Macropinocytosis, storskaliga ospecifika vätska upptag, är viktigt i många områden av klinisk biologi inklusive immunologi, infektion, cancer och neurodegenerativa sjukdomar. Här, har befintliga tekniker anpassats så att hög genomströmning, encelliga upplösning mätning av macropinocytosis i macropinocytosis modell organism Dictyostelium discoideum med flödescytometri.
Storskaliga ospecifika vätska upptag av macropinocytosis är viktigt för spridningen av vissa cancerceller, antigen provtagning, värd cell invasion och spridningen av neurodegenerativa sjukdomar. De vanliga laboratorie stammarna av amöban Dictyostelium discoideum har extremt hög vätska upptag priser när den odlas i näringsmedium, över 90% som beror på macropinocytosis. Dessutom är många av de kända centrala delarna av däggdjur macropinocytosis också närvarande, vilket gör det en utmärkt modellsystem för att studera macropinocytosis. Här är standard tekniken att mäta internaliserade vätska med fluorescerande dextran som en etikett anpassade till ett format som plattan med 96 brunnar, med prover analyseras med flödescytometri med en hög genomströmning provtagning (HTS) bifogad fil.
Celler matas icke-quenchable fluorescerande dextran under en förutbestämd tid, tvättade av nedsänkning i iskall buffert och fristående med 5 mM natriumazid, som också stannar exocytos. Celler i varje brunn analyseras sedan av flödescytometri. Metoden kan även anpassas till mäta membran upptag och fagocytos av fluorescerande pärlor eller bakterier.
Denna metod var avsedd att möjliggöra mätning av flytande upptag av Dictyostelium på en hög genomströmning, arbetskraft och resurs effektivt sätt. Det tillåter samtidiga jämförelse av flera stammar (e.g. knockout mutanter av en gen) och villkor (t.ex. celler i olika medier eller behandlats med olika koncentrationer av hämmare) parallellt och förenklar tid-kurser.
Storskaliga ospecifika vätska upptag av macropinocytosis är viktigt i flera biologiska sammanhang1, inklusive antigen provtagning av immun cellerna2, patogen trätt i värd celler3, cancer cell spridning4 och spridning av prion sjukdomar5. I däggdjurs- och Dictyostelium celler, aktin6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (även om den exakta innebörden av lipid skiljer sig mellan de två11), aktiverad Ras12,13och aktiverade Rac14,15 är viktiga för effektiv vätska upptag av macropinocytosis, även om det fortfarande finns många obesvarade frågor om hur macropinocytic plåstret är bildade, organiserad och så småningom internaliserade. Upptäcka mer proteiner viktiga för macropinocytosis och efterföljande bestämning av hur de är viktiga i de olika biologiska sammanhang, kommer att ge en mer omfattande förståelse av macropinocytosis och potentiellt möjliggöra utveckling av riktade behandlingar för en rad villkor.
Dictyostelium är en idealisk modellsystem för att studera macropinocytosis. Den höga nivån på konstituerande macropinocytosis i standard laboratorie stammar innebär att vätska upptaget är över 90% på grund av macropinocytosis6. Detta tillåter macropinocytosis skall mätas enbart genom att bestämma vätska upptag, till skillnad från däggdjursceller där andelen vätska upptag på grund av macropinocytosis är mycket lägre. Som macropinocytosis är så väl definierad och enkelt visualiseras12 i detta system på samma sätt erbjuder tydliga fördelar för att utreda kärnkomponenter bevarat av macropinosome framför andra system där det kan finnas flera regulatoriska signaler 16 , 17.
Standard tekniken används för att mäta macropinocytosis av däggdjursceller innebär fastställande celler efter pulserande med dextran under en kort tid följt av mikroskopi att bestämma området för en cell som upptas av dextran-positiv blåsor18. Denna teknik tar emellertid inte hänsyn till möjligheten att macropinosomes krymper när man kommer in i cellen, vilket har rapporterats i Dictyostelium19, och tar bara hänsyn till enda flygplan i cellen, vilket innebär att volymen internaliserat är oklart. En alternativ teknik, för att räkna antalet macropinosomes internaliseras i en given tid, har samma nackdelar20. Med Dictyostelium undviker dessa problem. befintliga tekniker för att mäta vätska upptag av Dictyostelium är dock relativt arbetsintensivt, använder en stor mängd både celler och dextran21. Celler är skakat på hög densitet i fluorescerande dextran och prover tas bort vid olika tidpunkter för bestämning av internaliserade fluorescensen använder en fluorimeter. Celler som förberett detta sätt kan analyseras med flödescytometri att få enstaka cell, i stället för befolkningen nivå, resolution22, även om detta fortfarande är låg genomströmning.
Här är standard tekniken att mäta internaliserade vätska med fluorescerande dextran som en etikett anpassade till ett format som plattan med 96 brunnar, med prover analyseras med flödescytometri med en hög genomströmning provtagning (HTS) bifogad fil. Celler matas icke-quenchable fluorescerande dextran under en förutbestämd tid, tvättade av nedsänkning i iskall buffert och fristående med 5 mM natriumazid, som också stannar exocytos. Celler i varje brunn analyseras sedan av flödescytometri. Denna metod var avsedd att övervinna begränsningarna av ovanstående metoder och tillåta simultana jämförelse av vätska upptaget av ett stort antal stammar/villkor samtidigt som använder mindre resurser och minskar arbetskraft som är inblandade.
Andra metoder att bedöma vätska upptag är låg genomströmning, tvättning av celler i situ och användning av natriumazid att lossa cellerna är de kritiska steg i denna metod, som tillåter hög genomströmning mätning av macropinocytosis, membran upptag, eller fagocytos av Dictyostelium. Eftersom cellerna är kopplade till en yta och mediet är inte, kan de vänster fäst medan medium runt dem är först kastat och sedan ändras genom nedsänkning i buffert och kastat igen. Natriumazid, som utarmar cellulär ATP och depolarizes membran30, sedan används för att lossa cellerna och förhindrar även exocytos påverkar cellen livskraft24.
Samtidigt med flödescytometri för att mäta macropinocytosis av Dictyostelium ger en mycket exakt mätning av flytande upptag mycket snabbt, för att fastställa anledningen till varför en viss stam eller tillstånd har förändrat vätska upptag, ytterligare utredning med mikroskopi är krävs24. Det bör också noteras att tidigare publicerade resultat, i vissa fall visat en skillnad i vätska upptag av muterade stammar odlas på en yta (som i detta fall), eller i skakar suspension (som i standardprotokollet)31. Med denna metod kan innebära att, i sällsynta fall uppenbar vätska upptag defekter missas. Dessutom, vid mätning av fagocytos, kan endast låga koncentrationer av partiklar användas. Den maximala procentsatsen för fagocytos som kan bestämmas med denna teknik ligger långt under det verkliga högst, men det är fortfarande möjligt att mäta relevanta skillnader i fagocytos mellan stammar och villkor24. För att bestämma den maximala procentsatsen för fagocytos, måste upptag mätas i skakar suspension av en alternativa protokoll27. Celler som har fagocyteras pärlor har ökat side scatter, så detta bör korrigeras för med detta när du ställer in flödescytometer.
Flödescytometri kan användas för att mäta vätska upptag i däggdjursceller32, men den större andelen vätska fas upptag av andra endocytic vägar än sett i Dictyostelium är ett bekymmer. Celler är dessutom vanligtvis fristående använder trypsin vid 37 ° C, möjliggör ytterligare endocytic progression av internaliserade dextran. Iskall natriumazid orsakar inte makrofager kopplas loss från en yta (Williams, opublicerade observation), att göra denna teknik inte tillämpliga på däggdjursceller utan ytterligare optimering.
Hög genomströmning mätning av macropinocytosis har potential att användas till skärmen snabbt och billigt för effekterna av hämmare, genetisk mutation eller gen knockdown på Dictyostelium celler. Mutanter bör alltid jämföras direkt överordnade endast. Om läsaren har ingen tidigare preferens för Dictyostelium stam, icke-axenic stammar såsom DdB eller NC4 är mer ”wild-type” än axenic och kan manipuleras så effektivt som axenic stammar33. Annars Ax2 stammar är den axenic stammar med den minsta genomet dubletter34, medan många stammar av Ax4 Talin A knockouts och bör undvikas om möjligt23. Den tidigare publicerade stammar kan beställas från Dicty lager Center35.
Denna teknik tillåter större undersökande möjligheter än tidigare möjligt om effekterna av olika förhållanden, -hämmare och mutationer på macropinocytosis av Dictyostelium.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Medicinska forskningsrådet UK för grundfinansiering (U105115237) till RRK.
LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | – | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
Sodium azide | VWR | 103694M | |
Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
SM agar | Formedium | SMACFG | |
0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |