоресценции клеток, полученных в разделах 2.2 и 2.3 друг против друга. Участок линии наилучшего и использовать уравнение для преобразования качественные данные из проточной цитометрии в количественные единицы.
3. Измерение поглощения жидкости
Рисунок 1: Схема измерения макропиноцитозом высокой пропускной способности. (A) сапротрофные растут на плите SM семенами с K. исследовании бактерий (желтый). Урожай клетки от кормления фронта (оранжевый), избегая клетки, которые уже разработаны (зеленый), в 25 мл КК2 буфера. Вихрь не присоединяться, Пелле центрифугированием 3 мин на 300 x g, затем промыть 3 раза в 50 мл КК2 буфера, отбрасывая супернатант каждый раз. Ресуспензируйте до 1 x 105 клеток/мл в HL5 среднего роста и добавьте 50 мкл в три скважины на сэмпл плиты 96-луночных плоское дно. Инкубируйте на 22 ° C в течение 24 ч. (B) разбавляют TRITC-декстран до 1 мг/мл в HL5 роста среднего от Стоковый раствор 50 мг/мл. Добавьте 50 мкл каждого образца (за исключением 0 мин поглощение контроля скважин) и инкубировать в 22 ° C в течение 1 ч, после которого добавить декстрана в элемент управления поглощение 0 мин. (C) немедленно сцеживаться СМИ, погладить пластину на ткани, чтобы удалить избыток среднего и погружать в ванну ледяной КК2 буфера, заполнение скважины для стирки. Декант буфера и высушите снова. 100 мкл 5 мм азид натрия растворяют в КК2MC для отсоединения клетки. Возьмите потока цитометр для измерения интернализированных флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
-
Настройка плоскодонной 96-луночных культуры ткани пластины (рис. 1A). Использовать клетки, выращенных на бактерии и передать их в HL5 среднего (содержащий 100 мкг/мл dihydrostreptomycin, 100 мкг/мл Ампициллин и канамицин 50 мкг/мл) 24 ч до assay; Это позволяет макропиноцитозом быть upregulated от низких уровней видели в клетках, выращенных на бактерии24. Кроме того разбавляют клетки непосредственно из стерильных культуры, инкубации за 24 ч до assay, чтобы уменьшить ошибки клетки, разбавленным с разной плотностью.
- Урожай клетки от кормления фронта в 25 мл2 КК в 50 мл пластиковых пробирок. Отделить клеток vortexing и Пелле на 300 x g 3 мин. Отменить супернатанта, Ресуспензируйте гранул и мыть 3 раза по 300 x g для 3 мин в 50 мл КК2, отбрасывая супернатант каждый раз, чтобы удалить бактерии.
- Определить плотность клеток (с использованием hemacytometer или другие системы подсчета клеток) и развести в содержащих антибиотики HL5 до 1 x 105 клеток/мл. Пипетка 50 мкл в каждой скважине, используя три скважины для каждого условия. Инкубируйте на 22 ° C в течение 24 ч. не забудьте установить элемент управления поглощение 0 мин.
Примечание: Альтернативного среднего, например SIH, вместо него может использоваться VL6.
-
Тензометрические силоизмерители с TRITC-декстрана (рис. 1B).
- Разбавить декстрана до 1 мг/мл в среде используется (это может быть увеличена до 2,5-5 мг/мл при оценке клетки с очень низкого поглощения). Добавьте 50 мкл для каждой скважины (давая конечная концентрация 0,5 мг/мл TRITC-декстрана) и вернуть 22 ° C в течение 1 ч, пластины, как это позволяет накопления значительных декстрана, но экзоцитоз декстрана еще не начались.
Примечание: пипетки репитер позволяет этот шаг следует сделать более быстро, сократить ошибки.
- Разбавить декстрана до 1 мг/мл в среде используется (это может быть увеличена до 2,5-5 мг/мл при оценке клетки с очень низкого поглощения). Добавьте 50 мкл для каждой скважины (давая конечная концентрация 0,5 мг/мл TRITC-декстрана) и вернуть 22 ° C в течение 1 ч, пластины, как это позволяет накопления значительных декстрана, но экзоцитоз декстрана еще не начались.
-
Подготовка клетки для проточной цитометрии (рис. 1 c).
- Сразу перед стиркой, добавьте 50 мкл декстран содержащих СМИ управления поглощение 0 мин.
- Декант среднего и высушите на ткани. Вымыть, погрузив пластины в ледяной KK-2, а затем декантируют.
Примечание: некоторые штаммы с соблюдением дефекты могут отделяться во время этого шага, например нокаут обоих гомолог Талина (Тала-/ Тальб -)25. Соблюдайте осторожность при работе с линии клетки, которые придают плохо и аспирационная СМИ, если требуется. - Добавьте 100 мкл ледяной 5 мм азид натрия растворяют в КК2MC (КК2 + 2 мм MgSO4 и 100 мкм CaCl2).
Предупреждение: Азид натрия является чрезвычайно токсичным. Используйте пылезащитную маску и защитные очки при работе с порошком. Всегда надевайте перчатки и халате. Избегайте тепла и не смешиваются с кислотой.
Примечание: Клетки быстро отсоединить и экзоцитоз является предотвратить24. Микроскоп может использоваться для проверки.
-
Мера жидкости поглощение проточной цитометрии
- Если планирование для преобразования относительных значений в абсолютной те, используйте шарики для стандартизации потока цитометр параметры (см. раздел 2). Кроме того использование клетки загружен с декстрана в раздел 2 обеспечить, что вперед разброс и стороны точечной установлены надлежащим образом изолировать клетки (рисунок 2A), обеспечение того, что машина не заблокирован, (рис. 2B) и отрегулировать параметры Измерьте внутреннюю флюоресценция (рис. 2 c).
- Прикрепите высок объём выборки системы и добавить пластины. Настройка протокола для измерения флуоресценции (для TRITC-декстран использовать желто зеленый лазер для возбуждения и измерить в 582 канале Нм или аналогичные) из до 65 мкл суспензии клеток, и запустите.
-
Анализировать результаты потока цитометрии
- Ворота на клетки с помощью вперед разброс и стороны точечной (рис. 2A). Рассчитайте средний флуоресценции клеток, используя параметр статистики. Задать эти параметры, с помощью одной пробы и применить для всех образцов.
Примечание: Профили разброс вперед разброс/сторона может варьироваться от образцов при использовании различных мутанты или ингибиторов. - Определите среднее значение трех скважин для каждого условия и вычесть 0 мин поглощение управления. Либо преобразовать в количественных значений с помощью уравнения, определяется в разделе 2 или нормализовать к элементу управления.
- Ворота на клетки с помощью вперед разброс и стороны точечной (рис. 2A). Рассчитайте средний флуоресценции клеток, используя параметр статистики. Задать эти параметры, с помощью одной пробы и применить для всех образцов.
4. выполнение жидкости поглощение время курсы
- Настройка элементов как в раздел 3, с трех скважин для каждой точки время и напряжение/состояние.
- Последовательно добавьте декстрана помечены среднего различных скважин. Типичный курс меры поглощения жидкости на 0, 30, 60, 90, 120 и 180 мин добавить декстран содержащих среднего для 180 мин время точки скважин, позже 60 мин, добавив его к скважинам для точки время 120 мин, и т.д. (рис. 3A).
- В 0 мин, добавьте 50 мкл декстран содержащих среднего и немедленно декантируют и мыть плиты как в раздел 3.3. Проанализируйте, как описано в разделе 3.5.
5. доза ответ кривых
- Настройка ячеек, как описано в разделе 3, с трех скважин для каждого штамма и состояния.
- Ослабить соединения интерес в среде, содержащей 1 мг/мл декстрана в двойной желаемого максимальная конечная концентрация соединения. Подготовьте второй трубка, содержащая средний с декстрана с той же пропорции транспортного средства, как первый. Вихрь смешивать.
- Создайте серию разрежения соединения интереса к 200 мкл декстрана, содержащий среднего на сэмпл (рис. 4A). Вихрь смешивать. Добавьте 50 мкл среды для каждого образца хорошо для 1 h.
- Вымойте и анализировать, как описано в разделе 3.3 года.
6. фагоцитоз и поглощение мембраны
- Для измерения поглощения мембраны, подготовьте клетки, как описано в разделе 3. Добавьте 50 мкл среды, содержащие 20 мкм FM 1-43 для конечной концентрации 10 мкм. После загрузки, мыть и готовить клетки для проточной цитометрии в раздел 3.3. Измерения в 585 нм канале или аналогичные, используя синий лазер для возбуждения.
Примечание: Как мембрана людьми более быстрыми темпами, чем жидкость фазы, 10 мин является более подходящим момент для использования чем 1 h26. Вместо него может использоваться альтернативные красители, которые флуоресцировать только тогда, когда включены в мембрану. -
Использовать дневно помечены бусы или бактерии для измерения фагоцитоза. Флуоресцентный дрожжи не может использоваться, как они неотделимы от сапротрофные путем вперед и стороне разброс24. Настройка ячеек, как описано в разделе 3 и анализировать как описано27.
- Чтобы измерить фагоцитоз бисер добавить желто зеленой маркировкой бусы, как описано в разделе 3.2 до конечной концентрации 5 x 107 шариков/мл (1,75 и 2 мкм) или 1 x 10-8 шариков/мл (1 и 1,5 мкм) за 1 ч до мытья и подготовке для проточной цитометрии как в раздел 3.3. Измерения в 525 Нм канале или аналогичные, используя синий лазер для возбуждения.
Примечание: Более высокие концентрации приведет к ячейке отряд. - Чтобы измерить фагоцитоз бактерий, добавьте Техас-красный помечены Escherichia coli bioparticles, как описано в разделе 3.2 до 1 x 10-8 бактерий/мл за 1 ч до мытья и подготовке для проточной цитометрии в раздел 3.3. Измерения в 610 Нм канале или аналогичные, используя желто зеленый лазер для возбуждения.
- Чтобы измерить фагоцитоз бисер добавить желто зеленой маркировкой бусы, как описано в разделе 3.2 до конечной концентрации 5 x 107 шариков/мл (1,75 и 2 мкм) или 1 x 10-8 шариков/мл (1 и 1,5 мкм) за 1 ч до мытья и подготовке для проточной цитометрии как в раздел 3.3. Измерения в 525 Нм канале или аналогичные, используя синий лазер для возбуждения.
Representative Results
После того, как техника была выполнена и клетки загружен с декстрана и готовы для анализа (рис. 1), убедитесь, что проточный цитометр не заблокирован и настроить профиль разброс вперед разброс/стороне, выглядеть, как показано на рисунке 2Аклетки. Если компьютер заблокирован, он будет выглядеть более как это показано на Рисунок 2B и должны быть разблокированы, прежде чем продолжить. Обеспечение параметров Показать управления стерильных клетки имеют высокую внутреннюю декстрана флуоресценции на длиннее время точек и низким внутренним флуоресцирования на коротких (рис. 2 c).
При поиске различия между мутантов, вполне вероятно, что будет одним из трех фенотипов. Мутанты могут иметь нормальное потребление жидкости, они могли бы частично дефект или поглощения жидкости может быть полностью отменена. 2D рисунок показывает штамма с обычной жидкости поглощения, в этом случае стандарт лаборатории штамм Ax2, мутант с ~ 50% уменьшение поглощения жидкости (Ax2 rasG-14) и один с отменили поглощения жидкости (Ax3 gefB-28). Получить средний средний поглощения жидкости (раздел 3.5) и использовать его для вычисления объема жидкости, интернализации (как показано на рисунке 3B) или сравнить данные в элемент управления (как показано на рисунке 4В и 4 C).
При выполнении жидкости поглощение время курс, как показано на рисунке 3A, интернализованные флуоресценции следует увеличить на 60-90 мин, после чего декстрана начинает быть exocytosed и плато достигается (рис. 3B). Использование 60 мин в качестве точки стандартное время, при сравнении макропиноцитозом в разных мутантов/условиях поэтому позволяет хороший сигнал быть достигнуто, и сигнал не теряется вследствие экзоцитоз. Мутанты, где серьезно затруднен экзоцитоз может занять больше времени для достижения плато29.
При лечении клетки с ингибиторов, которые являются эффективными против макропиноцитозом в сапротрофные (комплект вверх как Рисунок 4A), декстрана, внедрено в 1 h будет идти вниз почти ничего на более высокие концентрации ингибитора в большинстве случаев (Рис. 4В). Некоторые ингибиторы не может быть эффективным на 100%, однако, например Нокодазол только тормозит до 50% поглощения жидкости на макропиноцитозом при добавлении остро (рис. 4 c). Если ингибиторы не являются эффективными, клетки будет усвоить подобные количество декстрана как элемент управления, и снижение в флуоресцировании не будет рассматриваться. Эта техника позволяет большой спектр различных ингибиторов и концентрации ингибитора проверяться для воздействия на поглощения жидкости на макропиноцитозом очень быстро, сокращение времени, затрачиваемого оптимизация лечение ингибитором.
Рисунок 2: Настройка потока цитометр и представитель данных. (A) вперед точечной (FSC) и стороны точечной (SSC) профили клеток должны быть установлены таким образом клетки легко отличить. Показан пример того, как должен выглядеть Ax2 клетки. (B) Если проточный цитометр заблокирован, как в этом примере, клетки имеют разброс очень низкой стороне. Лазер не будет волновать флуорофоров должным образом и машина должна быть разблокированы перед продолжением. Любые данные, полученные в то время как машина была заблокирована должны быть отброшены. (C) флюоресценция должны устанавливаться таким образом, чтобы образец 0 мин поглощение низкой флуоресценции, который увеличивает когда клетки были инкубировали для больше в флуоресцентные среде, как показано в этом примере, взяты из Уильямс и Кей 201824. (D) примеры клеток, которые были инкубировали с TRITC декстран за 1 час с нормальной макропиноцитозом (Ax2, зеленый), снижение макропиноцитозом (Ax2 rasG -, HM172614, оранжевый) и отменил макропиноцитозом (Ax3, gefB- HM177628, синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: выполнение жидкости поглощение время курсы в 96-луночных пластины. (A) декстран следует добавить к каждому набору образцов последовательно, с тем же временем окончания. Затем промыть лунки, отсоединить и измерить внутреннюю флуоресценции проточной цитометрии. Здесь показан пример раз для добавления декстрана. (B) жидкости поглощение время курс Ax2 клеток выступал в 96-луночных пластины. Взятые из Уильямс и Кей 201824, погрешностей показывают стандартная ошибка трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: жидкости поглощения дозы ответ кривых. (A) добавить соединение интерес, это ингибитор LY294002, случай PI3K с HL5 содержащие 1 мг/мл TRITC-декстрана в двойной желаемого окончательный максимальная концентрация. Смешать с HL5 роста среднего + декстрана 1 мг/мл, содержащие только в различных пропорциях для создания разрежения серии 200 мкл среднего за состояние транспортного средства. Добавьте скважин как обычно за 1 ч до мытья и измерения интернализированных флуоресценции. (B) кривой отклика дозы поглощения жидкости для Ax2 клетки инкубировали с LY294002-содержащих среднего от A. Адаптировано из Уильямс и Кей 201824. Жидкости поглощение нормируется для необработанных элемента управления. Планки погрешностей показывают стандартная ошибка трех независимых экспериментов. (C) кривой отклика дозы поглощения жидкости для Ax2 клетки инкубировали с Нокодазол. Адаптировано из Уильямс и Кей 201824. Жидкости поглощение нормируется для необработанных элемента управления. Планки погрешностей показывают стандартная ошибка трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
В то время как другие методы для оценки поглощения жидкости являются низкая пропускная способность, мытья клетки в situ и использования азид натрия для отсоединения клетки являются важнейшие шаги в этом методе, которые позволяют высок объём измерения макропиноцитозом, мембрана поглощения, или фагоцитоз, сапротрофные. Как клетки прикреплены к поверхности и среднего нет, их можно слева прилагается в то время как средний вокруг них впервые сбросили и затем изменено путем погружения в буфере и сбросили снова. Азид натрия, который истощает сотовой АТФ и depolarizes мембрана30, затем используется для отсоединения клетки, а также предотвращает экзоцитоз не затрагивая жизнеспособность клеток24.
Хотя с помощью проточной цитометрии для измерения макропиноцитозом, сапротрофные дает очень точные измерения поглощения жидкости очень быстро, чтобы установить причину, почему конкретного штамма или условие изменило поглощения жидкости, дальнейшее расследование с помощью микроскопия-требуется24. Следует также отметить что в некоторых случаях, ранее опубликованные результаты показали разницу в жидкости поглощение мутантных штаммов, выращенных на поверхности (как в данном случае), или в тряску подвеска (как и стандартный протокол)31. С помощью этого метода может означать, что в редких случаях, пропустил очевидной поглощения жидкости дефектов. Кроме того при измерении фагоцитоза, может использоваться только в низкой концентрации частиц. Максимальная скорость фагоцитоза, который может быть определен с этой техникой является намного ниже реальной максимум, хотя это все еще возможно измерить соответствующие различия между штаммов и условия24в фагоцитозе. Чтобы определить максимальную скорость фагоцитоза, поглощение должна быть измерена в тряску подвеска альтернативный протокол27. Клетки, которые phagocytosed бусины увеличились разброс стороне, так что это должно быть исправлено для соответственно при настройке проточный цитометр.
Проточной цитометрии могут быть использованы для измерения поглощения жидкости в клетках млекопитающих32, однако большее количество жидкости этапа поглощения, другие endocytic пути, чем видели в сапротрофные является проблемой. Кроме того клетки обычно отсоединяются с помощью трипсина при 37 ° C, позволяя далее endocytic прогрессирования интернализированных декстрана. Азид натрия ледяной не вызывают макрофагов отсоединить от поверхности (Уильямс, неопубликованные наблюдения), что делает этот метод не применяется к mammalian клеток без дальнейшей оптимизации.
Высокая пропускная способность измерения макропиноцитозом имеет потенциал, чтобы быть использованы для экрана быстро и дешево для эффекты ингибиторов, генетические мутации или нокдаун гена на сапротрофные клетки. Мутанты всегда должны сравниваться только их прямых родителей. Если читатель не ранее предпочтение сапротрофные деформации, не стерильных штаммов DdB или НС4 более «дикого» чем стерильных и можно манипулировать так же эффективно, как стерильных штаммов33. В противном случае, Ax2 штаммы являются стерильных штаммы с наименьшим генома дублирования34, в то время как многие штаммы Ax4 Талина A нокауты и следует по возможности избегать23. Наиболее ранее опубликованные штаммов можно заказать центр фондовая Dicty35.
Этот метод позволяет более следственных возможностей, чем было возможно ранее в отношении последствий различных условий, ингибиторы и мутации на макропиноцитозом по сапротрофные.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Мы благодарим Совет медицинских исследований Великобритании для основного финансирования (U105115237) для RRK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | - | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
| TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
| HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
| Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
| Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
| Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Sodium azide | VWR | 103694M | |
| Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
| Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
| Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
| Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
| Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
| FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
| Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
| Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
| SM agar | Formedium | SMACFG | |
| 0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
| Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
| 5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |
References
- Bloomfield, G., Kay, R. R.
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).
- Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell. 93 (5), 815-826 (1998).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).
- Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).
- Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells. European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).
- Buczynski, G., et al. Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization. Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).
- Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).
- Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells. Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).
- Clark, J., et al. Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling. The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).
- Hoeller, O., et al. Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis. Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).
- Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. Elife. 5, e20085 (2016).
- West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation. Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium. Traffic. 3, 791-800 (2002).
- Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
- Rivero, F., Maniak, M. Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway. Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).
- Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis. Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).
- Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment. Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).
- Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
- Tsujioka, M., et al. Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium. Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).
- Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S.
- Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation. Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).
- Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development. Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).
- Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin. Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).
- van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential. Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).
- Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis. Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).
- Mercer, J., Helenius, A. Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells. Science. 320 (5875), 531-535 (2008).
- Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).
- Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).
- Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012. Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).
