Macropinocytosis, store uspesifisert væske opptak, er viktig i mange områder av klinisk biologi inkludert immunologi, infeksjon, kreft og nevrodegenerative sykdommer. Her, er eksisterende teknikkene tilpasset tillate høy gjennomstrømning og encellede oppløsning måling av macropinocytosis i macropinocytosis modell organisme Dictyostelium discoideum hjelp flow cytometri.
Store uspesifisert væske opptak av macropinocytosis er viktig for spredning av enkelte kreftceller, antigen prøvetaking, verten celle invasjon og spredning av nevrodegenerative sykdommer. De brukte Laboratorium stammene av amoeba Dictyostelium discoideum har ekstremt høy væske opptak priser når dyrket i nærings medium, over 90% som skyldes macropinocytosis. I tillegg finnes mange av de kjente komponentene av pattedyr macropinocytosis også, gjør det en utmerket modellsystem for å studere macropinocytosis. Her er standard teknikken å måle internalisert væske med fluorescerende dekstran som en etikett tilpasset en 96-brønns plate format, med eksemplene analysert av flowcytometri med en høy gjennomstrømming prøvetaking (HTS) vedlegg.
Celler fôres ikke-quenchable fluorescerende dekstran med en forhåndsbestemt tid, vasket av nedsenking i iskalde buffer og frittliggende bruker 5 mM Natriumazid, som også stopper exocytosis. Celler i hver brønn er deretter analysert av flowcytometri. Metoden kan også tilpasses til å måle membran opptak og fagocytose fluorescerende perler eller bakterier.
Denne metoden ble utviklet for å tillate måling av væske opptak av Dictyostelium på en høy gjennomstrømming, arbeid og ressurs effektiv måte. Det tillater samtidig sammenligning av flere stammer (f.eks knockout mutanter med et) (f.eks celler i ulike medier eller behandlet med ulike konsentrasjoner av hemmer) parallelt og forenkler tid-kurs.
Store uspesifisert væske opptak av macropinocytosis er viktig i flere biologiske sammenhenger1, inkludert antigen prøvetaking av immunsystemet cellene2, patogen inn i verten cellene3, kreft celle spredning4 og spredning av prion sykdommer5. I pattedyr og Dictyostelium celler, begrepsordbok6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (selv om lipid nøyaktig hva er forskjellig mellom de to11), aktivert RAS12,13og aktivert Rac14,15 er viktige for effektiv væske opptak av macropinocytosis, selv om det fortsatt er mange ubesvarte spørsmål om hvordan macropinocytic oppdateringen er dannet, organisert og til slutt internalisert. Oppdage flere proteiner viktig for macropinocytosis og påfølgende fastsetting av hvordan de er viktige i ulike biologiske sammenhenger, vil gi en mer omfattende forståelse av macropinocytosis og tillate utviklingen av målrettet behandling for en rekke forhold.
Dictyostelium er en ideell modellsystem for å studere macropinocytosis. Det høye nivået av grunnleggende macropinocytosis i standard laboratorium stammer betyr at væske opptak er over 90% på grunn av macropinocytosis6. Dette gjør at macropinocytosis skal måles av bestemme væske opptak, i motsetning til pattedyrceller der væske opptak på grunn av macropinocytosis er mye lavere. Som macropinocytosis er så godt definert og lett visualisert12 i dette systemet tilbyr klare fordeler for å undersøke kjernen bevarte komponenter i macropinosome over andre systemer der det kan være flere regulatoriske signaler 16 , 17.
Standard teknikken brukes til å måle macropinocytosis av pattedyrceller innebærer feste cellene etter pulserende med dekstran for en kort periode etterfulgt av mikroskopi å avgjøre området for en celle som er okkupert av dekstran-positive blemmer18. Denne teknikken høyde ikke men for at macropinosomes reduseres ved å skrive inn cellen, som har blitt rapportert i Dictyostelium19, og bare tar hensyn enkelt fly i cellen, betyr volumet internalisert er uklart. En alternativ teknikk, av opptellingen antallet av macropinosomes internalisert i en gitt tid, har de samme downsides20. Bruke Dictyostelium unngår disse spørsmålene; men er eksisterende teknikker for måling av væske opptak av Dictyostelium relativt arbeidsintensiv, bruker en stor mengde både celler og dekstran21. Celler er rystet på høy tetthet i fluorescerende dekstran og prøver fjernet på ulike tidspunkt for fastsettelse av internalisert fluorescens ved hjelp av en fluorimeter. Celler som er forberedt på denne måten kan analyseres av flowcytometri å få enkelt celle, i stedet for populasjon-nivå, oppløsning22, selv om dette fortsatt lav gjennomstrømming.
Her er standard teknikken å måle internalisert væske med fluorescerende dekstran som en etikett tilpasset en 96-brønns plate format, med eksemplene analysert av flowcytometri med en høy gjennomstrømming prøvetaking (HTS) vedlegg. Celler fôres ikke-quenchable fluorescerende dekstran med en forhåndsbestemt tid, vasket av nedsenking i iskalde buffer og frittliggende bruker 5 mM Natriumazid, som også stopper exocytosis. Celler i hver brønn er deretter analysert av flowcytometri. Denne metoden ble utviklet for å overvinne begrensningene til metodene ovenfor og tillate samtidig sammenligning av væske opptaket av store antall stammer/forhold mens bruker færre ressurser og redusere arbeidskraft involvert.
Mens andre metoder for å vurdere væske opptak er lav overføringshastighet, vasking av celler i situ og bruk av Natriumazid koble celler er kritisk trinnene i denne metoden, som gir høy gjennomstrømming-måling av macropinocytosis, membran opptak, eller fagocytose av Dictyostelium. Som cellene er koblet til en overflate og mediet er ikke, kan de venstre knyttet mens mediet rundt dem er først kastet av og deretter endres ved nedsenkning i bufferen og kastet ut igjen. Natriumazid, som reduserer mobilnettet ATP og depolarizes membran30, brukes deretter koble cellene, og forhindrer også exocytosis uten å påvirke celle levedyktighet24.
Mens bruker flowcytometri til å måle macropinocytosis av Dictyostelium gir en svært nøyaktig måling av væske opptak svært raskt for å etablere grunnen til hvorfor en bestemt stamme eller tilstand har endret væske opptak, videre etterforskning bruker mikroskopi er nødvendig24. Det bør også bemerkes at tidligere publiserte resultatene har, i noen tilfeller vises en forskjell i væske opptak av mutant stammer vokst enten på en overflate (som i dette tilfellet), eller i risting suspensjon (som standard protokoll)31. Denne metoden kan bety, i sjeldne tilfeller, tilsynelatende flytende opptak defekter er savnet. I tillegg når du måler fagocytose, kan bare lave konsentrasjoner av partikler brukes. Den maksimale hastigheten på fagocytose som kan fastslås med denne teknikken er langt under det virkelige maksimalt, men det er fortsatt mulig å måle relevante forskjeller i fagocytose mellom stammer og betingelser24. For å bestemme den maksimale hastigheten på fagocytose, må opptak måles i risting suspensjon av en alternativ protokollen27. Celler som har phagocytosed perler har økt siden scatter, så dette bør korrigeres tilsvarende når flyt-cytometer.
Flowcytometri kan brukes til å måle væske opptak i pattedyrceller32, men høyere andelen væske fase opptak av andre endocytic veier enn sett i Dictyostelium er en bekymring. I tillegg er cellene vanligvis koblet med trypsin på 37 ° C, slik endocytic progresjon av internalisert dekstran. Iskald Natriumazid medfører ikke makrofager koble fra en overflate (Williams, upublisert observasjon), gjør denne teknikken ikke gjelder pattedyrceller uten ytterligere optimalisering.
Høy gjennomstrømning måling av macropinocytosis har potensial til å bli brukt til skjermen raskt og billig for virkningene av hemmere, genetisk mutasjon eller genet knockdown på Dictyostelium celler. Mutanter bør alltid være i forhold til deres direkte foreldre bare. Hvis leseren har ingen tidligere innstilling for Dictyostelium belastning, ikke-axenic belastninger DdB eller NC4 er mer “wild-type” enn axenic og kan manipuleres så effektivt som axenic stammer33. Ellers Ax2 stammer er den axenic stammer med den færrest genomet duplikasjoner34, mens mange stammer av Ax4 Talin A fortrenging og bør unngås hvis mulig23. Mest tidligere publiserte stammer kan bestilles fra Dicty lager Center35.
Denne teknikken tillater større undersøkende muligheter enn tidligere mulig på virkningene av ulike forhold, hemmere og mutasjoner på macropinocytosis av Dictyostelium.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Medisinsk Forskningsråd UK for kjernen midler (U105115237) til RRK.
LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | – | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
Sodium azide | VWR | 103694M | |
Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
SM agar | Formedium | SMACFG | |
0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |